酵母菌的计数方法和应用
酵母菌计数
酵母菌计数简介酵母菌是一种单细胞真核生物，它们在酿酒、发酵和食品加工等过程中起着重要的作用。
为了控制和监测这些过程，我们需要对酵母菌的数量进行准确计数。
本文将介绍几种常用的酵母菌计数方法，并提供一些实用技巧和注意事项。
方法一：显微镜计数法显微镜计数法是最常用且准确的酵母菌计数方法之一。
具体步骤如下：1.取一定数量的酵母菌样品，通常采用培养液或悬浮液。
2.在显微镜下观察样品，并设定合适的倍数。
通常使用40倍或100倍的镜头。
3.使用显微镜的目镜网格或计数室，在一个区域内计数酵母菌的数量。
4.重复以上步骤，直到计数了足够多的区域。
5.将计数得到的酵母菌数量求平均，乘以相应的倍数，得到样品中的总酵母菌数量。
需要注意的是，在进行显微镜计数时，要保持显微镜的透明度，以便更清楚地观察和计数酵母菌。
此外，在计数过程中，应避免重复计数和漏计。
方法二：涂布法涂布法是一种简单快捷的酵母菌计数方法，适用于大批量的样品。
具体步骤如下：1.准备培养基。
选择适合酵母菌生长的培养基，可以是液体培养基或固体培养基。
固体培养基通常是琼脂糖培养基。
2.取一定数量的酵母菌样品，将其均匀地涂布在培养基上。
3.使用细菌铲或棉签，将酵母菌样品均匀涂布在培养基表面。
4.将涂布好的培养基放置在适当的条件下，如温度、湿度等，并进行培养。
5.在适当的培养时间后，观察涂布培养基上酵母菌的生长情况，并计算酵母菌的数量。
涂布法的优点是操作简单、快捷，适用于大样本量的计数。
但由于酵母菌的生长情况可能受到很多因素的影响，因此在进行计数时需要注意控制这些影响因素，如温度、湿度等。
方法三：电子计数法电子计数法是一种利用电子计数器对酵母菌进行计数的方法。
具体步骤如下：1.准备电子计数器。
选择适合的电子计数器，并与适当的软件相结合，以便更准确地进行计数。
2.取一定数量的酵母菌样品，并将其放置在电子计数器中。
3.打开电子计数器，开始对酵母菌样品进行计数。
4.计数完成后，软件会自动计算和显示酵母菌的数量。
霉菌与酵母菌计数方法(2015版药典)
霉菌与酵母菌计数方法1试验菌液得制备与使用(以白色念珠菌为示例)白色念珠菌(0)代↓传代培养↓实验菌液得制备:沙氏葡萄糖琼脂培养基或沙氏葡萄糖液体培养基,培养温度20～２5℃,培养时间2~3天↓计数培养基适用性检查:胰酪大豆胨琼脂培养基,培养温度３0～3５℃,培养时间不超过5天,接种量不大于10０cｆu↓计数方法适用性试验:胰酪大豆胨琼脂培养基(ＭPＮ法不适用),培养温度３０～３5℃,培养时间不超过５天,接种量不大于10０cfu 注:当需用玫瑰红钠琼脂培养基测定霉菌与酵母菌总数时,应进行培养基适用性检查,检查方法同沙氏葡萄糖琼脂培养基1.１菌种试验用菌株得传代次数不得超过５代(从菌种保藏中心获得得干燥菌种为第0代),并采用适宜得菌种保藏技术进行保存,以保证试验菌株得生物学特性。
1。
2菌液制备(按表1规定程序培养各试验菌株)取白色念珠菌得新鲜培养物↓用pH7、0无菌氯化钠—蛋白胨缓冲液或0、9％无菌氯化钠溶液制成适宜浓度得菌悬液取黑曲霉得新鲜培养物↓加入3～５ｍｌ含0.０５%聚山梨酯80得pH7.0无菌氯化钠—蛋白胨缓冲液或0、9％无菌氯化钠溶液,将孢子洗脱↓采用适宜得方法吸出孢子悬液至无菌试管内↓用含0。
05％聚山梨酯80得pＨ7.０无菌氯化钠—蛋白胨缓冲液或0。
９%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度得黑曲霉孢子悬液菌液制备后若在室温下放置,应在2小时内使用;若保存在２~8℃,可在24小时内使用、稳定得黑曲霉孢子悬液可保存在2~８℃,在验证过得贮存期内使用、1。
３阴性对照为确认试验条件就是否符合要求,应进行阴性对照试验,阴性对照试验应无菌生长。
如阴性对照有菌生长,应进行偏差调查、2、培养基适用性检查按表1规定,接种不大于100cｆu得菌液至沙氏葡萄糖琼脂培养基平板↓置表１规定条件下培养↓每一试验菌株平行制备2管或2个平皿↓同时,用相应得对照培养基替代被检培养基进行上述试验↓被检固体培养基上得菌落平均数与对照培养基上得菌落平均数得比值应在0。
酵母菌大小的测定及计数实验流程
酵母菌大小的测定及计数实验流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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酵母菌的计数
* *
16个中格
探究培养液中酵母菌种群数量
♣ 酵母菌的计数 （2）计算： 每毫升培养液中的酵母菌细胞数是多少？ 所数小方格中细胞总数x400x104x稀释倍数 酵母细胞个数/mL= 所数的小方格数
的动态变化
例1 :在用血球计数板（2mm×2mm方格）对某一稀释 50倍样品进行计数时，发现在一个计数室内（盖玻片 下的培养液厚度为0.1mm）酵母菌平均数为16，据此 估算10mL培养液中有酵母菌 2x107 个。
探究培养液中酵母菌种群数量
的动态变化
♣ 酵母菌的计数 （6）讨论：计数前还应有哪些步骤？需注意些什么？
酵母菌培养： ♠培养液配制 ♠灭菌 ♠接种
配制质量分数为5％的葡萄糖溶液（葡 萄糖20g，1000 mL水），分装到5个 烧杯中（200mL/烧杯） 用高压蒸汽灭菌锅将培养液和取样、计 数时所用的滴管分别灭菌。贴标签。 接种时要在酒精灯附近，用灭菌干净的 1mL刻度吸管每次吸取0.1mL酵母菌 母液，往每个烧杯中加入。（注意：滴 加量不要太多，避免初始菌数过多。） 将烧杯置于28℃的恒温箱中培养
的动态变化
探究培养液中酵母菌种群数量
的动态变化
♣ 酵母菌的计数 （4）血球计数板的清洗：
• 使用完毕后，将血球计数板在水龙头上用水柱冲洗， 切勿用硬刷洗刷，洗完后自行晾干或用吹风机吹干。 镜检，观察每个小格内是否有残留菌体或其他沉淀物。 若不干净，则必须重复洗涤至干净为止。
探究培养液中酵母菌种群数量
例2:酵母菌的计数通常用血球计数板进行，血球 计数板每个大方格容积为0.1mm3 ，由400个小 方格组成。现对某一样液进行检测，如果一个 小方格内酵母菌过多，难以计数，应先 稀释 后 再计数。若多次重复计数后，算得每个小方格 中平均有5个酵母菌，则10mL该培养液中酵母 菌总数有 2×108 个。
探究培养液中酵母菌种群数量的变化
探究培养液中酵母菌种群数量的变化1、实验原理：1．在含糖的液体培养基（培养液）中酵母菌繁殖很快，迅速形成一个封闭容器内的酵母菌种群，通过细胞计数可以测定封闭容器内的酵母菌种群随时间而发生的数量变化。
2．养分、空间、温度和有毒排泄物等是影响种群数量持续增长的限制因素。
3．酵母菌计数方法：抽样检测法。
先将盖玻片放在计数室上，用吸管吸取培养液，滴于盖玻片边缘，让培养液自行渗入。
多余培养液用滤纸吸去。
稍待片刻，待细菌细胞全部沉降到计数室底部，将计数板放在载物台的中央，计数一个小方格内的酵母菌数量，再以此为根据，估算试管中的酵母菌总数。
注意：从试管中吸出培养液进行计数之前，要将试管轻轻震荡几次。
仪器介绍：血细胞计数板血细胞计数板的构造血细胞计数板是由一块比普通载玻片厚的特制玻片制成的。
玻片中有四条下凹的槽，构成三个平台。
中间的平台较宽，其中间又被一短横槽隔为两半，每半边上面,刻有一个方格网。
方格网上刻有9个大方格，其中只有中间的一个大方格为计数室其中共有400个小格，供微生物计数用。
这一大方格的长和宽各为1mm,深度为0.1mm,其体积为0.1mm3。
血细胞计数板的使用以计数酵母菌为例(1)样品稀释的目的是便于酵母菌悬液的计数,以每小方格内含有4-5个酵母细胞为宜,一般稀释10倍即可.(2)将血细胞计数板用擦镜纸擦净,在中央的计数室上加盖专用的厚玻片.(3)将稀释后的酵母菌悬液,用吸管吸取一滴置于盖玻片的边缘,使菌液缓缓渗入,多余的菌液用吸水纸吸取,捎待片刻,使酵母菌全部沉降到血细胞计数室内.(4)计数；五点取样法3.计算公式酵母细胞数/ml=每个小格酵母菌数目×400×104×稀释倍数注释：培养的时间不同取样酵母菌的稀释倍数是不同的。
2．方法步骤：提出问题→作出假设→讨论探究思路→制定计划→实施计划→按计划中确定的工作流程认真操作，做好实验记录→分析结果，得出结论→将记录的数据用曲线图表示出来。
霉菌与酵母菌计数方法(2015版药典)
霉菌与酵母菌计数方法1试验菌液的制备和使用（以白色念珠菌为示例）白色念珠菌（0）代↓传代培养↓实验菌液的制备：沙氏葡萄糖琼脂培养基或沙氏葡萄糖液体培养基，培养温度20～25℃，培养时间2～3天↓计数培养基适用性检查：胰酪大豆胨琼脂培养基，培养温度30～35℃，培养时间不超过5天，接种量不大于100cfu↓计数方法适用性试验：胰酪大豆胨琼脂培养基（MPN法不适用），培养温度30～35℃，培养时间不超过5天，接种量不大于100cfu注：当需用玫瑰红钠琼脂培养基测定霉菌和酵母菌总数时，应进行培养基适用性检查，检查方法同沙氏葡萄糖琼脂培养基1.1菌种试验用菌株的传代次数不得超过5代（从菌种保藏中心获得的干燥菌种为第0代），并采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性。
1.2菌液制备（按表1规定程序培养各试验菌株）取白色念珠菌的新鲜培养物↓用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的菌悬液取黑曲霉的新鲜培养物↓加入3～5ml含0.05％聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱↓采用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管内↓用含0.05％聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的黑曲霉孢子悬液菌液制备后若在室温下放置，应在2小时内使用；若保存在2～8℃，可在24小时内使用。
稳定的黑曲霉孢子悬液可保存在2～8℃，在验证过的贮存期内使用。
1.3阴性对照为确认试验条件是否符合要求，应进行阴性对照试验，阴性对照试验应无菌生长。
如阴性对照有菌生长，应进行偏差调查。
2.培养基适用性检查按表1规定，接种不大于100cfu的菌液至沙氏葡萄糖琼脂培养基平板↓置表1规定条件下培养↓每一试验菌株平行制备2管或2个平皿↓同时，用相应的对照培养基替代被检培养基进行上述试验↓被检固体培养基上的菌落平均数与对照培养基上的菌落平均数的比值应在0.5-2范围内，且菌落形态大小应与对照培养基上的菌落一致；被检液体培养基管与对照培养基管比较，试验菌应生长良好3计数方法适用性试验供试液制备：水不溶性非油脂类供试品↓取供试品，用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，或pH7.2磷酸盐缓冲液，或胰酪大豆胨液体培养基↓制备成1:10供试液。
酵母菌数量的测定—显微镜直接计数法
五、数据处理
各中格中的菌数（个）
二室 平均
菌数
A
B
值 （个/
1
2
3
4
5
（个 mL）
） 第一
室 第二
室
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六、思考题 能否利用显微镜直接计数的方法测定
酵⺟菌菌液中的死细菌与活细菌？如果可 以，如何进行？如果不可以，请说明原 因。
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式1：总菌数（个/mL）=A/5×16×10000×B 式2：总菌数（个/mL）=A/5×25×10000×B
三、实验器材 血球计数板、显微镜、盖玻片、滴管、 酿酒酵⺟菌液
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四、实验步骤
1、加样品
•取净洁干燥的血球计数板盖上盖玻片。 •将菌悬液适当稀释（稀释1倍），摇匀。
•用滴管吸取菌悬液，加1～2滴于盖玻片边 缘，让菌液靠毛细渗透作用进入计数室。 •放置5 min左右让计数室充满菌液。
• 如遇酵⺟出芽，芽体大小达到⺟细胞一般时，即作 为两个菌体计算。
• 计算一个样品要从两个计数室中计得的平均数值来 计算样品的含菌量。
• 菌体在血球计数板处于不同空间，要在不同焦距下 才能看全，所以，观察时必须不断调节细螺用自来水冲洗，切勿用硬物洗刷； •镜检观察是否清洗干净； •洗后干燥（晾干、吹干，或乙醇、丙酮等有 机溶剂脱水干燥）。
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血球计数板规格
计数室高度：0.1mm 大方格边⻓：1mm。 每个大方格分成400个小方格。
规格一：每个大方格分成16个中方格，每个中方格又分 成25个小方格。 规格二：每个大方格分成25个中方格，每个中方格又分 成16个小方格。
设五个中方格的总菌数为A，菌液的稀释倍 数为B，规格一、规格二计数板，分别采用式 1、式2计算。
2020版《中国药典》微生物限度计数—酵母菌及霉菌
2020版药典微生物限度计数—酵母菌及霉菌2020版本药典(1)菌液制备取白色念珠菌的新鲜培养物，用0.9%无菌氣化钠溶液制成103cfu/ml的菌悬液；取黑曲霉的新鲜培养物加5ml含0.05% (ml/ml)聚山梨酯80的0.9%无菌氣化钠溶液，将孢子洗脱。
然后，使用移液枪吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05% (ml/ml)聚山梨酯80的0.9%无菌氣化钠溶液制成103cfu/ml的黑曲霉孢子悬液。
菌液制备后保存在2℃冰箱，在24小时内使用。
(2) 计数培养基适用性检査接种不大于l00cfu的白色念珠菌和黑曲霉的菌液至胰酪大豆胨琼脂培养基平板，35℃条件下培养4天；接种不大于l00cfu的白色念珠菌和黑曲霉的菌液至沙氏葡萄糖琼脂培养基平板，25℃条件下培养4天。
每一试验菌株平行制备2管或2个平皿。
同时，用相应的对照培养基替代被检培养基进行上述试验。
(3) 计数方法适用性试验1) 供试液制备取供试品10g，用胰酪大豆胨液体培养基制备成1:10供试液。
2) 接种和稀释按下列要求进行供试液的接种和稀释，制备微生物回收试验用供试液。
所加菌液的体积不超过供试液体积的1%。
1、试验组取上述制备好的供试液，加入试验菌液，混匀，使每lml供试液中含菌量不大于l00cfu。
2、供试品对照组取制备好的供试液，以稀释液代替菌液同试验组操作。
3、菌液对照组取不含中和剂及灭活剂的相应稀释液替代供试液，按试验组操作加入试验菌液并进行微生物回收试验。
3) 供试品中微生物的回收取20ml温度不超过45℃的胰酪大豆胨琼脂或沙氏葡萄糖琼脂培养基，注人直径90mm的无菌平皿，凝固，制成平板，采用无菌操作台风干的方法使培养基表面干燥。
每一平板表面接种上述照“供试液的制备”和“接种和稀释”制备的供试液0.1ml。
胰酪大豆胨琼脂培养基平板在35℃条件下培养3天，沙氏葡萄糖琼脂培养基平板在25℃条件下培养4天。
同法测定供试品对照组及菌液对照组菌数。