稳定细胞株筛选实验
最全的G418筛选稳定表达细胞系总结1
最全的G418筛选稳定表达细胞系G418是一种广谱抗生素，可以选择性地杀死没有正确整合的质粒DNA转染的细胞，从而筛选出具有稳定表达的细胞系。
G418筛选是基因转染中常用的一种选择方法，通过对G418敏感性的筛选来选择转化基因。
本文将G418筛选步骤和优化方案。
G418筛选步骤细胞株选取首先需要选取稳定转染所需的细胞株。
需要保证选取的细胞株生长健康、分裂正常、易于培养以及不易死亡。
常用的细胞株有293T、CHO、HEK293。
转染在开始筛选之前，需要将目的基因转染进入所选细胞株。
目前常用的转染方法有磷酸钙共沉淀法、电转染法和脂质体转染法等，需要根据实际情况选择转染方法。
初步筛选完成转染后，需要在培养基中加入G418，通常的加药浓度不超过1mg/mL，推荐浓度为400μg/mL。
在转染后24-48小时内开始进行初步筛选，通过观察细胞的生长状态以及基因表达情况来判断筛选效果。
细分筛选初步筛选后，需要将G418的浓度逐步增加，通常第二轮加药浓度是初步筛选浓度的2倍，第三轮加药浓度是第二轮的2倍。
逐渐递增药物浓度，可以让敏感的细胞死亡，生存的细胞逐渐表达目的基因，从而得到稳定的细胞株。
稳定维持筛选到稳定的细胞后，需要对细胞进行定期维护。
通常可以在培养基中加入适当的G418浓度，维持稳定表达的转染细胞。
优化方案药物浓度G418的加药浓度直接影响到细胞死亡率和筛选效果。
在进行筛选前需要先进行剂量反应实验，通过不同浓度药物的处理，检测细胞生长状态和基因表达情况。
细胞密度传统细胞密度在98%时，死亡率是最高的。
因此，为了降低G418对细胞的毒性，可以将细胞密度控制在70-80%左右。
同时，过稀的细胞密度也会影响到筛选效果，因此需要根据实际情况进行调整。
培养时间筛选时间也直接影响到G418对细胞的毒性程度和筛选效果。
不同的细胞株和实验条件下，对筛选时间的选择有所不同。
通常初步筛选时间在24-48小时，细分筛选筛选时间需要根据实际情况进行判断。
稳定细胞株筛选流程
稳定细胞株筛选流程稳定细胞株筛选的流程主要包括以下几个步骤：1.构建表达载体：首先，需要构建表达目的基因的质粒载体。
该载体通常含有启动子、目的基因和选择标记基因等元件。
启动子可以控制基因的转录水平，目的基因可以是感兴趣的基因或报告基因，选择标记基因则用于筛选稳定细胞株。
2.细胞转染：将构建好的表达载体导入目标细胞中。
转染可以采用多种方法，如化学法、电穿孔法和病毒转染法等。
转染后，目标细胞中的外源基因片段将被导入细胞质。
3.选择压力：为了筛选稳定细胞株，需要加入选择压力。
选择压力可以是抗生素、毒素或药物等，只有在压力下能够存活的细胞才能继续生长和繁殖。
4.单克隆细胞筛选：经过选择压力后，细胞群体中可能存在不同的细胞克隆。
为了获得单克隆稳定细胞株，需要进行单克隆细胞筛选。
常用的方法有稀释分选法、限稀稀释法和流式细胞术等。
5.鉴定稳定细胞株：筛选出的单克隆细胞株需要进行进一步的鉴定。
可以通过PCR、Western blot、荧光显微镜观察等方法验证目的基因的稳定表达。
总结起来，稳定细胞株筛选的流程包括构建表达载体、细胞转染、选择压力、单克隆细胞筛选和鉴定稳定细胞株等步骤。
这个流程能够筛选出稳定地表达目的基因的细胞株，为基因功能研究和药物开发提供可靠的实验模型。
在实际操作中，稳定细胞株筛选的流程可能会因实验目的和细胞类型的不同而有所调整。
但总体而言，以上步骤是筛选稳定细胞株的基本流程。
通过稳定细胞株的筛选，可以获得稳定表达目的基因的细胞株，从而开展进一步的实验和研究。
稳定细胞株的筛选是基因功能研究和药物开发中必不可少的一步。
通过稳定细胞株的筛选，可以实现对目的基因的稳定表达，为研究基因功能和开发新药物提供有力支持。
因此，掌握稳定细胞株筛选的流程和方法对于科研人员和药物开发人员具有重要意义。
整理)慢病毒稳转细胞株步骤
稳转慢病毒一、所需试剂1、慢病毒载体（详细信息见附录及《质粒的扩增提取》）（大肠杆菌-80℃保存2-3年，质粒-20℃保存2-3年，病毒液-80℃保存1年）（1）载体质粒：两端的LTR、剪切位点、包装信号Ψ以及抗性或荧光基因、gag基因5′端350bp的序列及位于env序列中的RRE，含宿主RNA聚合酶识别部分（2）包装质粒（psPAX2）：包含了pol、gag包装成分（3）包膜质粒（pMD2.G）：用其他病毒的包膜蛋白代替了env基因.三种质粒共同转染产生不具有自我复制能力的病毒载体。
2、包装细胞：293T细胞3、菌株：大肠杆菌，用于提取质粒4、转染试剂：XTREME-GENE（-20℃保存，不可分装），一种脂质与其他组份构成的混合物5、浓缩试剂（配好后4℃保存，原材料室温保存）：5X PEG8000/NaCl溶液（聚乙二醇）：NaCl 8.766 g; PEG8000 50g溶解在200ml Milli-Q纯水中，高压蒸汽灭菌**也可直接从公司买来病毒液（-80℃封口膜封口冻存管保存，4℃保存3天）：滴度一般为108TU/ml6、10mg/ml polybrene（-20℃分装保存）：溴化己二甲铵。
是带正电的小分子，与细胞表面的阴离子结合，提高慢病毒对细胞的感染效率，通常加入polybrene 能提高感染效率2～10 倍。
有一定细胞毒性，需要摸索浓度（1～10μg/ml）7、无血清培养基：optimen8、贴壁细胞（复苏后3代以上的细胞）9、puromycin：嘌呤霉素，用于筛选稳转细胞二、具体步骤<一>病毒包装与收集（中皿，转染步骤类似于瞬转）第一天1、种板，10×105个293T细胞，加入全培养基双抗DMEM 4-5ml，过夜2、配制5X PEG8000/NaCl溶液称取NaCl 8.766 g; PEG8000 50g溶解在200ml Milli-Q纯水中；121摄氏度30min 湿热灭绝30min；保存在4℃第二天2、加入2ml全培养基DMEM3、将1加入2，孵育10h，换成5ml全培养基第四天第五天：1、9:00和17:00各收取一次5ml培养液，共20ml（-80℃保存）2、过滤：用孔径为0.45mm的过滤器除去上清中的293T细胞3、加入5ml 5XPEG8000/NaCl溶液，每30min-1h上下摇匀一次4、4℃过夜第六天1、4℃，3500rpm，20min2、弃上清，倒扣纸上静置1-2min，吸干残余液体3、加入120-150μl PBS，缓慢吹打，以防形成气溶胶4、50μl分装，-80℃保存。
稳定细胞株筛选
稳定株构建 FAQ转自微博思路迪慢病毒包装1，什么是瞬时转染和稳定转染？答：瞬时转染：顾名思义，外源片段的表达时间短暂。
这主要是因为外源导入的裸露的载体整合入基因组的几率非常低，所以以染色体外(episomal)形式存在，不能随细胞分裂而一同复制导致最后拷贝数被稀释导致的。
而且考虑到细胞分裂会稀释质粒的量，所以起初转染的质粒拷贝数极高。
这就导致瞬时转染呈现一个高拷贝到低拷贝迅速降低的过程，且无法在这个系统上实现可诱导表达。
稳定转染：是相对瞬时转染而言，进入细胞的质粒整合入细胞基因组中，并能随细胞分裂稳定传递下去。
在这个系统中，质粒表达稳定，拷贝数低，且能实现诱导表达。
稳定转染并不是一种与瞬时转染不同的方法，只是对瞬时转染的细胞进行筛选，得到稳定整合的细胞株。
稳定整合的几率因基因传递的方法而异，跨度可以从10-8到10-1。
因此，对于有的转染方法，比如化学试剂介导的转染，其整合几乎可以忽略不计。
质粒载体整合的位点并不是完全随机分布，依据不同的基因传递方法，呈现不同的靶向倾向性，所以是一种半随机整合。
不同基因传递方法对质粒稳定表达的影响见表XXXX。
2，设计稳定株构建实验需要考虑的因素有哪些？∙答：稳定整合试验中需要考虑的几个关键因素有：∙1)，外源插入片段的拷贝数。
多数情况下，低拷贝甚至是单拷贝可以减少人为实验因素的干扰。
∙2)，整合的几率，这不仅决定了稳定株筛选的难易程度，而且还可以帮助人们更容易得到混合稳定株。
∙3)，整合位点的转录活跃度，决定了稳定株中外源片段的表达质量。
最理想的状况是单拷贝，但转录活性比较高。
∙4)，整合后的稳定性。
不同的整合位点决定了外源片段在染色体中的稳定性，有些区域易发生重组或者丢失，从而导致稳定株再次丢失的情况。
∙5)，最好使用混合稳定株或者获得多个不同单克隆稳定株。
因为稳定整合往往伴随这插入失活宿主内源基因，所以实验时通过使用混合稳定株，或者对多个单克隆稳定株进行比较，可以帮助研究人员获得更精确的实验数据。
稳定细胞名词解释
稳定细胞名词解释
稳定细胞（stable cells)又称静止细胞（quiescent cell)。
在生理情况下，这类细胞增殖细胞不明显，在细胞增殖周期中处于静止（G0），但受到组织损伤的刺激时，则进入DNA合成前期（G1），表现出较强的再生能力。
稳定细胞株筛选方法
1、转染质粒后，单克隆方法筛选稳定细胞系：
对大多数细胞转染效率较低。
对于基因过表达，如果转染效率达到40%，基因过表达尚可。
但是对于基因干扰实验，对转染效率要求远远高于基因过表达，通常质粒转染无法满足。
另外，质粒游离于细胞质中，很快降解，无法满足较长时间的检测项目；质粒转染整合几率极低，稳定细胞株构建耗时耗力，且得率很低，往往需要挑取单克隆株。
2、病毒感染筛选稳定细胞株：
病毒感染方法较质粒转染筛选单克隆方法更方便和高效，是目前主流的稳定细胞系筛选方法。
用慢病毒制备稳转细胞株，由于其高效整合、高效转录、高效表达、宿主范围广，感染效率高，且与细胞染色体整合而不发生基因重排，是制备稳定细胞株的理想载体。
真核转染稳定筛选标记及原理
G418。适用于所有的真核细胞
氯霉素乙酰转移酶（CAT）基因选择系统
❖ 遗传标记：CAT，大肠杆菌Tn9转座子编码的催化氯霉素 乙酰化反应的蛋白质
❖ 编码产物：氯霉素乙酰转移酶 ❖ 筛选药物：氯霉素 ❖ 作用机理：真核细胞缺乏CAT，将CAT作为报告基因与目
的基因一起导入到真核细胞，可在加入氯霉素的培养基中 选择阳性细胞。常用于瞬时表达研究。
潮霉素抗性选择系统
❖ 遗传标记：HPH ❖ 编码产物：潮霉素B磷酸转移酶 ❖ 筛选药物：潮霉素B ❖ 作用机理：HPH灭活潮霉素B
LOGO
小组：周四班二组 组员：薛莹超（报告者）
滕达 曾欣宜 席杰 赖惠英 邓宇星
LOGO
外源基因表达的三个概念
分类
转化
通过生化或 者物理方法 将目的基因 导入原核细 胞中 。
转染
通过生化或 者物理方法 将目的基因 导入真核细 胞中 。
转导
通过病毒介导 ，用基因组中携 带有克隆目的片 断的病毒来感染 靶细胞。
死亡，而导入了外源基因的细胞成功存活，并且 在氨甲喋呤的选择压力下大量表达蛋白。
黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（XGPRT） 基因选择系统
❖ 遗传标记：XGPRT ❖ 编码产物：黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶 ❖ 筛选药物：霉酚酸
❖ 作用机理：XGPRT合成GMP。
哺乳动物细胞无XGPRT酶，不能利用黄嘌呤形成黄嘌 呤磷酸（XMP），但有鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT）， 可催化黄嘌呤形成次黄嘌呤磷酸（IMP）。哺乳动物细胞可 通过IMP生成GMP。当用IMP脱氢酶抑制剂霉酚酸，抑制了 GMP的合成，使细胞失去合成DNA能力而死亡。
稳定细胞株筛选流程
稳定细胞株筛选流程稳定细胞株筛选是一种常用的实验方法，用于筛选出稳定表达目的基因的细胞株。
这种方法可以用于基因功能研究、药物筛选和生物制品生产等领域。
本文将介绍稳定细胞株筛选的流程。
第一步：构建表达载体稳定细胞株筛选的第一步是构建表达载体。
表达载体是一种质粒，可以将目的基因导入到细胞中。
常用的表达载体有pCDNA3.1、pEGFP-N1等。
在构建表达载体时，需要将目的基因克隆到载体中，并加入适当的启动子和选择标记。
第二步：转染细胞转染是将表达载体导入到细胞中的过程。
常用的转染方法有热激转染、电穿孔转染和化学转染等。
在转染时，需要选择适当的细胞系和转染剂，并优化转染条件，以提高转染效率。
第三步：筛选稳定细胞株转染后，需要筛选出稳定表达目的基因的细胞株。
常用的筛选方法有抗生素筛选和流式细胞术筛选等。
在抗生素筛选中，将选择标记加入到表达载体中，转染后加入相应的抗生素，只有表达目的基因的细胞才能存活下来。
在流式细胞术筛选中，将目的基因与荧光蛋白等标记融合，通过流式细胞术筛选出表达目的基因的细胞。
第四步：鉴定稳定细胞株筛选出稳定细胞株后，需要进行鉴定。
常用的鉴定方法有PCR、Western blot和免疫荧光等。
在PCR中，通过扩增目的基因的特定片段来鉴定细胞株是否表达目的基因。
在Western blot中，通过检测目的基因的蛋白质表达来鉴定细胞株。
在免疫荧光中，通过检测目的基因的荧光信号来鉴定细胞株。
稳定细胞株筛选是一种重要的实验方法，可以用于筛选出稳定表达目的基因的细胞株。
在筛选过程中，需要注意选择适当的表达载体、转染方法和筛选方法，并进行鉴定，以确保筛选出的细胞株稳定表达目的基因。
稳定细胞株筛选药物浓度确定方法
稳定细胞株筛选药物浓度确定方法
在使用G418、潮霉素B或嘌呤霉素筛选稳定细胞系细胞之前，需要先通过梯度实验确定适合该类细胞的最佳药物浓度。
对于一些常见的细胞系，通常可以在资料中找到推荐的药物浓度。
例如Hela细胞用400 μg/ml的G41或1 μg/ml的嘌呤霉素进行稳定细胞株筛选。
用G418或潮霉素B，选用在5天左右出现细胞大批死亡，2周全部死亡的浓度作为筛选浓度。
对于嘌呤霉素,通常采用在3-4天杀死全部细胞的浓度。
不同批次的药物活性有一定差异。
因此在使用新批次药物时，需要重新测定最佳浓度。
筛选抗生素的推荐使用浓度（μg/ml）
抗生素工作范围筛选浓度维持用量
G418 50-800 400-500 100
Hygromycin 50-800 200 100
Puromycin 0.25-2 0.5-10 0.25
1、在加入筛选药物前一天将细胞以50%密度接种到6孔板。
第二天在培养基中按G418(0,50,1000,200,400,800μg/ml)或者嘌呤霉素（0,1,2.5,5,7.5,10μg/ml）加入。
2、用G418筛选处理5-10天。
每2天观察细胞一次。
每4天跟换新的有抗生素的培养基（如果有必要可以更换得更勤）。
直到得到最佳浓度。
3、用嘌呤霉素处理4-7天。
每2天跟换新的有抗生素的培养基。
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稳定细胞株筛选实验
本实验使用过表达human Oct-4-EGFP的慢病毒感染HeLa细胞。
该病毒的表达框为pLenti-CMV-Oct-4-EGFP-3FLAG-PGK-Puro： CMV启动子驱动Oct-4-EGFP基因的表达，同时由PGK启动子驱动puromycin抗性基因的表达。
在感染HeLa细胞72h后，通过加入并维持2μg/μL的puromycin杀死未被有效感染的细胞。
从而在puromycin药物的维持下最终获得Oct-4-EGFP稳定表达的混合稳定株。
关键词：Oct-4-EGFP，稳定细胞株，HeLa，慢病毒
一、实验原理
外源基因在细胞中的表达可分为两大类，一类是瞬时表达，一类是稳定表达（永久表达）。
前者外源DNA/RNA不整合到宿主染色体中，虽然可以达到高水平的表达，但通常只持续几天。
后者外源DNA整合到宿主细胞染色体上，使宿主细胞可长期表达目的基因。
建立稳定细胞株，一般是根据不同基因载体中所含有的抗性标志选用相应的药物对靶细胞进行筛选。
最常用的抗性标记基因有潮霉素（hygromycin）、新霉素（neomycin）和嘌呤霉素（puromycin），常用Hygromycin B、G418和puromycin进行选择性筛选。
传统的稳定株筛选方法需要通过外源基因的瞬时转染后对靶细胞进行筛选，最终获得从单一细胞扩增起来的稳定细胞株，该方法阳性率低，周期长，工作量大。
慢病毒是一种RNA病毒，携带的外源基因在病毒感染细胞后需要逆转录为DNA，再整合到宿主细胞基因组以后才能表达。
利用慢病毒必须整合到宿主基因组的特性来筛选稳定株的方法克服了传统方法的弊端，可以在短时间内获得高效率的稳定细胞株。
筛选得到的细胞或者可稳定表达目的蛋白，用于蛋白的扩增和富集；或者得到稳定沉默特定基因的细胞株。
[晶莱生物]
二、实验目的
通过慢病毒感染配合药物筛选的方法获得稳定表达Oct-4-EGFP的HeLa稳定细胞株。
三、实验步骤
实验共分以下3个主要步骤：
1.细胞铺板
将HeLa细胞按30%的融合度接种到24孔板：
1)HeLa细胞配成1×105 cells/mL细胞悬液，待铺板。
2)每孔铺500μL，即5×104 cells/well，铺1块24孔板。
2.感染慢病毒
12~20h后感染慢病毒：
1)根据公式计算病毒用量：（细胞数×MOI值/病毒原液滴度）×103=病毒用量（μL）。
2)本实验中MOI取10，吸去与加入病毒体积相同培养基。
3)每孔加2.5μL的polybrene (1mg/mL)，使polybrene终浓度达到5μg/mL。
4)24h后换，弃去培养基后每孔加入500μL新鲜的培养基。
3.稳定株筛选
1)72h以后，加入终浓度2μg/μL puromycin。
每隔2-3天换一次终浓度2μg/μL puromycin 新鲜培养基。
2)药物筛选约10天后，拍荧光照片。
3)稳定细胞株冻
结论：从图1可以看到，在MOI为10条件下，HeLa的感染效率约为80%。
根据图2，使用puromycin药物筛选10天后，表达目的基因的HeLa的比例在90%以上，且荧光亮度增强。
Oct-4-EGFP稳定表达的HeLa细胞株筛选成功。