防腐剂苯甲酸和山梨酸的高效液相色谱分析
应用高效液相色谱法测定食品中3种防腐剂的含量
应用高效液相色谱法测定食品中3种防腐剂的含量摘要：近年食品抽检中发现食品防腐剂超标使用，因此了解常见食品中防腐剂含量，可为食品安全监管提供参考。
采用高效液相色谱法对糖果、中式糕点及酱卤肉制品中苯甲酸、山梨酸及脱氢乙酸含量进行测定分析。
结果表明，中式糕点均含有苯甲酸，属于违法添加苯甲酸类防腐剂的食品；酱卤肉制品山梨酸含量超过国家标准规定的限值；其他食品的苯甲酸、山梨酸和脱氢乙酸含量均符合国家标准规定。
可见，苯甲酸、山梨酸存在超标使用问题，需要加强抽样检查监督管理力度，增加食品安全水平。
关键词：苯甲酸；山梨酸；脱氢乙酸；高效液相色谱随着经济水平的发展和科技水平的提高，市场上不断出现各式各样、色彩鲜明、可口美味、形状各式的食品，而多数食品易受微生物影响发生腐败变质，但为了到达更好的贮藏效果，会人为的在食品中适量添加如苯甲酸、山梨酸、脱氧乙酸等常用的食品防腐剂已达到增加食品储存时间的目的。
在国家发布的GB2760《食品添加剂使用标准》中就对所有类型的防腐剂在各种食品中的最多用量设定了严苛的要求，在规定范围内添加可以有效保证食品安全问题，但化学防腐剂长期且大量被人体摄入则可能会对人体有影响，如诱发癌症、导致畸变、引起中毒及其他影响人体健康的潜在危害[1,2]。
因此通过合适的方法检测食品中防腐剂的含量对我们来说是非常必要的。
目前国家标准或地方标准中很少有能够同时检测苯甲酸、山梨酸和脱氢乙酸的方法，即使有同时检测的方法但检测过程过于复杂。
本文应用高效液相色谱法对6种食品中苯甲酸、山梨酸、脱氧乙酸3种防腐剂的含量进行测定。
1材料与方法1.1 仪器与试剂本次实验所用样品均采集于本市各镇商场超市、门店，实验所用主要仪器为QC系列超纯水机、离心机、数控超声波清洗器、涡旋混匀仪、电子天平；试验条件是高效液相色谱；试剂为甲醇、苯甲酸、山梨酸、脱氢乙酸。
1.2 实验方法1.2.1 苯甲酸、山梨酸及脱氢乙酸标准溶液配制依次从不同标准储备液中提取出一定数量的溶液，将其掺杂搅拌制作成混合标准液，其浓度是100μg/mL；接着，置于0-4℃环境内贮存备用，用水分别进行稀释，使其变成1μg/mL、5μg/mL、10μg/L、20μg/mL以及50μg/mL的混合标准工作溶液。
高效液相色谱测定食品中苯甲酸、山梨酸、糖精钠方法验证
中图分类号：TS207
XIANDAISHIPIN 现代食品 /137
分析检测 Analysis and Testing
1 实验材料
单位为 g。
1.1 试剂与仪器设备
3 结与结论
苯甲酸标准物质 [1.0 mg·mL-1，编号：GBW(E)100006， 中国计量科学研究院 ]、山梨酸标准物质 [1.0 mg·mL-1， 编号：GBW(E)100007，中国计量科学研究院 ]、糖精 钠标准物质 [1.0 mg·mL-1，编号：GBW(E)100008，中 国计量科学研究院 ]，电子天平、高速冷冻离心机、岛
1.2 仪器条件
3.2 检出限
色谱柱：Venusil C18 Plus 4.6 mm×250 mm，5 μm； 流动相：甲醇 + 乙酸铵溶液 =10+90，pH 为 8.5；流速： 1 mL·min-1；检测波长：230 nm；进样量：10 μL；柱 温：30 ℃。
苯甲酸在 0.25 mg·L-1 时，信噪比大于 3 ∶ 1，检出 限为 0.006 g·kg-1；山梨酸在 0.20 mg·L-1 时，信噪比大 于 3 ∶ 1，检出限为 0.005 g·kg-1；糖精钠在 0.50 mg·L-1 时，信噪比大于 3 ∶ 1，检出限为 0.012 5 g·kg-1。
关键词：山梨酸；苯甲酸；糖精钠；高效液相色谱
Abstract：With the rapid development of modern food industry, benzoic acid, sorbic acid and sodium saccharin are widely used in food. At the same time, excessive use of additives also brings harm to people’s food safety. Therefore, the detection method of additives is very important. Refer to GB 5009.28-2016 national food standards, sorbic acid, benzoic acid and sodium saccharin are widely used in food, the principle of saccharin sodium determination is to use high performance liquid chromatography to determine benzoic acid, sorbic acid and saccharin sodium in food. Through validation of the detection method, the repeatability, detection limit and recovery rate of the method are determined. Under the condition, all the three components were separated completely with a good linear relationship. The standard recovery rate was in the range of 89.4% ～ 102.7%, and the relative standard deviation was 0.02% ～ 0.10%. The adaptability of the laboratory environment and equipment to this method is better determined, which greatly reduces the personnel capacity. The inaccuracy caused by force, environment, equipment and other reasons.
高效液相色谱法测定果酱中的苯甲酸和山梨酸
高效液相色谱法测定果酱中的苯甲酸和山梨酸作者：暂无来源：《中国食品》 2018年第24期摘要：针对果酱中的苯甲酸和山梨酸，本文尝试采用高效液相色谱法进行测定。
从测定结果来看，待测样品中苯甲酸和山梨酸的含量分别为0.0021kg/mg和0.1650kg/mg，回收率分别为99.6％－102.1％和98.7％－101.4％，能够完成快速定性和定量分析，满足食品检测要求。
关键词：高效液相色谱法；果酱；苯甲酸；山梨酸作为国家法律规定允许使用的食品防腐剂，苯甲酸和山梨酸在含量有限的情况下，人食用后不会受到危害。
按照国家规定，果汁果酱等食品中的苯甲酸最大使用量不能超出0.2g/kg，山梨酸不能超出0.5g/kg。
但在实际生活中，为延长果酱等食品的保质期，生产商会添加过量的苯甲酸和山梨酸，致使人体健康受到威胁。
在测定这些物质时，可以采用高效液相色谱法，实现物质的定性和定量分析，从而使食品安全管理得到加强。
一、实验条件与方法1.实验条件。
实验样品为600ml果酱，采用的试剂均为色谱纯，包含磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、氨水、甲醇。
使用符合一级水标准的超纯水，与氨水进行（1+1）等体积混合。
另外，实验需使用中国计量科学研究院生产的苯甲酸、山梨酸标准品。
实验采用的设备有：戴安U3000高效液相色谱仪；梅特勒—托利多仪器有限公司的电子天平；力康发展有限公司的低温高速冷冻离心机；普兰德贸易有限公司的移液器。
2.实验方法。
在对果酱中的苯甲酸和山梨酸进行测定时，由于两种物质均有紫外吸收，因此采用紫外固定波长检测法[1]。
为避免色谱柱因样品中有机物堵塞，还要利用磷酸二氢钾和磷酸氢二钾作为沉淀剂，实现样品前处理，然后提取样品上清液进行测定，达到保护柱子的目的[2]。
在测定过程中，需要使用10μL处理液和混合标准使用液注入色谱仪，完成样品分离，根据标准溶液峰保留时间完成待测物质的定性分析，并通过峰面积完成样品液中待测物质的含量计算。
针对测定样品，需要称取两份各8g放在50mL容量瓶中，加入超纯水，直至容量瓶3/4位置。
高效液相色谱法测定食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的方法验证
066苯甲酸、山梨酸、糖精钠是常用的食品添加剂，也是衡量食品卫生质量的重要指标。
苯甲酸、山梨酸具有防腐保鲜的作用，糖精钠是合成甜味剂，甜度比蔗糖甜300－500倍。
GB2760－2016《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》对这三者的添加范围和限量都有明确的规定，超范围或者超限量使用都是违法的。
GB5009.28－2016《食品安全国家标准 食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的测定》对其检测方法做了规定，有高效液相色谱法和高效气相色谱法，其中高效液相色谱法为第一法仲裁法被广泛应用。
国标方法在使用前要进行方法验证，核查实验室能否满足检测方法的要求。
本研究针对高效液相色谱法测定食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的适用性、线性、检出限、定量限、加标回收率等进行了一一验证，均能够满足检测方法的要求。
一、仪器与试剂1.仪器。
高效液相色谱仪（紫外检测器，Y001），岛津LC－20AT；电子分析天平（Y033），BSA623S－CW，d ＝0.001g。
2.试剂。
苯甲酸钠标准品（唯一性标识3422003，纯度100.0％），北京坛墨质检科技有限公司；山梨酸标准品（唯一性标识3192003，纯度99.9％），北京坛墨质检科技有限公司；糖精钠标准品（唯一性标识3212005，纯度99.5％），北京坛墨质检科技有限公司；甲醇（色谱级），Aigma－Aldrich；乙酸铵（色谱级），aladdin；亚铁氰化钾、乙酸锌（分析纯），天津市天力化学试剂有限公司；实验室用水为自制超纯水。
二、实验与方法1.色谱条件。
（1）色谱柱：Diamonsil Plus 5um C 18，250×4.6mm；检测波长230nm；进样量10uL。
（2）流动相：甲醇＋乙酸铵溶液（0.02mol/L）＝5＋95；流速1mL/min。
高效液相色谱法测定食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的方法验证2.样品前处理。
准确称取约2g（精确到0.001g）试样于50mL具塞离心管中，加水约25mL，涡旋混匀，于50℃水浴超声20min。
高效液相色谱法测定果汁饮料中苯甲酸、山梨酸和糖精钠含量
分析检测高效液相色谱法测定果汁饮料中苯甲酸、山梨酸和糖精钠含量辛明彦（浮山县综合检验检测中心，山西临汾 042600）摘 要：目的：建立高效液相色谱-紫外检测器测定果汁饮料中苯甲酸、山梨酸及糖精钠3种食品添加剂的分析方法。
方法：果汁饮料试样用纯水提取，经Acclaim TM 120 C18色谱柱分离，用紫外检测器测定。
结果：苯甲酸、山梨酸及糖精钠在1.00～50.00 mg/L线性良好，相关系数均大于0.999，3种添加剂的检出限均为0.005 g/kg，定量限均为0.015 g/kg，加标回收率为91.7%～109.0%，RSD为1.29%～3.36%。
结论：该方法前处理简便、分析速度快、准确度高及精密度好，可用于上述3种添加剂的定性、定量检测。
关键词：高效液相色谱；果汁饮料；食品添加剂Determination of Benzoic Acid, Sorbic Acid and Saccharin Sodium in Fruit Juice Drinks by HPLCXIN Mingyan(Fushan County General Inspection and Testing Center, Linfen 042600, China) Abstract: Objective: The method for the determination of benzoic acid, sorbic acid and saccharin sodium in fruit juice drinks by HPLC with UV detector was established. Method: Pear juice beverage samples were extracted with pure water, separated by Acclaim TM120 C18 chromatographic column and determined by UV detector. Result: The linearity of benzoic acid, sorbic acid and saccharin sodium is good at 1.00～50.00 mg/L, the correlation coefficient is greater than 0.999, the detection limit of the three additives is 0.005 g/kg, the quantitative limit is 0.015 g/kg, the recovery is 91.7%～109.0%, and the RSD is 1.29%～3.36%. Conclusion: The method has the advantages of simple pretreatment, fast analysis speed, high accuracy and good precision. It can be used for the qualitative and quantitative detection of the above three additives.Keywords: high performance liquid chromatography; fruit juice beverage; food additives随着我国社会经济发展与食品工业水平的提升，人们对饮料类食品的消费需求日益增长，果汁类饮料以其口味佳、富含维生素与矿物质等优势深受广大消费者喜爱[1-3]。
高效液相色谱法HPLC测定饮料中山梨酸和苯甲酸
卫生化学实验七高效液相色谱法HPLC测定饮料中山梨酸和苯甲酸一、实验目的与要求1、掌握高效液相色谱法测定饮料中苯甲酸和山梨酸的原理和方法2、了解高效液相色谱仪的基本结构和使用方法3、熟悉饮料样品的处理方法二、实验方法与原理苯甲酸和山梨酸广泛用于食品防腐剂,能够引起人的再生障碍性贫血,粒状白细胞缺乏等;因此国家严格限制其使用量;在本实验中,样品首先经过超声和加热除去二氧化碳和乙醇,然后过滤注入高效液相色谱仪,经反相C18液相色谱柱分离后,紫外检测器230 nm波长处检测;以色谱峰的保留时间定性,色谱峰面积在一定范围内与浓度呈线性关系进行定量分析;三、实验仪器与试剂1、仪器：高效液相色谱仪Waters,美国：2487紫外检测器、1525高压输液系统、717进样系统、Waters Breeze色谱工作站；超声震荡仪；100 ml烧杯1个； 1 ml和100 μl移液枪；离心管若干个；离心管架；微孔滤膜0.22 μm;2、试剂：1 甲醇色谱纯；醋酸铵溶液0.02 mol/L,色谱纯；流动相分别超声脱气10 min2 山梨酸储备溶液1.0 mg/ml：准确称取0.2500 g山梨酸,加超纯水定容至250 ml;3 苯甲酸储备液1.0 mg/ml：准确称取0.2500 g苯甲酸,加超纯水定容至250 ml;四、实验步骤1、样品处理碳酸饮料雪碧：吸取10 ml碳酸溶液超声5 min,然后用微孔滤膜0.22 μm 过滤,滤液备用;吸取100 μl滤液于离心管中,并加入900 μl超纯水,混合均匀标记为样品;2、配制标准溶液1 取一定量的苯甲酸储备液,经滤膜过滤于离心管中;吸取滤液50 μl于另一离心管并加入950 μl超纯水,得到50 μg/ml的苯甲酸标准品,做好标记;2 同理得到50 μg/ml的山梨酸标准品,做好标记;3 混合标准品配制：分别吸取500 μl过滤后的苯甲酸和山梨酸储备液于离心管中混合均匀,得到500 μg/ml的混合标准品;吸取50 μl混合标准品500 μg/ml于离心管中并加入950 μl超纯水,得到25 μg/ml的混合样,标记为混标;3、色谱条件：色谱柱：C18反相键合色谱柱流动相：甲醇-0.02 mol/L醋酸铵溶液5 : 95流速：1 ml/min 检测波长：230 nm 进样量10 μl4、标准品和样品测定1 分别进苯甲酸50 μg/ml、山梨酸50 μg/ml标准品,确定保留时间;2 记录混合标准品25 μg/ml的峰面积并按下式计算样品中苯甲酸和山梨酸含量：计算方法：Cx=F×Cs×Ax÷As式中：Cx—为样品中被测物的含量μg/ml；Cs—为苯甲酸或山梨酸标准品的含量μg/ml;F—为稀释倍数；Ax—样品的峰面积；As—标准品的峰面积;五、实验数据记录及结果计算1、苯甲酸、山梨酸标准品的保留时间物质苯甲酸山梨酸保留时间min 6.780 9.1522、混合标准品及样品的峰面积物质苯甲酸山梨酸样品苯甲酸山梨酸峰面积mAUmin 386576 2067181 234426 31073、实验结果计算根据公式：Cx=F×Cs×Ax÷As计算得：C苯甲酸=10×25×234426÷386576=151.6μg/mlC山梨酸=10×25×3107÷2067181=0.375μg/ml雪碧中含有151.6μg/ml的苯甲酸,0.375μg/ml的山梨酸;六、注意事项1、如果被测溶液含有气泡,对测定和仪器的使用均有影响,因此需要将被测溶液超声加热除去二氧化碳;2 、苯甲酸的灵敏波长为230 nm,山梨酸的灵敏波长为254 nm,在此波长测定时苯甲酸的灵敏度较低;因此波长选择230 nm;3、平衡前用甲醇：水5:95冲洗柱子15 min,再用甲醇-0.02 mol/L醋酸铵溶液5:95进行平衡;4、开机顺序：高压输液系统、进样系统、柱温箱、检测器、电脑软件;5 、使用盐做流动相的时候：水：甲醇=95: 5冲洗柱子20 min以上；然后用甲醇冲洗色谱柱20 min以上,保存色谱柱;6 、关机：清洗结束后,点击并将泵流量输入为0,等压力降为0时,关掉泵电源,退出Breeze工作站,再关闭仪器各部分电源及计算机;7、注意在移液枪加完一种试剂之后,一定要记得换枪头。
食品中苯甲酸、山梨酸及其钠盐的液相色谱法测定
食品中苯甲酸、山梨酸及其盐的测定
2020/11/12
6
我国食品苯甲酸（钠）、山梨酸（钾）使用量标准
名称 苯甲酸、 苯甲酸钠
山梨酸、 山梨酸钾
2020/11/12
使用范围
最 大 使 用 量 备注 （g/kg)
酱油、醋、果汁（味）型饮料、果酱（不包含 1.0 罐头）
葡萄酒、果子酒、琼脂软糖
0.8
碳酸饮料
0.2
低盐酱菜、酱类、蜜饯
0.5
苯甲酸和苯甲酸钠同时 使用时，以苯甲酸计， 不得超过最大允许使用 量；以苯甲酸计，塑料 桶装浓缩果蔬汁不得超 过2g/kg
食品工业用塑料桶装浓缩果蔬汁
2.0
酱油、食醋、果酱、氢化植物油、软糖、鱼干 1.0 制品、即食豆制食品、糕点、馅、面包、蛋糕、 月饼、即食海蜇、乳酸菌饮料 低盐酱菜、酱类、蜜饯、果汁（味）型饮料、 0.5 果冻、胶原蛋白肠衣
提取、纯化后，也可利用其化学结构特性采用紫外吸收光谱法进行测定。
2020/11/12
8
食品中苯甲酸、山梨酸及其盐的测定
❖ GB/T5009·29—2003 ❖ 第一法 气相色谱法 ❖ 第二法 高效液相色谱法 ❖ 第三法 薄层色谱法
❖ 本标准规定了酱油、水果汁、果酱等食品中苯甲酸、山梨酸 含量的测定方法。
葡萄酒、果酒
0.6
以山梨酸计，食品工业 用塑料桶装浓缩果蔬汁 不得超过2g/kg；山梨酸 和山梨酸钾同时使用时， 以山梨酸计，不得超过 最大允许使用量
果、蔬保鲜、碳酸饮料
பைடு நூலகம்
0.2
肉、鱼、蛋、禽制品
0.075
食品工业用塑料桶装浓缩果蔬汁
2.0
7
食品中苯甲酸、山梨酸及其盐的测定
液相色谱法检测苯甲酸、山梨酸、糖
液相色谱法检测苯甲酸、山梨酸、糖精钠的疑难详解苯甲酸、山梨酸、糖精钠是衡量食品卫生质量的重要指标，苯甲酸、山梨酸的检测参照GB/，糖精钠的检测参照GB/T，即可开展实验。
苯甲酸、山梨酸、糖精钠虽是较常见的检测项目，但是要得到一个准确可靠的结果，也存在一定的难度，许多新手常出现因对方法理解发生偏差而检测出错的事故。
笔者根据自己多年该方面工作的实际经验出发，以苯甲酸、山梨酸为着重点，从样品前处理、检测仪器的选择、超标时的判断等几个易出问题的方面，进行了详细的阐述。
2样品前处理的注意事项GB/和GB/在文字结构上有缺陷，在涉及用仪器法测定苯甲酸、山梨酸、糖精钠时，只讲述了液体样品的前处理方法，没有涉及对固体样品的前处理。
食品样品往往含有大量的油脂、蛋白质，对提取极为不利；如处理不干净也会污染色谱柱，影响检测工作。
这类样品处理的关键在于如何找到一种较理想的沉淀剂，尽量排除待测样品中的油脂、蛋白质，且不影响待测物组分的回收率。
GB/使用5％硫酸铜溶液沉淀蛋白，对于蛋白质含量较低的食品尚可，对于豆粉、奶粉、月饼等高油脂、高蛋白样品则沉淀效果不理想。
如用10％钨酸钠溶液作为沉淀剂，效果好些；如用10％亚铁氰化钾溶液和20％醋酸锌溶液则效果更理想（这是笔者目前用过最理想的沉淀剂）。
具体操作步骤如下：取一定量样品，捣碎，利用四分法原理称取样品克于50ml比色管中，加水20ml，浸泡、振荡均匀，加入氢氧化钠溶液(1mol/L) ml，加入%亚铁氰化钾溶液，20%乙酸锌溶液，定容，振荡使其充分混匀后,用滤纸初滤除去沉淀物,初滤液过μm微孔滤膜,收集滤液于样品瓶中，样品处理液和标准有溶液各进样5uL 测定。
用这种方法简单易行，接触有机试剂少，重复性和回收率都令人满意；缺点是一定要用液相色谱法检测，有一定局限。
3检测仪器的选择虽然液相色谱仪操作起来比气相色谱仪要复杂，但笔者建议如条件许可仍尽量用液相色谱法检测。
原因如下：液相色谱法所用的样品处理方法远比气相色谱法简单，且不需使用有机试剂。
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防腐剂苯甲酸和山梨酸的高效液相色谱分析
一、实验目的
1、了解高效液相色谱仪的基本结构和工作原理，初步掌握其操作技能。
2、掌握高效液相色谱保留值定性方法和外标定量方法。
二、实验原理
高效液相色谱法是重要的液相色谱法。
它选用颗粒很细的高效固定相，采用高压泵输送流动相，分离、定性及定量全部分析过程都通过仪器来完成。
根据使用的固定相及分离机制的不同，一般将高效液相色谱法分为分配色谱、吸附色谱、离子交换色谱和空间排阻色谱等。
在分配色谱中，组分在色谱柱上的保留程度取决于它们在固定相和流动相之间的分配系数K ；
组分在流动相中的浓度组分在固定相中的浓度
K
显然，K 越大，组分在固定相上停留时间越长，固定相与流动相间的极性差值也越大，因此，相应出现了流动相为非极性而固定相为极性物质的正相液相色谱法和以流动相为极性而固定相为非极性物质的反相液相色谱法。
目前应用最广的固定相是通过化学反应的方法将固定液键合到硅胶表面上，即所谓的键合固定相。
若将正构烷烃等非极性物质（如n-C18烷）键合到硅胶基质上，以极性溶剂（如甲醇和水）为流动相，则可分离非极性或弱极性的化合物。
据此，采用反相液相色谱法可分离防腐剂苯甲酸和山梨酸。
本实验采用外标法测定样品中苯甲酸和山梨酸的浓度。
外标法又称定量进样-标准曲线法，指用欲测组分纯物质配制成不同浓度的标准溶液，取固定量标准溶液进行分析，从所得色谱图上测出响应信号（峰面积或峰高），然后绘制响应信号（纵坐标）对浓度（横坐标）的标准曲线。
分析样品时，取和制作标准曲线时同样量的试样（固定量进样），测得该样品的响应信号，由标准曲线即可查出其浓度。
三、仪器
DIONEX UltiMate3000（USA ） 高效液相色谱仪（配有自动进样器，紫外检测器）。
四、试剂和溶液
苯甲酸（分析纯）、山梨酸（分析纯）、甲醇（色谱纯)、高纯水、0. 02 mol/ L 乙酸铵溶液、标准储备液、标准使用液、标准混合使用液、未知溶液。
五、溶液的配制
(1)乙酸铵溶液(0.02mol/ L ) ：称取1.54g乙酸铵，加水定容至1000mL。
(2)苯甲酸标准储备液：准确称取苯甲酸0.1000g，加少量甲醇完全溶解，移入100 mL的容量瓶中，加水定容，苯甲酸浓度为1.00mg/mL。
(3)山梨酸标准储备液：准确称取山梨酸0.1000g，加少量甲醇完全溶解，移入100 mL的容量瓶中，加水定容，山梨酸浓度为1.00mg/mL。
(4) 苯甲酸标准使用液：吸取苯甲酸10.00 mL，置于100 mL容量瓶中，加水至刻度，苯甲酸为0.10mg/mL。
(5) 山梨酸标准使用液：吸取山梨酸10.00 mL，置于100 mL容量瓶中，加水至刻度，山梨酸为0.10mg/mL。
(6) 标准混合使用液：分别吸取苯甲酸和山梨酸标准储备液10.00 mL，置于100 mL容量瓶中，加水至刻度，苯甲酸和山梨酸浓度均为0.10mg/mL。
六、色谱条件
色谱柱∶chromarex ODS (5μm，20cm×4.6mm )
流动相：甲醇∶乙酸铵( 0. 02mol/L) = 5∶95 (体积比)
流速：1.0m L /min
检测波长：230nm
柱温：25℃
进样体积：10µL
七、实验步骤
1、按从上往下的顺序以下依次打开泵、自动进样器、柱温箱和检测器的电源开关。
2、打开Chromeleon软件界面，连接仪器和软件按钮。
3、按控制面板上的purge阀按钮排气泡。
注意：排气泡应一个通道一个通道排。
4、设定流速、柱温和检测波长（流动相：甲醇/水＝5/95，流动相流速：1.0mL·min-1；检测波长：230nm；柱温：25℃；进样体积：10µL。
）。
注意：开泵时，以0.2 mL·min-1
步进速度（每个平衡点保持0.5分钟以上时间）进行升速，直到设定流速。
等待压力稳定后平衡30分钟以上后打开检测器的紫外灯。
5、通过软件建立相应的程序、方法和样品表。
6、通过软件清洗注射器、缓冲环。
7、待仪器稳定后通过控制面板依次分别进标准使用液、标准混合液和未知试液，记录各色谱图，并重复两次。
8、实验结束，关紫外灯和柱温箱。
清洗柱子和自动进样器，关泵。
9、断开仪器和软件连接按钮，关闭软件。
10、按从下往上的顺序以下依次关闭检测器、柱温箱、自动进样器和泵的电源开关。
八、数据及处理
1、记录苯甲酸和山梨酸各标准液色谱图的色谱峰的保留时间。
2、依次记录标准混合液色谱图上各色谱峰的保留时间。
3、记录未知液各组分色谱峰的保留时间和峰面积，并根据标准混合液各色谱峰的保留时间判断未知液的组分，应用外标法计算未知试样含量。
九、思考题
1、高效液相色谱分析有那几种常用的定量方法？
2、紫外检测器的工作原理？
参考文献：
[1]朱明华.仪器分析（第三版）.北京：高等教育出版社，2000
[2]魏培海,曹国庆.仪器分析.北京：高等教育出版社，2006
撰写人：王新运。