酱油中苯甲酸和山梨酸含量测定

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苯甲酸山梨酸的测定方法

实验十七、酱油中山梨酸、苯甲酸的测定1、目的与要求掌握酱油、水果汁、果酱中山梨酸、苯甲酸的测定原理及方法。

2、原理样品中的苯甲酸在酸性条件下蒸馏，馏出液剧烈氧化除去杂质，再次蒸馏后，所得苯甲酸在220nm处有最大吸收，它的吸光度与浓度的关系符合比尔定律，因此可以据此定量测定。

同时山梨酸在酸性条件下也能随水蒸汽一起蒸馏出来，可在酸性溶液中，用蒸汽蒸馏的方法将样品中的山梨酸蒸馏出来，并除去非挥发性的干扰物质。

山梨酸在弱氧化条件下氧化成丙二醛，再与硫代巴比妥酸反应，生成红色的化合物。

其颜色的深浅与山梨酸含量成正比，可以比色测定之。

3、仪器与试剂3.1 仪器3.1.1 蒸馏设备。

3.1.2 紫外可见分光光度计。

3.2 试剂3.2.1 无水硫酸钠。

3.2.2 85%正磷酸。

3.2.3 0.034mol/L重铬酸钾溶液：溶解4.9g重铬酸钾于水中，稀释到500mL。

3.2.4 2mol/L硫酸溶液：稀释66.5mL浓硫酸至500mL。

3.2.5 氢氧化钠溶液：1mol/L、0.1mol/L、0.01mol/L。

3.2.6 0.5%重铬酸钾溶液。

3.2.7 0.5%硫代巴比妥酸溶液：称取硫代巴比妥酸0.5g，加入20mL水，再加1mol/L 氢氧化钠溶液10mL，用玻璃棒搅拌使之溶解，然后加入1mol/L盐酸11mL，用水稀释至100mL，摇匀。

3.2.8 0.15mol/L硫酸：取浓硫酸1mL加入到100mL水中，并用用水稀释至120mL。

3.2.9 山梨酸标准溶液：精密称取在105℃干燥至恒量的山梨酸0.0500g用0.1mol/L 氢氧化钠溶液溶解后，移入500mL容量瓶中，加0.1mol/L 氢氧化钠溶液至刻度，摇匀，每毫升含山梨酸100μg。

临用时取1mL置于50mL容量瓶中，加入0.01mol/L氢氧化钠溶液到刻度，摇匀，每毫升含山梨酸2μg。

3.2.10 苯甲酸标准溶液：准确称量经过干燥的苯钾酸0.1000g，溶于0.1mol/L氢氧化钠溶液中，以水定容至1000mL，每毫升溶液相当于苯甲酸0.1mg。

食品中防腐剂苯甲酸和山梨酸的测定.

实验9.3 食品中防腐剂苯甲酸(钠和山梨酸(钾的测定薄层色谱法一、实验目的掌握薄层色谱定性和斑点面积半定量测定法。

学会制备聚酰胺薄层板。

二、仪器吹风机层析缸玻璃板10 ×18cm 玻璃板50×80 cm 微量注射器10μL喷雾器三、试剂与试样聚酰胺粉200目乙醚可溶淀粉无水硫酸钠盐酸溶液6mol ? L-14%氯化钠酸性溶液于4%氯化风俗溶液中加入少量mol ? L-1 盐酸溶液展开剂:(1 正丁醇:氨水:无水乙醇=7:1:2(2异丙醇:氨水:无水乙醇=7:1:2显色剂:0.04%溴甲酚紫的50%乙醇溶液用0.1mol ? L-1氢氧化钠调至PH=8苯甲酸标准溶液:精密称取苯甲酸0.2000g ,用少量乙醇溶解后移入100mL 容量瓶中,并用乙醇稀释至刻度摇匀,此溶液每亳升相当于2mg苯甲酸。

山梨酸标准溶液:精密称取山梨酸0.2000g ,用少量乙醇溶解后移入100mL 容量瓶中,并用乙醇稀释至刻度摇匀,此溶液每亳升相当于2mg 山梨酸试样酱油、水果汁、果酱等四、实验步骤1、试样提取—试样溶液的制备称取 2.5g 混合均匀的试样,置于25mL 带塞量筒中,加0.5mL , 6 mol? L-1盐酸酸化,用乙醚提取两次(15mL 、10mL 每次振摇1min , 将上层乙醚提取液吸入另一25mL 带塞量筒中, 合并乙醚提取液。

用3mL4%氯化钠酸性溶液洗涤两次,静置15min ,乙醚层通过无水硫酸钠脱水后过滤于25mL 容量瓶中。

加乙醚稀释至刻度, 摇匀。

吸取10.00mL 乙醚提取液分两次置于10mL 离心管中, 在约40℃水浴上除去乙醚, 加入0.1mL 乙醇溶解残渣,制成试样测定液备用。

2、聚酰胺粉板的制备称取 1.6g 聚酰胺粉,加4g 可溶性淀粉,加15mL 水,研磨3~5min,使其均匀即可涂10×18cm 厚度0.3mm 的薄层板两块。

涂好的薄层板置于水平大玻璃板上, 于室温干燥后, 于80℃ 干燥1h 取出,置于干燥器中保存。

苯甲酸和山梨酸的测定

食品中苯甲酸和山梨酸的检测摘要：近年来食品安全卫生已成为社会、政府关注的焦点之一。

食品安全已越来越引起广大消费者的密切关注和担忧。

目前我国每年食物中毒报告例数约2万人，但据专家估计实际数量要比这个数字大10倍左右。

食品安全问题不仅涉及广大消费者的健康，还涉及相关企业的经济效益和市场空间，关系到整个食品行业的发展。

苯甲酸可与人体内的氨基乙酸结合生成马尿酸而随尿液排出体外。

如过量摄入苯甲酸和苯甲酸钠，将会影响肝脏酶对脂肪酸的作用，其次苯甲酸钠中过量的钠对人体血压、心脏、肾功能也会产生影响。

特别是对心脏、肝、肾功能弱的人群而言，苯甲酸和苯甲酸钠的摄食是不适合的嘲。

另外还会出现代谢性酸中毒、惊厥和气喘等病症。

在体外测定中还可以测到一些弱断裂剂的放射性。

苯甲酸及其钠盐因为有叠加中毒现象的报道，在使用上有争议，虽仍为各国允许使用，但应用范围愈来愈窄。

日本的进口食品中就限制使用，甚至部分禁止使用，日本已停止生产。

但因价值低廉，在中国仍作为主要防腐剂使用。

山梨酸具有较低的毒性，是迄今为止国际公认的最好的防腐剂，已经成为了西方发达国家的主流防腐剂。

但事实上，现在已经报道了许多案例(荨麻疹和假过敏)说明人体中对过多的山梨酸所带来的危害。

由于山梨酸和苯甲酸在食品中的广泛使用,所以在此讨论苯甲酸和山梨酸的检测以技术及以及各种检测技术的利弊。

1防腐剂的检测在食品工业中，作为防腐剂，不能影响人体正常的生理功能，一般说来，在正常规定的使用范围内使用食品防腐剂对人体没有毒害或毒性极小。

因此，食品防腐剂的定性与定量的检测在食品安全性方面是非常重要的。

目前，测定防腐剂的方法主要有：薄层色谱法、高效液相色谱法、毛细管电泳法、气相气谱法等1.1苯甲酸和山梨酸各种检测方法1.1.1高效薄层色谱法和高效液相色谱法M．Thomassin等人曾经采用高效薄层色谱法和高效液相色谱法对尼泊金酯类作过检测，实验发现高效薄层色谱法的相对标准偏差要大于高效液相色谱法，但是高效薄层色谱法对于尼泊金酯类的定量就更为快速。

HPLC法测定酱油中的苯甲酸和山梨酸

山梨酸
山梨酸/山梨酸盐类山梨酸（Sorbic acid，SA）又称花楸酸，为白色针状晶体，易溶于乙醇、乙醚等，不溶于水；性质稳定，见光、热不易分解，但长期暴露在空气中则易因氧化而着色。山梨酸及其钾盐是当前市场上最常用的酸性食品防腐剂，防腐原理为：有效抑制微生物体内脱氢酶循环系统，从而抑制微生物代谢，达到防腐作用。在酸性介质中，对霉菌、细菌、酵母菌和部分杆菌生长发育有良好的抑制作用，防腐效果明显高于苯甲酸类，且有效稳定，不影响食品的外观和使用价值。山梨酸是一种国际公认的安全高效防腐剂，毒副作用远低于苯甲酸类防腐剂，甚至不及同等量的 Vc 和食盐，对人体不会产生致畸和致癌作用，故已成为许多国家的首选防腐剂，但过度摄取也会影响人体健康。
防腐剂作用机理主要有以下几个方面：
• 1、能使微生物的蛋白质凝固或变性,从而干扰其生长和繁殖 • 2、改变细胞膜、细胞壁的渗透性，使微生物体内的酶类和代谢物溢出细胞,导致其失活 • 3、进入生物体内的酶系,抑制酶的活性,破坏其正常代谢 • 4、对微生物细胞原生质部分的遗传机制产生影响。
苯甲酸
• 苯甲酸/苯甲酸盐类苯甲酸（Benzoic acid，BA）又称安息香酸，为无色或白色鳞片状或针状晶体，略微有苯甲醛气味，易溶于乙醇、乙醚、苯、氯仿等有机溶剂，微溶于水。 • 苯甲酸及其钠盐是使用较早的一类酸性食品防腐剂，其防腐原理为：使微生物细胞的呼吸系统发生障碍，阻碍细胞膜的正常生理作用，抑制微生物体内的酶活性，破坏微生物的正常代谢；在酸性条件下（p H2.5~4.0 最佳），苯甲酸及其钠盐可有效抑制霉菌、酵母和细菌活性。 • 有调查显示，人体过量食用苯甲酸及其盐类，会出现肝脏的代谢功能障碍，人体血压升高，心脏、肾功能异常等不良现象，甚至会引发肌肉酸中毒、昏厥和哮喘等病症（WHO 1997），故其应用范围日益缩小，有国家已全面取缔其在食品中的应用。

HPLC法测定酱油中苯甲酸、山梨酸的含量及六省酱油样品测定结果分析

HPLC法测定酱油中苯甲酸、山梨酸的含量及六省酱油样品测定结果分析张国跃;乔蓉霞;齐化元【摘要】目的:建立HPLC法测定酱油中苯甲酸、山梨酸含量的方法,分析各省添加状况.方法:采用HPLC法测定酱油中苯甲酸、山梨酸的含量.色谱柱:C18250mm×4.6mm,5-10μm;流动相:甲醇:0.02mol/L乙酸铵溶液(5:95);流速:1.0mL/min.结果:苯甲酸、山梨酸进样量分别在0.20396-3.50947μg和0.2-3.0μg范围内,与峰面积呈良好的线性关系.回归方程分别为Y=3E+06X-80251,r=1;Y=5E+06X-158903,r=1;苯甲酸平均回收率为98.31%,RDS=1.43%;山梨酸平均回收率为90.26%,RDS=2.82%.结论:该测定方法简单、快速、准确,适用于大批量样品的快速分析;六省酱油中均存在不同程度添加苯甲酸、山梨酸的情况.【期刊名称】《中国医药科学》【年(卷),期】2011(001)008【总页数】3页(P37-38,40)【关键词】HPLC法;酱油;苯甲酸;山梨酸【作者】张国跃;乔蓉霞;齐化元【作者单位】陕西省食品药品检验所,陕西,西安,710061;陕西省食品药品检验所,陕西,西安,710061;陕西省卫生监督所,陕西,西安,710054【正文语种】中文【中图分类】R155.5酱油是我国使用最广的调味品之一，由于酱油营养丰富，适于微生物生长繁殖，为了防止酱油腐败变质，保持酱油的鲜度和良好的品质，酱油中一般都会添加防腐剂苯甲酸、山梨酸。

随着现代食品工业的发展，食品添加剂的超量和超范围使用现象十分严重，对食品添加剂的检测也越来越受到人们的重视。

本实验用高效液相色谱法同时测定酱油中苯甲酸、山梨酸的含量，方法简便、快捷，适用于大批量样品的快速检测。

本次试验共收集到六个省份共计180批样品（每省30批），测定结果表明，六个省份酱油中均有不同程度添加苯甲酸、山梨酸的情况。

采用向量-子空间夹角判据测定酱油中的苯甲酸和山梨酸

ＣＩ－ＩＥＮＣｈｅｎｇ，ＳＵＨｕｉ，ＹＡＯＺｈｉ－ｘｉａｎｇ，ＦＡＮＧＦｅｎｇ，ＬＩＵＬｉｕ，ＬＩＡＮＧＭｅｉ
（ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｃａｌＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ＧｕａｎｇｘｉＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｌｉｕｚｈｏｕ５４５００６）
关键词：向量一子空间夹角；紫外分光光度法；苯甲酸；山梨酸
中图分类号：ＴＳ２０７．３文献标识码：Ａ文章编号：１００６～２５１３（２０１３）０５— ０２２３— ０５
ｃｒｉｔｅｒｉｏｎｉｎｔｈｅｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎＶｅｃｔｏｒ — — ｓｕｂｓｐａｃｅａｎｇｌｅｏｆｂｅｎｚｏｉｃａｃｉｄａｎｄｓｏｒｂｉｃａｃｉｄｉｎｓｏｙｓａｕｃｅ
ｓｔｕｄｙ，ｔｈｒｅｅｍｕｌｔｉ —ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈｏｆＵＶｓｐｅｃｔｒａｌｌｉｂｒａｒｉｅｓｗｅｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄｔｏｃｏｍｐｕｔｅｔｈｅｃｏｎｔｅｎｔｏｆｂｅｎｚｏｉｃａｃｉｄａｎｄｓｏｒ — ｂｉｃａｃｉｄｉｎｓｏｙｓａｕｃｅｂｙＶｅｃｔｏｒ～ｓｕｂｓｐａｃｅａｎｇｌｅｃｉｒｔｅｉｒｏｎ．ＴｈｅｌｉｂｒａｒｉｅｓｉｎｃｌｕｄｅＵＶｓｐｅｃｔｒａｌｌｉｂｒａｉｅｒｓｏｆｓｏｙｓａｕｃｅｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ，ｂｅｎｚｏｉｃａｃｉｄａｎｄｓｏｒｂｉｃａｃｉｄｓｔａｎｄａｒｄｃｏｍｐｏｕｎｄｓａｎｄｓａｍｐｌｅｓ．Ｂｅｎｚｏｉｃａｃｉｄａｎｄｓｏｒｂｉｃａｃｉｄａｒｅｆｒｅｅｌｙｓｏｌｕｂｌｅｉｎｏｒｇａｎｉｃｓｏｌｖｅｎｔａｎｄｓｌｉｇｈｔｌｙｓｏｌｕｂｌｅｉｎｗａｔｅｒ，ｔｈｅｓｏｄｉｕｍｂｅｎｚｏａｔｅａｎｄｐｏｔａｓｓｉｕｍｓｏｒｂａｔｅｉｎｓｏｙｓａｕｃｅｗｅｒｅｔｕｎｅｒｒｌｉｎｔｏｂｅｎｚｏｉｃａｃｉｄａｎｄｓｏｒｂｉｃａｃｉｄｉｎａｃｉｄｉｃｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓａｔｆｉｒｓｔ．Ｔｈｅｎｔｈｅｂｅｎｚｏｉｃａｃｉｄａｎｄｓｏｒｂｉｃａｃｉｄｗｅｒｅｅｘｔｒａｃ — ｔｅｄｆｒｏｍｓｏｙｓａｕｃｅｗｉｔｈｅｔｈｙｌｅｔｈｅｒａｓｅｘｔｒａｃｔｉｏｎａｇｅｎｔ．Ａｎｄｅｔｈｙｌｅｔｈｅｒｗａｓｅｖａｐｏｒａｔｅｄｂｙｗａｔｅｒｈｅａｔｉｎｇ，ｔｈｅｎｔｈｅｅｘ —

紫外光度法同时测定酱油中苯甲酸和山梨酸含量_汪晓璇

— １０８ —
第４０卷第８期中国调味品
２０１５年８月
ＣｈｉｎａＣｏｎｄｉｍｅｎｔ
分析检测
目前，同时测定苯甲酸和山梨酸的方法主要有高效液相色谱法、气相色谱法、紫外分光光度法等。［２－４］色谱法是有效的多组分分析方法，但这些方法仪器昂贵，分析成本高，且操作繁杂费时；分光光度法由于对仪器要求低，重现性好等特点而广泛应用于食品分析中。本研究根据苯甲酸和山梨酸紫外吸收光谱的特征，用多元线性回归法处理多波长下的测量数据，不经分离直接同时测定酱油中防腐剂苯甲酸和山梨酸含量。
中图分类号：ＴＳ２６４．２１文献标志码：Ａ文章编号：１０００－９９７３（２０１５）０８－０１０８－０３
ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１０００－９９７３．２０１５．０８．０２５
ＳｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓＤｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆＢｅｎｚｏｉｃＡｃｉｄａｎｄＳｏｒｂｉｃ
第４０卷第８期中国调味品
２０１５年８月
ＣｈｉｎａＣｏｎｄｉｍｅｎｔ
分析检测
紫外光度法同时测定酱油中苯甲酸和山梨酸含量
汪晓璇１，汪念秋２，刘晓曦３，汪显阳３＊
（１．对外经济贸易大学，北京１０００２９；２．天津中医药大学，天津３００１９３；３．安徽医科大学，合肥２３００３２）
0.8
苯甲酸
山梨酸
１材料与方法

高效液相色谱法测定食醋和酱油中苯甲酸钠和山梨酸钾含量实验报告

高效液相色谱法测定食醋和酱油中苯甲酸钠和山梨酸钾含量摘要：【目的】用高效液相色谱法测定食醋和酱油中苯甲酸钠和山梨酸钾含量。

柱(150× mm，5μm，phenomenex)为色谱柱；【方法】以Hyperclone BDS C18检测波长215~230nm，进样量10μL，流动相：甲醇：L?乙酸铵(35：65)，流量min，柱温30℃【结果】：食醋中的苯甲酸钠含量为mol，酱油中的苯甲酸钠含量为mol，未见则出山梨酸钾。

【结论】：高效液相色谱法具有高速、高效、高灵敏度的优点，所以数据准确，用外标法计算结果操作简单，计算方便，得出样品中苯甲酸钠的含量。

关键词：高效液相色谱法外标法苯甲酸钠山梨酸钾一、前言苯甲酸钠，化学式：C6H5O2Na，是苯甲酸的钠盐，苯甲酸钠是很常用的防腐剂，有防止变质，延长保质期的效果。

山梨酸钾别名2,4-己二烯酸钾，是山梨酸的钾盐，也是防腐剂。

本实验采用高效液相色谱法对酱油和醋中的苯甲酸钠和山梨酸钾的含量测定，方法简便快速，实用于苯甲酸钠和山梨酸钾的定量分析。

苯甲酸结构式：山梨酸钾结构式：二、实验目的和实验原理.实验目的：（1）了解高效液相色谱仪基本结构和工作原理，以及初步掌握其操作技能；（2）学习高效液相色谱保留值定性方法和外标法的标准曲线定量方法；（3）掌握RP-HPLC法对食品中苯甲酸钠和山梨酸钾的测定方法；．实验原理：将样品加热去除其中的二氧化碳和乙醇，用（1+1）氨水调pH值近中性，过滤后进高效液相色谱仪，进行反相色谱C18柱分离后，根据保留时间和峰面积进行定性定量分析。

三、仪器与试剂及试剂处理. 仪器：高效液相色谱仪【高压输液泵LC-6A，检测器SPD-10A，保温箱CPD-10AS，进样阀7725I】；电子天平；纯水仪；离心机；超声波清洗机。

．试剂：（1）色谱甲醇经滤膜μm过滤；（2）（1+1）氨水：氨水与水等体积混合；（3）乙酸铵溶液L：称取乙酸铵，加水溶解并定容至1000ml，经过（μm）过滤；（4）碳酸氢钠溶液20g/L：称取2g碳酸氢钠（优纯级），加水至100ml，振荡溶解；（5）苯甲酸钠标准储备液：准确称取苯甲酸钠，加碳酸氢钠溶液（20g/L）5ml，加热溶解，移入100ml容量瓶中，加水定容至刻度。

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酱油中苯甲酸和山梨酸含量测定
摘要：目的：采用碱溶液反相萃取—高效液相色谱法（HPLC）测定酱油中苯甲酸和山梨酸。

方法：以国标萃取法为基础，再对其用碱溶液进行反萃取的方法，对酱油样品进行前处理，通过加内标物的方法提高实验的精确度。

结果：苯甲酸和山梨酸的线性回归相关指数都大于0.99、最小检出限（LOD）都低于0.1ppm，加标回收率皆大于84%，相对偏差皆小于16%。

结论：该方法灵敏、可靠，可用于酱油中苯甲酸和山梨酸的快速定量检测。

关键词：反相萃取；高效液相色谱法；酱油；苯甲酸；山梨酸
酱油是我国传统的、富有特色的、使用最广的、味道鲜美的调味品，它赋予食品以适当的色、香、味，具有杀菌治病、调味之功用。

由于酱油营养丰富，适于微生物生长繁殖，而微生物又是到处不在无孔不入，所以细菌、霉菌和酵母之类微生物的侵袭通常是导致酱油败坏的主要因素。

为了保藏酱油，防止酱油腐败变质，保持酱油的鲜度和良好的品质，达到其对保质期的要求，酱油中一般都使用食品常用防腐剂—苯甲酸和山梨酸，但过多防腐剂会严重损害人体健康，国家对防腐剂的使用有严格限量规定，因而检测酱油中防腐剂的含量具有重要意义。

目前酱油中苯甲酸和山梨酸的测定方法主要有气相色谱法、高效液相色谱法和薄层色谱法，其中高效液相色谱法因其仪器精确度高，在苯甲酸和山梨酸的检测中最常用。

对于酱油的前处理国标是对其先进行酸化，再通过乙醚进行萃取，除此之外还有其他诸多方法，如对粘度比较大的进行固相萃取、通过加入亚铁氰化钾和乙酸锌溶液沉淀蛋白质、脂肪并过滤后进行测定、还有就是本文所用的对国标处理后的样品进行碱溶液反相萃取。

这样可以大大的减少样品中的杂质，从而减少了杂质峰对高效液相色谱检测的影响。

另外本文所采用的内标法的处理方法是一个创新之举，避免了外标法测定时前处理萃取不完全以及其他处理过程带来的损失从而大大的提高了检测的准确度。

1 实验部分
1.1 溶液配制
乙酸铵溶液( 0. 02 mol /L) : 准确称取乙酸铵1. 542 g, 用水溶解, 定容至1 000 mL, 经0. 45Lm 膜过滤。

苯甲酸、山梨酸、肉桂酸储备液（1000lg/ml）：准确称取100mg苯甲酸、山梨酸对照品，50mg肉桂酸标准品与3个不同的50ml小烧杯中，加甲醇溶解后，转移到对应的100ml、100ml、50ml的容量瓶中，苯甲酸、山梨酸对照品加水稀释至刻度，肉桂酸标准品加甲醇稀释至刻度。

置于4℃冰箱中。

苯甲酸、山梨酸混合溶液的标准溶液：用移液管分别移取苯甲酸储备液和山梨酸储备液各2ml、4ml、6ml、8ml、10ml于5个不同的100ml容量瓶中，再分别向个容量瓶中加5ml肉桂酸储备液，然后加超纯水稀释至刻度，由此得到20ppm、40ppm、60ppm、80ppm、100ppm的苯甲酸和山梨酸混合溶液的一系列标准溶液，其中每份苯甲酸、山梨酸混合溶液标准溶液中均含内标物肉桂酸50ppm。

1.2 样品的制备
1.2.1 乙醚萃取
称取1g左右（精确至0.0001g）酱油样品与25ml带塞锥形瓶中，加2.5ml 100ppm肉桂酸标液，0.25ml 的0.1mol/l盐酸溶液混均，加乙醚9ml，超声一分钟，静置分层，用针筒吸取乙醚萃取液至10ml大试管中。

1.2.2 碱液反萃取
向乙醚萃取液试管中加1ml的0.1mol/l的氢氧化钠溶液反萃取1分钟，静置分层，乙醚层尽量吸去，将氢氧化钠萃取液试管加入40℃水浴中10分钟挥去残留乙醚，将溶液5ml容量瓶中，加水稀释至刻度，使用前测定ph（ph需大于3，否则会损坏色谱柱），过0.45lm水系滤膜2次，供液相色谱仪分析。

1.3 色谱条件
色谱柱（vensuilXBP-C18,250nm*4.0㎜*5μm）
流动相：甲醇/乙酸铵(30:70)
柱温：25℃
流速：1.0ml/min
苯甲酸检测波长223nm、山梨酸检测波长254nm、二者共存检测波长225nm.
2 结果与讨论
2.1 紫外检测器波长选定
由检测结果可知二者共存检测波长大概在225nm处
2.2 线性范围与检出限
分别用移液管分别移取苯甲酸储备液和山梨酸储备液各2ml、4ml、6ml、8ml、10ml于5个不同的100ml 容量瓶中，再分别向个容量瓶中加5ml肉桂酸储备液，然后加超纯水稀释至刻度，由此得到20ppm、40ppm、60ppm、80ppm、100ppm的苯甲酸和山梨酸混合溶液的一系列标准溶液，其中每份苯甲酸、山梨酸混合溶液标准溶液中均含内标物肉桂酸50ppm。

依次进样、记录峰面积，以两种物质的峰面积分别除以肉桂酸峰面积对两种标准溶液的浓度除以肉桂酸浓度进行一元线性回归，以及外标法所以要用的峰面积浓度标准曲线见图3、4。

苯甲酸与山梨酸的线性关系良好（见图 1，2)，线性范围，回归方程、相关指数R2 、由检出结果信噪比推算出检测线见图5，6见表1、2。

图 1 图 2
表 1
图 3 图 4
组分回归方程相关指数检出限（ppm ）苯甲酸 y=0.9456x+0.0067 0.9969 0.1 山梨酸 y=0.9922x+0.12 0.9995 0.1
表 2
图 5 0.2ppm 图 6 0.1ppm
2.3 检出结果，加标回收率，精确度第一次测量内标法：
未加标 1.0083g
峰面积 Ax/As Cx/Cs Cx/ppm
含量μg/g
苯甲酸
65983.2
1.0681 1.0587 5
2.94 262.52 山梨酸 7317
3.7
1.1845 1.0666 53.33 264.46 内标物肉桂酸
61775.8
加标1.0384g （内含40μg/mL 苯甲酸山梨酸混合液）
苯甲酸 85010.8
1.8642 1.9006 95.03 山梨酸 93895.1
2.0590 1.9480 97.40 内标物肉桂酸
45602.5
加标回收率： W 苯=（95.03-52.94）/40 *100%=105.2%
W 山=（97.4-53.33）/40 *100%=110.2%
组分回归方程相关指数检出限(ppm) 苯甲酸 y=6894.1x+30364 0.9947 0.1 山梨酸 y=7226.3+53059 0.9976 0.1
外标法：
Cx/ppm 苯甲酸 5.17 山梨酸 2.78
第二次测量
内标法：
未加标 1.0295g
峰面积Ax/As Cx/Cs Cx/ppm 含量μg/g 苯甲酸
303867
.5
1.0364 1.0252 51.26
248.9
6
山梨酸
325751
.1
1.1110 0.9988 49.94 24
2.54 内标物肉桂酸
293194
.6
加标 1.0466g （内含40μg/mL 苯甲酸山梨酸混合液）苯甲酸
437982
.7
1.6782 1.7038 85.19 山梨酸
491666
.3
1.8839 1.7777 88.88 内标物肉桂酸
260988
.3
加标回收率：W苯=（85.19-51.26）/40 *100%=84.83%
W山=（88.88-49.94）/40 *100%=97.35%
外标法：
Cx/ppm
苯甲酸39.67
山梨酸37.74
2.4 讨论
对比内标法的结果和外标法的结果，可看出内标法显然优于外标法，酱油样品的前处理对外标法检测影响很大，但对于内标法，则没有太大的影响，因为酱油的处理中苯甲酸和山梨酸损失的同时内标物肉桂酸也在损失，抵消了处理过程中由于损失带来的误差，但是同时对于内标物的选取则是最大的难点。

通过方法学的考察，证明该方法线性良好、灵敏度高、准确性好、精密度高，苯甲酸和山梨酸的线性回归相干指数都大于0.99、最小检出限都低于0.1ppm加标回收皆大于84%。

可见该方法灵敏、可靠，可用于酱油中苯甲酸和山梨酸的定量检测。