单克隆抗体CHO细胞株筛选策略探讨（一）
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单克隆抗体制备的筛选过程及意义研讨1975年英国剑桥皇家委员会分子生物学实验室的Kohler和Milstein成功的用细胞杂交方法把能够产生针对特定抗原的抗体分泌细胞分离出来，在体外长期传代并分泌特异性抗体，这些细胞经过克隆化，可以形成单克隆细胞，能产生针对某一特定抗原决定簇的完全相同的纯净抗体，即单克隆抗体（monoclonal antibody，McAb），简称单抗。
在单克隆抗体制备过程中，一般需要经历三次筛选过程。
1 HAT选择杂交瘤细胞融合的选择培养液中有三种关键成分：次黄嘌呤（hypoxanthine，H）、甲氨蝶呤（aminopterin，A）和胸腺嘧啶核苷（thymidine，T），取三者的字头成为HAT培养液。
细胞DNA合成一般有两条途径：主途径是由氨基酸和糖合成核苷酸，进而合成DNA，叶酸作为重要的辅酶参与这一合成过程；另一替代途径是在次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷酸存在的情况下，经次黄嘌呤磷酸核糖转化酶（HGPRT）和胸腺嘧啶核苷激酶（TK）的催化作用合成DNA。
甲氨蝶呤是叶酸的拮抗剂，可阻断瘤细胞正常合成DNA，而融合所用的瘤细胞是经毒性培养液选出的HGPRT-细胞株，所以不能在HAT培养液中存活。
因为融合细胞具有亲代双方的遗传性能，所以可在HAT培养液中长期存活与繁殖，从而达到细胞分离和纯化的目的。
在单克隆抗体制备过程中，由于细胞融合是一个随机的物理过程，小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞混合细胞悬液中，经融合后细胞可能有多种形式，不一定就是需要的杂交瘤细胞，如融合的脾细胞和杂交瘤细胞、融合的脾细胞和脾细胞、融合的瘤细胞和瘤细胞、未融合的脾细胞、未融合的瘤细胞以及细胞的多聚体形式等。
正常的脾细胞在培养液中存活仅5～7天，无需特别筛选，细胞的多聚体形式也容易死去，而未融合的瘤细胞则需要进行进一步特别的筛选取出。
2 抗体的检测与筛选筛选杂交瘤细胞通过选择培养而获得的杂交细胞系中，仅少数能分泌针对免疫原的特异性抗体，因此需要检测特异性抗体，并筛选出所需要的杂交瘤细胞系。
cho细胞表达系统及筛选原理
cho细胞表达系统及筛选原理Cho细胞表达系统及筛选原理一、引言Cho细胞表达系统是一种常用的哺乳动物细胞表达系统，被广泛应用于重组蛋白的生产。
本文将介绍Cho细胞表达系统的原理以及其在蛋白质筛选中的应用。
二、Cho细胞表达系统的原理Cho细胞是一种中国仓鼠卵巢细胞系，具有较高的生长速度和蛋白质表达能力。
Cho细胞表达系统主要包括以下几个关键步骤。
1. 转染将目标基因导入Cho细胞中，通常使用质粒转染法或病毒载体转染法。
质粒转染法通过将目标基因插入质粒DNA中，然后利用转染试剂将质粒DNA导入细胞内。
病毒载体转染法则通过构建携带目标基因的病毒载体，将其感染到Cho细胞中。
2. 选择性筛选为了确保只有转染成功的细胞能够表达目标蛋白，通常在培养基中添加适当的选择性抗生素，如G418或葡萄糖酸钾。
只有转染成功的细胞才能抵抗抗生素的作用，存活下来。
3. 扩增和表达经过筛选的细胞将被扩增培养，以获得足够数量的细胞进行大规模蛋白质表达。
通常选择合适的培养基和培养条件，以提高细胞的生长速度和蛋白质表达水平。
4. 蛋白质纯化经过表达的目标蛋白质需要进行纯化，以去除其他杂质。
常用的纯化方法包括亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤层析等。
通过这些方法，可以获得高纯度的目标蛋白质。
三、Cho细胞表达系统在蛋白质筛选中的应用Cho细胞表达系统在蛋白质筛选中具有以下优势。
1. 高表达水平Cho细胞具有较高的蛋白质表达能力，能够快速产生大量目标蛋白。
这对于需要大量蛋白质的研究和工业应用非常有利。
2. 真核细胞表达与原核细胞表达系统相比，Cho细胞表达系统能够实现真核细胞蛋白质表达。
这使得Cho细胞表达系统适用于需要进行正确的蛋白质翻译修饰、蛋白质折叠和组装的蛋白质研究。
3. 可选择性筛选通过添加适当的选择性抗生素，可以筛选出成功表达目标蛋白的细胞。
这样可以确保筛选后的细胞具有较高的表达水平和纯度。
4. 灵活性Cho细胞表达系统可以应用于多种类型的蛋白质，包括单链抗体、重组蛋白、酶等。
单克隆筛选方法
单克隆筛选方法单克隆筛选方法是一种用于筛选出特定单克隆抗体的技术手段。
单克隆抗体是一种能够特异性识别和结合特定抗原的抗体分子，具有广泛的应用价值。
单克隆筛选方法的出现，为研究人员提供了一种高效、准确的手段，以快速获得所需的单克隆抗体。
一、单克隆筛选方法的背景单克隆抗体的研发一直是生物医药领域的热点之一。
传统的制备单克隆抗体的方法，如杂交瘤技术，虽然能够获得单克隆抗体，但操作复杂、耗时长且效率低下，限制了其在实际应用中的推广。
为了解决这个问题，研究人员陆续提出了许多新的筛选方法，其中单克隆筛选方法就是其中之一。
单克隆筛选方法主要是基于高通量筛选平台和多样性库的组合使用。
首先，需要构建一个包含大量抗体序列的多样性库，这个库中包含了各种可能的抗体变量区序列。
然后，将这个库与目标抗原进行筛选，通过多轮筛选，逐渐筛选出对目标抗原具有高亲和力和高特异性的单克隆抗体。
三、单克隆筛选方法的流程单克隆筛选方法通常包括以下几个步骤：1. 构建多样性库：通过将人体免疫系统中的抗体序列进行随机变异，构建一个具有多样性的抗体库。
这个库中包含了大量不同的抗体变量区序列。
2. 筛选抗原结合：将构建好的多样性库与目标抗原进行筛选。
通常，可以通过将目标抗原与库中的抗体变量区序列进行杂交，筛选出与目标抗原结合的候选抗体。
3. 亲和力筛选：通过逐渐提高筛选条件，筛选出具有高亲和力的单克隆抗体。
通常，可以通过改变抗原浓度、筛选时间等参数来实现。
4. 特异性筛选：通过将候选抗体与与目标抗原类似的结构进行竞争结合，筛选出对目标抗原具有高特异性的单克隆抗体。
5. 鉴定和验证：对筛选出的单克隆抗体进行鉴定和验证。
这包括对抗体的亲和力、特异性、稳定性等进行评价，确保其具有良好的性能。
四、单克隆筛选方法的优势相比传统的制备单克隆抗体的方法，单克隆筛选方法具有以下几个优势：1. 高效性：单克隆筛选方法利用高通量筛选平台，能够同时对大量的抗体进行筛选，提高了筛选效率。
CHO细胞无血清培养基的筛选与优化
CHO细胞无血清培养基的筛选与优化在生物制药领域，CHO 细胞（Chinese Hamster Ovary Cell，中国仓鼠卵巢细胞）因其能够高效表达重组蛋白而被广泛应用。
然而，传统的含血清培养基存在诸多问题，如血清成分复杂且批次间差异大，易引入外源病毒和支原体污染等。
因此，开发和优化 CHO 细胞无血清培养基成为了提高生物制品质量和安全性的关键环节。
一、CHO 细胞无血清培养基的重要性血清在细胞培养中曾被广泛使用，但其存在的问题不容忽视。
血清中的成分复杂且不稳定，这使得细胞培养过程难以控制和标准化。
不同批次的血清质量差异较大，可能影响细胞的生长、代谢和产物表达。
此外，血清中可能携带的病毒、支原体等污染物会给生物制品带来潜在的安全风险。
相比之下，无血清培养基具有明显的优势。
它的成分明确且稳定，便于质量控制和优化。
无血清培养基可以减少外源污染物的引入，提高生物制品的安全性。
同时，它能够为细胞提供更适宜的生长环境，促进细胞的生长和产物表达，从而提高生产效率和产品质量。
二、筛选 CHO 细胞无血清培养基的方法1、基础培养基的选择首先需要选择合适的基础培养基作为起点。
常见的基础培养基如DMEM（Dulbecco's Modified Eagle Medium，杜氏改良伊格尔培养基）、RPMI 1640 等，它们在营养成分和离子浓度等方面有所不同。
需要根据 CHO 细胞的特性和培养需求，初步筛选出几种可能适用的基础培养基。
2、添加剂的筛选在基础培养基的基础上，需要添加各种营养成分、生长因子、激素等添加剂来满足 CHO 细胞的生长和代谢需求。
例如，胰岛素、转铁蛋白、乙醇胺等对于细胞的生长和存活至关重要。
通过单独或组合添加这些添加剂，并检测细胞的生长情况、代谢指标和产物表达水平，来筛选出最优的添加剂组合。
3、化学成分的优化除了添加剂，培养基中的化学成分如氨基酸、维生素、无机盐等的浓度和比例也需要进行优化。
CHO细胞克隆株放大培养与筛选1
CHO细胞克隆株放大培养与筛选方案一CHO细胞无血清驯化1.从6孔板中开始进行复苏培养，时间周期大致为48h后，进行换液培养48h，再从6孔板中转移到T25中（黄子健：几传几），正常培养48h后，进行换液培养48h，再从T25转移到T75中（黄子健：几传几）。
在T25和T75中可分别进行细胞冻存保种处理。
2.从T25中放大到摇瓶中悬浮培养（多种方法需要摸索）1.将无血清细胞培养基和含血清培养基的按1：1（V/V）的比例进行混合，接种密度为2－4×105cells/ml的细胞，在37℃、5％CO2培养箱进行培养。
2.根据细胞生长和活率情况，在降血清的每一阶段可稳定传代1－3代，接种密度维持在2- 4×105cells/ml。
3.逐步提高无血清细胞培养基在混合液中的比例（V/V），即降低混合液中的血清含量，传代过程的细胞接种密度仍维持为2- 4×105cells/ml。
4.直至混合液中的血清浓度降低至0.1-0.2%，每一代的细胞活率大于90％后，此时可将细胞完全培养在CHO无血清无动物组分培养基中。
5.在CHO无血清无动物组分培养基中进行放大培养，建立起适应无血清无动物组分培养的CHO种子细胞库方案二连续驯化-条件培养基进行驯化1.由于从75% 无血清培养基（SFM）到100% 无血清培养基（SFM）的变化对细胞的压力过大，因此，可能需要将细胞在10% 补加血清培养基与90% 无血清培养基（SFM）的混合培养基中传代培养2-3 次。
2.在100％无血清培养基（SFM）中传代3次后，大多数细胞系即可认为完全适应。
在将培养基转换为100％无血清培养基（SFM）之前，偶尔也会出现细胞无法通过某一步骤的情况。
3.如果出现这种情况，使用先前补加血清培养基与无血清培养基的比例返回并继续传代培养 2 至 3 次。
CHO细胞表达重组单克隆抗体载体的构建策略
CHO细胞表达重组单克隆抗体载体的构建策略摘要近年来，重组蛋白被应用于不同疾病治疗，其中单克隆抗体（mAbs）是生物治疗类重组蛋白里发展最快的一类。
CHO细胞是生产这些重组蛋白应用最广泛的细胞株，表达载体决定重组蛋白的表达量和质量。
目前，关于CHO细胞中表达载体的构建策略已经建立，包括：单顺反子载体，多启动子表达载体，以及IRES（内部核糖体进入位点）或Furin-2A（弗林蛋白酶-2A多肽）元件介导的三顺反子载体。
其中，Furin-2A介导的载体非常有效，优势表现在自我剪切效率高，同一个开放阅读框相同的轻重链表达量。
本篇文章综述了这几种CHO 细胞重组单克隆抗体表达质粒构建策略的发展历程及其优缺点。
导言随着基因工程的发展，重组治疗性蛋白的需求也大幅增加[1,2]。
作为一种重要重组蛋白，治疗性mAbs具有特异性和低免疫原性。
近几年来，重组mAbs已经成为包括癌症及免疫系统缺陷在内的许多疾病治疗的主导药物[3,4]。
至今为止，FDA（美国食品药品管理局）和EMA （欧洲药品管理局）已经批准超过70种治疗性mAbs，其中39种是由CHO细胞生产（见表1），除此之外，还有几百种mAbs处于临床阶段[5]。
重组mAbs，或称基因改造抗体通过转基因技术在多种宿主细胞表达。
免疫球蛋白GmAbs（IgGmAbs）包括两条相同的轻链和两条相同的重链。
重组mAbs需要折叠、组装及合适地糖基化才具有生物学活性[6]。
不同宿主细胞产生的治疗性mAbs显示不同的免疫原性和治疗效果，暗示宿主细胞影响重组mAbs的生物学功能[4]。
大肠杆菌表达系统是一种简单的系统，其转录后修饰比较少而且不常见，导致这种系统只适合表达抗体片段或者是单链抗体[7,8]。
昆虫细胞、酵母细胞和转基因植物转录后修饰和人细胞不同，导致重组mAbs和人天然mAbs有很大差异[9]。
对比其他系统，哺乳动物细胞产生的治疗性重组蛋白具有正确的转录后修饰，相似的分子结构和糖基化，和人体内抗体相接近[10]。
单克隆抗体筛选原理
单克隆抗体筛选原理单克隆抗体是由单一B细胞克隆产生的具有高度特异性和一致性的抗体。
在生物学研究和医学诊断中，单克隆抗体因其特异性和灵敏度被广泛应用。
本文将介绍单克隆抗体的筛选原理，包括抗原-抗体反应、筛选阳性克隆、克隆扩增、抗体纯化和抗体鉴定等方面。
一、抗原-抗体反应抗原-抗体反应是单克隆抗体筛选的基础。
抗原是指能够与抗体结合的物质，具有特异的抗原表位。
抗体是由B细胞产生的免疫球蛋白，能够识别并结合抗原表位。
抗原-抗体反应具有高度特异性和可逆性，是免疫学检测中最常用的反应之一。
二、筛选阳性克隆在单克隆抗体的制备过程中，首先需要筛选出能够产生所需抗体的阳性克隆。
通常采用有限稀释法将B细胞与骨髓瘤细胞进行融合，获得大量的杂交瘤细胞。
通过筛选，选出能够产生所需抗体的阳性克隆。
三、克隆扩增筛选出的阳性克隆需要进行克隆扩增，以获得足够数量的细胞产生抗体。
通常采用有限稀释法或连续传代法进行克隆扩增，使杂交瘤细胞在培养基中增殖，产生大量的单克隆抗体。
四、抗体纯化获得的单克隆抗体往往含有杂质，如蛋白质、DNA等，需要进行纯化。
常用的纯化方法包括蛋白质A柱层析法、凝胶过滤法和离子交换层析法等。
这些方法能够将抗体与杂质分离，获得高纯度的单克隆抗体。
五、抗体鉴定纯化后的单克隆抗体需要进行鉴定，以确保其特异性和活性。
鉴定方法包括抗原结合试验、免疫荧光法、ELISA等。
通过这些方法可以检测单克隆抗体的特异性、亲和力和生物学活性，确保其适用于生物学研究和医学诊断。
总之，单克隆抗体的筛选原理主要包括抗原-抗体反应、筛选阳性克隆、克隆扩增、抗体纯化和抗体鉴定等方面。
通过对这些过程的了解和掌握，可以制备出高质量的单克隆抗体，为生物学研究和医学诊断提供有力的工具。
说明细胞株筛选的方法
说明细胞株筛选的方法一、引言细胞株筛选是生物学研究中非常重要的一步，它能够帮助科学家挑选出具有特定性质的细胞株，从而为后续的实验和研究提供基础。
本文将详细介绍如何进行细胞株筛选。
二、前期准备1. 筛选目标：在进行细胞株筛选之前，我们需要明确自己的筛选目标，例如：对某种疾病进行治疗的新型药物需要寻找具有抗体生成能力的B细胞株。
2. 培养基选择：不同类型的细胞需要不同种类的培养基来生长，因此在进行筛选之前需要先确定所需培养基，并准备好相应试剂。
3. 细胞来源：在进行筛选之前需要明确所需细胞来源，并从相应组织中获得原始样本。
三、细胞株分离1. 组织处理：将获得的原始样本用无菌PBS缓冲液洗涤去除杂质和红血球等成分。
2. 组织消化：将组织切碎并加入适量酶，如胰蛋白酶、胶原酶等，进行消化。
消化时间和温度需根据不同的组织类型进行调整。
3. 细胞分离：将消化后的组织过筛或用离心机分离出单个细胞。
四、细胞株培养1. 细胞传代：将刚分离出的细胞进行传代，即将一定数量的细胞移至新的培养皿中，并加入新鲜培养基。
2. 细胞生长：放置于恒温培养箱中，控制好温度、湿度等条件，让细胞自行生长。
注意定期更换培养基。
3. 细胞观察：观察细胞形态、数量和健康状态，判断是否需要更换或添加培养基。
五、筛选方法1. 抗体检测法：对于需要寻找具有抗体生成能力的B细胞株，可以采用抗体检测法。
将患者血清或目标蛋白加入到已经固定在96孔板上的靶抗原中，并加入待测B细胞株。
通过检测B细胞产生的抗体水平来筛选出具有较高抗体水平的细胞株。
2. 细胞增殖法：对于需要寻找能够快速生长的细胞株，可以采用细胞增殖法。
将不同的细胞株分别接种到96孔板中，每隔一定时间检测细胞数量变化，筛选出生长速度快、数量多的细胞株。
3. 药物筛选法：对于需要寻找对某种药物敏感的细胞株，可以采用药物筛选法。
将不同的细胞株分别接种到含有不同浓度药物的培养基中，观察其生长情况并计算IC50值，筛选出对该药物敏感的细胞株。
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单克隆抗体CHO细胞株筛选策略探讨（一）作者 l Frank Tao编辑 l 细胞房间摘要：随着单克隆抗体技术发展，单克隆CHO细胞株筛选技术也日异月新，越来越高效，越来越智能化。
本文主要结合自身CHO细胞株开发和细胞培养经验，将目前国内外单克隆抗体CHO细胞株筛选技术进行总结，供行业内参考，促进行业健康发展；问题：如何4-6个月内，筛选到稳定的单克隆细胞株表达在3-5 g/L或以上？关键词：单克隆抗体；CHO细胞；ClonePix；单克隆影像学拍照；Beacon；1.宿主细胞抗体药物生产的宿主细胞主要NS0、HEK293、Hybridoma、SP2/0、CHO等，但CHO细胞是生产抗体药物应用最广的宿主细胞，CHO细胞类型也比较多，例如：DG44、DXB11、CHO K1、CHO-S 等。
上世纪八九十年代开始，工业上使用较早的是DHFR体系（二氢叶酸还原酶缺陷型）DG44细胞。
当细胞培养基内还有MTX（甲氨蝶呤）时，二氢叶酸还原酶被抑制，通过反馈调节，使得该基因自我扩增，连带齐上下100-1000kb的基因都会扩增，如此目的基因也得到扩增，即可以提高目的蛋白的表达量。
现在很多单抗生产的体系依然是DG44。
GS体系（谷氨酰胺合成酶）CHO-K1是近些年发展的一种基因扩增筛选系统，较DHFR系统有明显的优越性，目前在国际上得到了广泛地认可。
其原理是GS在ATP水解提供能量的同时，利用细胞内的氨和谷氨酸合成谷氨酰胺。
在缺乏外源的谷氨酰胺培养基中加入GS抑制剂甲硫氨酸亚砜亚铵（MSX），可使GS基因及与之相连的目的基因得到有效扩增，从而达到提高目的基因表达水平的目的。
该系统的优点主要在：该系统不需要基因缺陷型的CHO-K1细胞株做为宿主细胞；CHO-K1细胞易于培养，更强壮；在培养基中无需加谷氨酰胺，能够避免谷氨酰胺分解造成培养体系中氨水平高的问题，降低了工艺控制的难度，并且可有效提高细胞发酵密度和延长细胞生存时间。
当然，目前也有商业化的GS缺陷性CHO细胞，主要有lonza公司的CHOK1SV（2002年）和CHOK1SVGS-KO（2012年），Merk 公司（原SAFC）的CHOZN CHO K1（2006年），采用缺陷的GS体系筛选可以缩短单克隆筛选周期，但由于供应商收费昂贵，国内外很多公司依然选择ATCC原始的CHO K1宿主细胞。
2.筛选标记以及表达载体选择表-1 哺乳动物细胞表达载体中常用的筛选标记Table-1 Selectable markers often used in mammalian expression筛选标记筛选试剂代谢型筛选标记（扩增型基因筛选标记）二氢叶酸还原酶（DHFR）甲氨蝶呤（MTX）谷氨酰胺合成酶（GS）氨基亚砜蛋氨酸（MSX）抗生素筛选标记（非扩增型基因筛选标记）嘌呤霉素抗性（Puromycin acetyltransferase）嘌呤霉素（Puromycin）杀稻瘟霉素脱氨酶（Blasticidindeaminase ）杀稻瘟霉素（Blasticidin ）组氨醇脱氢酶（Histidinol dehydrogenase）组氨醇（Histidinol）潮霉素磷酸转移酶（Hygromycin phosphotransferase）潮霉素（Hygromycin）氯林可霉素耐药基因（Zeocin resistance gene ） 氯林可霉素（Zeocin ）博来霉素耐药基因（Bleomycin resistance gene ） 博莱霉素（Bleomycin ）氨基糖苷磷酸转移酶（Aminoglycoside phosphotransferase ）新霉素（Neomycin or G418）以上表格是统计了目前哺乳动物细胞表达载体中常用的筛选标记，随着GS 体系优越性，越来越多的公司选择采用GS 筛选标记。
商业中所选择Vector 供应商主要是Life technologies 公司的，从pcDNA3系列到现在Freedom pCHO1.0，其大小由原来的4000-5000kp 到现在的近13000kp 。
Freedom pCHO1.0是Life technologies 在2012年开发的一个vector ，大小有12988bp （见下图），具有以下特点：(1)目的基因的轻链和重链可以同时插入一个vector 上面，以前的vector 设计多数是插入一个轻链或者重链；（2）它在可插入的轻链或者重链的前面设计的启动子在CMV 基础上分别进行较大的改善；（3）它具有两个筛选标记，以前的vector 仅仅设计了一个筛选标记。
图-1 Freedom pCHO1.0图谱Figure-1 Freedom pCHO1.0 profile由于vector是细胞株筛选非常关键的一个环节，很多公司具有自主知识产权的vector，当然在密码子、启动子等元件会做很多优化和工作，最终得到一个高表达的vector。
同时，在信号肽选择方面，也是非常关键，通常很多公司会采取现有应用于单克隆抗体药物信号肽专利，将几个专利中的信号肽进行初步筛选适合于自己项目的信号肽。
也有大型公司开发属于自主知识产权的信号肽。
3.转染方法常用于哺乳动物细胞转染方法：磷酸钙法、阳离子脂质体法、阳离子聚合物法和电穿孔法，在工业界使用最多的应该电穿孔法，它是通过物理电流细胞膜形成瞬时孔洞，DNA沿孔洞进入细胞，随机整合细胞染色体。
另外，随着技术的发展，也有定点整合技术，即DNA直接定点整合到CHO细胞染色体某一位点，但由于技术成熟度以及项目的差异性，还未在工业界广泛推广使用。
4.单克隆筛选技术CHO细胞转染之后，通常会加压一段时间做一个clone pool或者minipool，然后进行单克隆筛选。
结合笔者经验，主要简单介绍Puromycin、G418、MTX以及MSX等筛选压力原理及浓度范围。
筛选标记原理Puromycin 它为氨基糖甙类抗生素，通过干扰核糖体功能阻断哺乳动物细胞的蛋白质合成，来自链霉菌的pac基因具有解除puromycin毒性的作用。
G418 它是一种氨基糖苷类抗生素，是稳定转染最常用的抗性筛选试剂之一。
MTX 它为叶酸拮抗剂，在细胞内经过转换后可抑制 DHFR的活性，抑制核酸合成，引起细胞毒性。
文献报道称，随着MTX浓度的增加，绝大多数细胞死亡，但在极少数幸存下来的抗性细胞中，DHFR基因得以扩增，目的基因拷贝数随着增加，提高表达量。
MSX 它为谷氨酰胺合成酶基因GS系统压力。
谷氨酰胺合成酶（GS）扩增系统是新近发展的更有效的系统，具有更高的扩增效应。
筛选标记Puromycin G418 MTX MSX浓度范围10ug/ml-50ug/ml 200ug/ml-700ug/ml25nM-1000nM 25uM-500uM哺乳动物细胞筛选稳定的细胞株常用的方法主要有以下几种：96-孔或384-孔单克隆有限稀释法，流式细胞仪法，Clone Pix system筛选法，Beacon单细胞光导系统筛选法等。
根据ICH Q5D以及FDA、EMA/CHMP 等指南，对于单克隆源性越来越重视，所以在单克隆筛选的时候，很多公司会进行单克隆影像学拍照，即在克隆形成的时候证明克隆确定是由单个细胞形成而来，对于IND申报材料对于单克隆源性更有说服力。
对于单克隆影像学拍照仪器主要有：MolecularDevices公司的CSI（Cell SelectImager）仪器、Solentim公司的CellMetric或Cell Metric CLD。
很多大型公司通常采用以下组合形式筛选单克隆，确保为单个细胞形成单克隆：筛选方式1 传统方法：两轮有限稀释法（小于0.5 cell/well）2 一轮有限稀释法（小于0.5 cell/well）同时影像学拍照证明单克隆3 流式细胞仪法同时影像学拍照证明单克隆4 流式细胞仪法，加一轮有限稀释法（小于0.5 cell/well）5 两轮ClonePix system筛选6 一轮ClonePix system筛选，加一轮有限稀释法（小于0.5 cell/well）7 Beacon单细胞光导系统筛选法其中第7点单克隆筛选方法，是最近一两年出来新筛选仪器方法，是美国BERKELEY LIGHTS公司研发的一款集抗体研发和细胞株开发一体的仪器，有很多大型公司正在采用这一新技术进高效抗体研发和细胞株开发。
5.单克隆筛选评价总结来看，个人认为筛选克隆一般遵循以下几点：（1）克隆产率高低。
在早期筛选克隆时候，我们最关注的是titer 的高低，同时Qp（Cellspecific productivity，单位时间单个细胞所表达的抗体量）也需要关注，工业上所用的克隆Qp一般在20-100pg/cell/day。
在孔板期间titer的检测一般通过Elisa法或者HTRF （Homogeneous Time Resolved fluorescence）均相时间分辨荧光技术的简称）方法，后者是目前高通量筛选克隆常用的检测方法。
HTRF技术室对TR-FRET技术的进一步改良，提供了更高的灵敏度和稳定性，为法国Cisbio Bioassays公司的专利技术。
它是一种竞争结合分析的方法，而Elisa是亲和结合分析的方法。
最近又有一种新的微量检测方法：ForteBio Octet分析方法，它的基本原理是微量的protein A的原理，与Elisa相比，Octet平台自动化程度高，测定的速度快，更贴近摇瓶和反应器种细胞表达量测定的方法，但其费用可能偏高，暂时没有得到广泛地应用到测定孔板titer。
（2）克隆生长状态。
一般在工业上CHO细胞的翻倍时间一般15-24小时，在批次培养或者流加培养的时候，平台期能够尽量长些。
（3）克隆稳定性。
筛选的克隆到达摇瓶之后，建立RCB之后，应该尽快做稳定性试验，考虑克隆的稳定性，一般会考察到60代。
稳定性包括：（a）生长稳定性即翻倍时间的稳定性；（b）表达稳定性即titer或者Qp的稳定性；（c）遗传稳定性。
（4）抗体质量考察。
早期克隆筛选的时候，一般会考察：（a）cDNA序列的鉴定、肽图分析、CE-SDS，分子完整性质谱等，主要避免抗体氨基酸序列突变或丢失的克隆，确定蛋白分子正确性；（b）SEC分析，避免容易形成多聚体的克隆；（c）糖型分析，有的单抗中糖基化对活性非常敏感，避免一些糖型较差的克隆；（d）IEF或者iCIEF，离子交换色谱HPLC分析法，避免一些产生高酸或高碱变体克隆等。
还有其项目蛋白本身属性关键质量进行分析，提前了解候选克隆特性。
（5）前面的四点可以在摇瓶中进行，但在选定一定数量的克隆需要进入反应器进行评价，主要是考察生长、表达和质量等。