筛选细胞株的方法
稳定细胞株筛选
稳定株构建 FAQ转自微博思路迪慢病毒包装1，什么是瞬时转染和稳定转染？答：瞬时转染：顾名思义，外源片段的表达时间短暂。
这主要是因为外源导入的裸露的载体整合入基因组的几率非常低，所以以染色体外(episomal)形式存在，不能随细胞分裂而一同复制导致最后拷贝数被稀释导致的。
而且考虑到细胞分裂会稀释质粒的量，所以起初转染的质粒拷贝数极高。
这就导致瞬时转染呈现一个高拷贝到低拷贝迅速降低的过程，且无法在这个系统上实现可诱导表达。
稳定转染：是相对瞬时转染而言，进入细胞的质粒整合入细胞基因组中，并能随细胞分裂稳定传递下去。
在这个系统中，质粒表达稳定，拷贝数低，且能实现诱导表达。
稳定转染并不是一种与瞬时转染不同的方法，只是对瞬时转染的细胞进行筛选，得到稳定整合的细胞株。
稳定整合的几率因基因传递的方法而异，跨度可以从10-8到10-1。
因此，对于有的转染方法，比如化学试剂介导的转染，其整合几乎可以忽略不计。
质粒载体整合的位点并不是完全随机分布，依据不同的基因传递方法，呈现不同的靶向倾向性，所以是一种半随机整合。
不同基因传递方法对质粒稳定表达的影响见表XXXX。
2，设计稳定株构建实验需要考虑的因素有哪些？∙答：稳定整合试验中需要考虑的几个关键因素有：∙1)，外源插入片段的拷贝数。
多数情况下，低拷贝甚至是单拷贝可以减少人为实验因素的干扰。
∙2)，整合的几率，这不仅决定了稳定株筛选的难易程度，而且还可以帮助人们更容易得到混合稳定株。
∙3)，整合位点的转录活跃度，决定了稳定株中外源片段的表达质量。
最理想的状况是单拷贝，但转录活性比较高。
∙4)，整合后的稳定性。
不同的整合位点决定了外源片段在染色体中的稳定性，有些区域易发生重组或者丢失，从而导致稳定株再次丢失的情况。
∙5)，最好使用混合稳定株或者获得多个不同单克隆稳定株。
因为稳定整合往往伴随这插入失活宿主内源基因，所以实验时通过使用混合稳定株，或者对多个单克隆稳定株进行比较，可以帮助研究人员获得更精确的实验数据。
稳定细胞株筛选药物浓度确定方法
稳定细胞株筛选药物浓度确定方法
在使用G418、潮霉素B或嘌呤霉素筛选稳定细胞系细胞之前，需要先通过梯度实验确定适合该类细胞的最佳药物浓度。
对于一些常见的细胞系，通常可以在资料中找到推荐的药物浓度。
例如Hela细胞用400 μg/ml的G41或1 μg/ml的嘌呤霉素进行稳定细胞株筛选。
用G418或潮霉素B，选用在5天左右出现细胞大批死亡，2周全部死亡的浓度作为筛选浓度。
对于嘌呤霉素,通常采用在3-4天杀死全部细胞的浓度。
不同批次的药物活性有一定差异。
因此在使用新批次药物时，需要重新测定最佳浓度。
筛选抗生素的推荐使用浓度（μg/ml）
抗生素工作范围筛选浓度维持用量
G418 50-800 400-500 100
Hygromycin 50-800 200 100
Puromycin 0.25-2 0.5-10 0.25
1、在加入筛选药物前一天将细胞以50%密度接种到6孔板。
第二天在培养基中按G418(0,50,1000,200,400,800μg/ml)或者嘌呤霉素（0,1,2.5,5,7.5,10μg/ml）加入。
2、用G418筛选处理5-10天。
每2天观察细胞一次。
每4天跟换新的有抗生素的培养基（如果有必要可以更换得更勤）。
直到得到最佳浓度。
3、用嘌呤霉素处理4-7天。
每2天跟换新的有抗生素的培养基。
耐药细胞株的筛选
耐药细胞株的筛选
一种是脂质体转染后，单克隆筛选稳定细胞株。
另外一种是应用逆转录病毒，慢病毒转染，筛选稳定细胞株。
脂质体转染：在转染24小时后，消化XXX细胞并计数。
将细胞种到96孔板，保证每个孔2-3个细胞，这样才能得到单克隆。
待细胞贴壁后，加入抗生素筛选。
筛选时间和浓度视细胞而定。
一般G418（Geneticin,遗传霉素）作用一个星期，嘌呤霉素作用2-3天。
脂质体法筛单克隆时间较长，且效率低，大概只有1%。
慢病毒转染：先要用包装细胞，一般为293细胞，包装出病毒，再用病毒转染目的细胞。
包装病毒视不同类型的病毒而定，一般要3-5天的时间。
包装好的病毒要测滴度，根据滴度决定转染目的细胞的病毒量。
转染目的细胞1-2天后加抗生素筛选得到稳定细胞株。
第八章——植物细胞培养
4、PH和二氧化碳浓度
在悬浮培养时，PH变动相当大。加入EDTA使铁和其他金属离 子长期处于可利用状态。硝态氮和铵态氮之间进行调整可作 为稳定PH的一种方法。
二氧化碳对细胞培养没有太大影响，但在低密度细胞培养中， 二氧化碳对于诱导细胞分裂可能有重要作用。
植物细胞生长和活力的测定
一、悬浮培养中细胞生长的测定 1、细胞计数：把1份培养液加入到2份8%三氯化铬溶液中，在 70℃下加热2-15分钟，然后将混合物冷却，用力震荡10分钟，用 血球计数板进行细胞计数。 2、细胞总体积：将已知体积的均匀分散的悬浮液放入1个15ml刻 度离心管中，在2000g下离心5min，得到细胞沉积的体积。 细胞密实体积（PCV）：以每ml培养液中细胞总体积的ml数表示。
第八章-植物细胞培养
植物细胞培养简介
• 概念： 在培养基中培养彼此分离的细胞、使之生长、 增殖或分化。 包括固体培养和液体培养2种形式。
固体培养(solid culture)
• 在固体培养基中培养细胞=静止培养。细胞被固定、 不能移动；单细胞分裂后形成细胞团。
优缺点: 1）所得到的各个细胞团均为单细胞形成，遗传成分和 生理特性具有一致性； 2）细胞生长速度较慢； 3）不能长期、连续、大规模培养细胞。
烟草细胞接种密度和植板率
影响植板率的因素
(4) 培养基成分：用营养成分丰富的培养基或条 件化培养基，植板率高。 (5) 培养方式：采用看护培养（nurse culture） 是可以提高植板率。 平板培养是分离、筛选单细胞无性系的有效方法
看护培养（nurse culture）
植物细胞大规模培养生产次生代谢物质
如某个或某种类型的植物细胞是怎样生长、分裂和分化 的？化学物质（激素等）或者物理因素（重力、压力）等是 怎样影响这些过程的？
高表达抗PD-1抗体CHO细胞株的筛选及代谢分析
高表达抗PD-1抗体CHO细胞株的筛选及代谢分析梅文枫;朱一平;尹帮旗;许晓刚;方树彬【摘要】目的筛选高表达抗PD-1抗体的工程细胞株和较优的基础及补料培养基,并进行代谢分析. 方法分别在TPP摇管、摇瓶中通过流加培养的方式,从6株细胞株和5种商业培养基中筛选高表达抗PD-1抗体的GS-CHO细胞株和较优的基础及补料培养基.在流加培养过程中,检测葡萄糖、谷氨酰胺、谷氨酸、乳酸及氨等的浓度变化.同时为分析限制性营养因素,进一步对乳酸、氨及氨基酸代谢进行分析. 结果通过TPP摇管初步筛选,显示122和126两株细胞在HyCellCHO培养基中表现最好,表达量分别为1.945和1.989 g/L;在摇瓶中进一步验证显示122细胞在6株细胞中的最大活细胞密度图最高,达2.21×107 cells/mL,表达量＞2 g/L.代谢分析发现,乳酸代谢切换和谷氨酸及丙氨酸代谢相关.氨基酸分析发现,蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸等必需氨基酸可能为122细胞株生长和(或)表达限制性成分. 结论筛选出高表达抗PD-1抗体的细胞株和较优培养基,同时代谢分析和氨基酸分析为后续细胞培养工艺开发及个性化培养基优化提供理性指导.【期刊名称】《福建医科大学学报》【年(卷),期】2018(052)005【总页数】8页(P320-327)【关键词】GS-CHO细胞;培养基;细胞计数;代谢【作者】梅文枫;朱一平;尹帮旗;许晓刚;方树彬【作者单位】福建医科大学免疫治疗研究所,福州350122;福建医科大学免疫治疗研究所,福州350122;福建医科大学免疫治疗研究所,福州350122;福建医科大学免疫治疗研究所,福州350122;福建医科大学免疫治疗研究所,福州350122【正文语种】中文【中图分类】R329.24;R341;R977.6程序性死亡蛋白1(programmed death 1，PD-1)信号通路成为肿瘤免疫治疗的热点之一，肿瘤细胞表面的程序性死亡配体1(programmed death ligand 1，PD-L1)通过与PD-1的结合抑制了肿瘤特异性CD8+T细胞的免疫活性，介导了免疫逃逸，抗PD-1/抗PD-L1抗体通过阻断负性免疫调节信号，阻断免疫逃逸而杀伤肿瘤[1]。
G418筛选稳定表达细胞株精要总结
G418筛选稳定表达细胞系总结一分析转化的功能和表达需要DNA稳定转染至宿主细胞染色体。
外源基因进入细胞后，部分能够通过细胞质进入细胞核内，根据细胞类型，至多80％的进入核内的外源DNA得到瞬时表达。
极少数情况下，进入细胞的外源DNA通过系列非同源性分子间重组核连接，形成巨大的***结构最终整合进细胞染色体。
细胞基因组自由部分表达，所以整合并不一定意味着表达，只有整合到表达区的基因才会表达，而且整合到不同的染色体区段的外源基因的表达的量也是不同的。
由于摄取、整合、表达外源基因是小概率事件，通常根据新表型筛选稳定转染体。
一般情况下这种新表型由共转染的编码抗生素抗性基因提供。
细菌Tn5转座子序列（neo抗性基因）携带的氨基糖苷磷酸转移酶可以将G418转变成无毒形式。
G418是一种氨基糖类抗生素，其结构与新霉素、庆大霉素、卡那霉素相似，它通过影响80S核糖体功能而阻断蛋白质合成,对原核和真核等细胞都有毒性 ,包括细菌、酵母、植物和哺乳动物细胞 ,也包括原生动物和蠕虫。
是稳定转染最常用的选择试剂。
当neo基因被整合进真核细胞基因组合适的地方后 ,则能启动neo基因编码的序列转录为mRNA,从而获得抗性产物氨基糖苷磷酸转移酶的高效表达 ,使细胞获得抗性而能在含有Ｇ418的选择性培养基中生长。
Ｇ418的这一选择特性 ,已在基因转移、基因敲除、抗性筛选以及转基因动物等方面得以广泛应用。
在进行转染时细胞膜受到影响，抗生素可能对细胞产生较大影响，加上G418有杀菌作用，所以有人主张转让时不加其它抗生素。
其实G418本身有很好的杀菌效果，在用G418进行筛选的过程中很少会发生污染。
但有一点，其实我觉得问题也不是很大，那就是：在老外的一本实验手册中提到，在脂质体转染时所用培养基中最好不加任何抗生素。
我想他的想法可能是脂质体对细胞膜有影响，可能此时加抗生素对细胞损伤较大。
因为庆大霉素、链霉素、G418均是氨基糖甙类药物，其药理作用完全一样。
单克隆抗体制备过程中经过两次筛选[1]
![单克隆抗体制备过程中经过两次筛选[1]](https://img.taocdn.com/s3/m/9a194bfd6394dd88d0d233d4b14e852458fb39b0.png)
单克隆抗体制备过程中经过两次筛选单克隆抗体制备过程中，总共有两次筛选，第一次筛选出杂交瘤细胞，第二次筛选出能产生特异性抗体的杂交瘤细胞，两次筛选的原理和方法是不相同的。
第一次筛选的原理与方法：细胞融合后，杂交瘤细胞的选择性培养是第一次筛选的关键。
普遍采用的H A T选择性培养液是在普通的动物细胞培养液中加入次黄嘌呤（H）、氨基喋呤（A）和胸腺嘧啶核苷酸（T）。
其依据是细胞中的DNA合成有两条途径：一条途径是生物合成途径（“D途径”），即由氨基酸及其他小分子化合物合成核苷酸，为DNA分子的合成提供原料。
在此合成过程中，叶酸作为重要的辅酶参与这一过程，而HA T培养液中氨基喋呤是一种叶酸的拮抗物，可以阻断DN A合成的“D途径”。
另一条途径是应急途径或补救途径（“S途径”），它是利用次黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核苷转移酶（HGPRT）和胸腺嘧啶核苷激酶（TK）催化次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷生成相应的核苷酸，两种酶缺一不可。
因此，在HA T培养液中，未融合的效应B细胞和两个效应B细胞融合的“D途径”被氨基喋呤阻断，虽“S途径”正常，但因缺乏在体外培养液中增殖的能力，一般10d左右会死亡。
对于骨髓瘤细胞以及自身融合细胞而言，由于通常采用的骨髓瘤细胞是次黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核苷转移酶缺陷型（HGPRT）细胞，因此自身没有“S途径”，且“D途径”又被氨基喋呤阻断，所以在HAT培养液中也不能增殖而很快死亡。
惟有骨髓瘤细胞与效应B 细胞相互融合形成的杂交瘤细胞，既具有效应B细胞的“S途径”，又具有骨髓瘤细胞在体外培养液中长期增殖的特性，因此能在HA T培养液中选择性存活下来，并不断增殖。
第二次筛选的原理和方法：在实际免疫过程中，由于采用连续注射抗原的方法，且一种抗原决定簇刺激机体形成相对应的一种效应B淋巴细胞，因此，从小鼠脾脏中取出的效应B淋巴细胞的特异性是不同的，经HA T培养液筛选的杂交瘤细胞特异性也存在差异，所以必须从杂交瘤细胞群中筛选出能产生针对某一预定抗原快定簇的特异性杂交瘤细胞。
生物药生产细胞株监管要求与筛选要点
生物药是利用生物技术生产的药物，具有高效、低副作用等优点，受到越来越多的关注和重视。
而生物药的生产与监管也是非常重要的环节，其中细胞株的监管和筛选尤为关键。
本文将重点讨论生物药生产细胞株监管要求与筛选要点。
一、生物药生产细胞株监管要求1. 严格遵循相关法规法规生物药生产细胞株监管要求首先要符合国家相关的法规法规，比如《生物制品质量管理规范》等。
生物药生产企业应严格按照法规法规要求进行生物制品质量管理，确保生产过程和产品质量的合规性。
2. 建立健全的质量管理体系生物药生产企业要建立健全的质量管理体系，包括质量管理制度、质量控制标准、质量控制记录等，确保生产过程的合规性和产品质量的稳定性。
要对细胞株的来源、鉴定、保存等进行详细的记录和管理。
3. 进行定期的审计和验证生物药生产企业应定期进行内部和外部的审计和验证，确保质量管理体系的有效性和合规性。
内部审计主要包括对生产过程和质量管理体系的自查，外部审计主要是由相关监管部门进行的审计。
二、生物药生产细胞株筛选要点1. 细胞株的来源和鉴定生物药生产企业在筛选细胞株时，首先要确定细胞株的来源，确保细胞株的合法性和纯度。
要进行细胞株的鉴定，确保细胞株的身份和稳定性。
2. 细胞株的保存和传代生物药生产企业应建立细胞株的保存制度，确保细胞株的保存完整性和稳定性。
要建立细胞株的传代制度，确保细胞株的稳定性和一致性。
3. 细胞株的生物学特性在筛选细胞株时，生物药生产企业还需要对细胞株的生物学特性进行评价，包括细胞生长特性、代谢特性、表达特性等，确保细胞株适合用于生物药的生产。
4. 细胞株的安全性评估生物药生产企业还需要对细胞株的安全性进行评估，包括对细胞株的致病性、致突变性等进行评估，确保细胞株符合相关的安全性要求。
生物药生产细胞株监管要求包括严格遵循相关法规法规、建立健全的质量管理体系，进行定期的审计和验证；生物药生产细胞株筛选要点包括细胞株的来源和鉴定、细胞株的保存和传代、细胞株的生物学特性、细胞株的安全性评估，为确保生物药生产过程的合规性和产品质量的稳定性提供了重要的指导意义。
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筛选细胞株的方法
细胞株筛选是利用细胞的生理特性，对各种变异体的细胞进行分类，最终得到满足要求的细胞株的方法。
一般细胞株的筛选方法有以下几种：
1、分子筛选：此方法利用分子生物学技术，将染色体上的变异体筛选出来，进行基因调控。
2、形态学筛选：此方法可以通过宏观形态变化，观察细胞株的外在特征，判断细胞株是否是想要的。
3、细胞行为学筛选：此方法可以通过观察细胞株的活动性、繁殖能力等指标，来过滤较低的细胞株。
4、生物反应筛选：此方法利用药物或其他物质对细胞株产生的影响，来判断该细胞株是否有较高抗性或特殊反应性，筛选出较高的细胞株。
5、酶学筛选：此方法利用一些特殊的酶反应，如乳糖酶分解、腺病毒应激反应等，来筛选出满足要求的细胞株。
6、生物免疫筛选：此方法利用抗原抗体反应，观察细胞完整性及能否活动，是否具有特殊的信号转导能力等，从而判断细胞株的优劣。
最后，需要指出的是，各种细胞筛选方法都有各自的优缺点，在实际筛选中，可以根据每个筛选项目的特性，结合多种筛选方法，从而得到满足要求的细胞株。
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