GST pulldown实验技术
GST-pull down
GST-pull down 实验一、实验所需试剂及配制：1、LB培养基成分：1%（W/V）Tryptone5%（W/V）Y east Extract1%（W/V）NaCl（1）称取下列试剂，置于1L烧杯中：Tryptone 10 g；Y east Extract 步骤：5 g；NaCl 10 g（2）加入约800 ml去离子水，充分搅拌溶解（3）滴加NaOH调节PH值至7.0-7.2（注：1L培养基约需5 MNaOH 1 ml）（4）加去离子水定容至1L（5）高温高压灭菌后，4 ℃保存。
2、LB/Amp 培养基配制成分：1%（W/V）Tryptone5%（W/V）Y east Extract1%（W/V）NaCl0.1 mg/ml Amp（氨苄青霉素）步骤：（1）--（5）同上（6）高压后，温度降至60 ℃以下，加入1L Amp（100 mg/ml）后均匀混合，4 ℃保存。
（注：高压后直接加入，温度过高易使抗生素灭活）3、Amp （100 mg/ml）配制：步骤：（1）称量5 g Amp置于50 ml离心管中（2）加入40 ml 灭菌水，充分混合溶解后，定容至50 ml（3）用0.22 um过滤膜过滤除菌（4）小分分装（1 ml/分）后，-20 ℃保存。
4、LB固体培养基配制：成分：1%（W/V）Tryptone5%（W/V）Y east Extract1%（W/V）NaCl15 g/L 琼脂糖粉步骤：（1）同LB培养基称取上述试剂充分混匀后并调PH值（2）高压灭菌后，等待培养基冷却至50-60 ℃，加入抗生素，摇匀（3）超净台中均匀铺板，待冷却凝固后，4 ℃密封保存（注：每个板子大约需要25 ml培养基）二、目的质粒转化大肠杆菌、菌种挑取及保存（一）转化1、-80 ℃冰箱中取感受态细菌（15 ul），冰上解冰。
2、加入质粒DNA溶液（5 ul），轻摇匀，冰上放置30 min。
3、42 ℃水浴中热击45s，促使细菌吸收质粒，热击后迅速置于冰浴冷却2 min。
GST pull-down实验技术
Western Blot
1. GST-A融合蛋白的制备
1.1 GST-A融合蛋白的表达 1.2 GST-A融合蛋白的纯化
Western Blot
Western Blot
1.1 GST-A融合蛋白的表达
1、活化冻存菌种GST和GST-A：按1: 50比例将表达蛋白的冻存 菌液加入5ml LB(Amp＋)，37℃，200 rpm培养过夜；
GST pull-down 示意图
Western Blot
GST pull-down应用
Western Blot
用于验证两个已知蛋白的相互作用 筛选与已知蛋白相互作用的未知蛋白
GST pull-down流程
GST-A融合蛋白的制备 • B蛋白的制备 • 体外蛋白的结合 • Western blot检测
3、在管中加入预冷的200微升PBS（沿壁加入，小心勿剧烈，以 免打断珠子与蛋白的连接），轻晃悬浮珠子，将Sepharose洗涤 一次， 3000 rpm/min，4℃离心3min，弃上清;
4、重复步骤3三次（最后一次以小枪头吸净珠子表面液体，吸 净但不吸走珠子），即获得结合有GST-A融合蛋白的Sepharose；
1.2 GST-A融合蛋白的纯化
Western Blot
5、如果用于检测，在Sepharose 加入15~20微升1×蛋白电泳上 样缓冲液，于沸水中煮5~10min。
6、12000 rpm/min离心5min，取上清做SDS-PAGE和WB检测。
2. B蛋白的制备
Western Blot
Western Blot
1.1 GST-A融合蛋白的表达
5、重悬沉淀：按10ml菌液沉淀用1ml PBS重悬，并加入PMSF； 6、冰上超声沉淀重悬液：5S 间隔5S 至悬液透明（一般可容性
GST-Pull-down技术服务
原理简介：
GST-Pull-down技术是一种体外检测蛋白质之间相互作用的方法。
其基本原理是利用GST对于其底物-谷胱甘肽具有极高的特异性，故GST融合蛋白可亲和固化在谷胱甘肽树脂上，作为与猎物蛋白亲和的支撑物,充当一种“诱饵蛋白”,当猎物蛋白溶液过柱时便可从中捕获与之相互作用的蛋白(目的蛋白)，洗脱结合物然后通过SDS-PAGE电泳分析,从而证实两种蛋白间的相互作用或筛选相应的目的蛋白,此方法简单易行,操作方便。
服务内容：
一验证两蛋白质间相互作用
诱饵蛋白与猎物蛋白原核表达载体的构建
诱饵蛋白与猎物蛋白的诱导表达
诱饵蛋白与猎物蛋白的纯化
Pull-down技术蛋白互作分析
Western bloting进一步鉴定互作蛋白表达
二，验证目的蛋白与细胞裂解物蛋白互作
诱饵蛋白原核表达载体的构建
诱饵蛋白的诱导表达
诱饵蛋白的纯化与固定
Pull-down技术蛋白互作分析
互作靶蛋白的鉴定
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GST-pull-down实验技术
1.1.2 (His)-B融合蛋白的纯化
Western Blot
5、加入适量体积Elution Buffer，不必吹打，晃动洗脱蛋白。 3000 rpm/min，4℃离心5min，吸净上清，His-B融合蛋白即在 上清中；
6、如果用于检测，取10微升样品，加入10微升1×蛋白电泳上 样缓冲液，于沸水中煮5~10min；
2、将过夜培养物按1:100比例接入200ml LB(Amp＋) ，220 rpm， 30℃培养至OD600=0.4-0.6;
3、以预实验确定的最佳IPTG浓度、时间和温度诱导表达靶蛋 白（IPTG 0.5mM，20℃，200 rpm培养10~16小时）;
4、诱导适当时间后，4℃，5000 rpm/min离心10min后弃上清 （如需要该步沉淀能保存在-80℃）；
Western Blot
1. GST-A融合蛋白的制备
1.1 GST-A融合蛋白的表达 1.2 GST-A融合蛋白的纯化
Western Blot
Western Blot
1.1 GST-A融合蛋白的表达
1、活化冻存菌种GST和GST-A：按1: 50比例将表达蛋白的冻存 菌液加入5ml LB(Amp＋)，37℃，200 rpm培养过夜；
体外蛋白的结合?1将结合有gsta融合蛋白的sepharose4b悬浮在适量体积缓冲液中加入悬浮在适量体积缓冲液中加入2030微升含有b蛋白的溶液原核表达或真核表达产物同时采用结合有蛋白的溶液原核表达或真核表达产物同时采用结合有gst蛋白的sepharose作为阴性对照
GST pull-down 实验技术
主讲：段志强
Western Blot
GST pull-down原理 GST pull-down实验流程
GSTPullDown（以Rac1活性检测为例）（原创）
GSTPullDown（以Rac1活性检测为例）（原创）1、⽤GST-PAK-CRIB融合蛋⽩载体转化BL21感受态细菌，37℃培养过夜，12-16h之后出现菌
落；
2、挑取阳性单克隆，接种到含有抗⽣素的LB液体培养基中，在37℃恒温摇床中剧烈振摇⾄菌
液OD600值在0.4-0.6之间时，加⼊IPTG 0.1mmol/L诱导，继续孵育3-4h，离⼼，收集菌体（可
以-70℃保存备⽤）；
3、加⼊2 ml细菌裂解液（含蛋⽩酶抑制剂），重新悬浮菌体，冰上振荡15 min；
4、12000 rpm离⼼10 min，取上清；
5、向上清中加⼊100 µl的含有⾕胱⽢肽的琼脂糖磁珠（⽤之前需⽤washing buffer洗涤3
次），4℃旋转混合⾄少30min，再⽤washing buffer洗3次；
6、从培养的细胞中提取全蛋⽩，取蛋⽩200µg，与上述琼脂糖磁珠混合，⽤washing buffer 补
⾜300 µl，4℃旋转孵育⾄少1 h，⽤于沉淀细胞中的⽬的蛋⽩，（注：此步反应的温度和孵育时
间均需根据不同的的蛋⽩进⾏优化，孵育的最后阶段进⾏略微的涡旋震荡能够去掉⾮特异性结
合的蛋⽩，降低背景）；
7、⼩⼼移去上清，⽤400 µl washing buffer 洗3-5次，第⼀次可室温孵育5 min，并在孵育过程
中偶尔进⾏混匀；
8、向琼脂糖磁珠中加⼊30 µl 2×SDS-PAGE加样缓冲液，沸⽔浴5 min，直接加样进⾏SDS-
PAGE蛋⽩电泳；
9、以下实验操作同westernblotting（见前天实验流程）。
GST-pull down 方案 方法 流程
GST-pull down 技术一大量制备GST蛋白1 活化冻存菌种GST和GST-X：按1：50比例将表达蛋白的冻存菌液加入5ｍｌＬＢ（Ａｍｐ＋），37℃，140~150rpm培养过夜2 将过夜培养物按1：100比例接入200mlＬＢ（Ａｍｐ＋），220rpm，30℃培养至OD600=0.4-0.63 以预实验确定的最佳IPTG浓度、时间和温度诱导表达靶蛋白。
（IPTG 0.5mM，20℃,150rpm 培养10~16小时）4 诱导适当时间后，4℃，5000g离心10min后弃上清。
（如需要该步沉淀能保存在-80℃）5 重悬沉淀：10ml菌液沉淀用1ml PBS重悬6 冰上超声沉淀重悬液：2S 间隔1S 至悬液透明（一般可容性蛋白：10ml菌液沉淀用1ml PBS重悬液超声６～９min可透明）7 10,000g*10min离心上清转移至新的离心管，加DTT至终浓度1mmol/L二谷胱甘肽-琼脂糖树脂的处理1 轻轻颠倒树脂盛装容器，混成匀浆2 取适量匀浆放入离心管中，4℃，500g离心5min后弃上清（每10ml 细菌培养物可以用50ul匀浆）3 每1.33mL 初始匀浆加入10 mL 4℃预冷的PBS，颠倒混匀后，4℃，500g离心5min后弃上清（50ul初始匀浆用400ulPBS洗）4 每1.33mL 初始匀浆加入1 mL 冷的PBS，制成50%匀浆，颠倒混匀置冰上放置待用。
（50ul初始匀浆加入40ulPBS）三结合GST蛋白1 上清与适量50%谷胱甘肽-琼脂糖树脂匀浆混合，4℃轻摇30min（可过夜让其充分结合）。
2 4℃，500g离心5min后弃上清3 沉淀加入10倍床柱体积PBS（1床柱体积=0.5*50%匀浆体积）(50ul初始匀浆用400ulPBS 洗），颠倒混匀以洗去未与树脂结合的杂蛋白（每次可在混旋仪上混匀５min)4 4℃，５00g离心5min后弃上清5 重复步骤3和4两次，共三次四预清除细胞裂解液1 将细胞裂解液与50ul的和GST结合的50%谷胱甘肽-琼脂糖树脂悬液在4℃翻转混合孵育2h。
gstpull down实验原理
gstpull down实验原理GSTP（Global Software Test Platform）是一种基于客户端-服务器架构的软件测试平台，它可以实现分布式测试、自动化测试以及测试工具的集成。
GSTP的核心技术之一就是GSTPull Down实验原理。
GSTPull Down实验原理是GSTP中的一种测试方法，用于模拟客户端请求与服务器响应的交互过程。
通过这种方法，可以对服务器的性能、稳定性和负载能力进行评估和验证。
在GSTP中，GSTPull Down实验原理的主要步骤包括：构建测试用例、模拟客户端请求、发送请求到服务器、接收服务器响应、分析响应结果。
下面将对这些步骤进行详细描述。
构建测试用例是GSTPull Down实验原理的第一步。
测试用例是为了模拟真实的客户端请求，通常包括请求的类型、参数、路径等信息。
测试用例的设计要尽可能地贴近真实的使用场景，以保证测试结果的准确性。
接下来，通过模拟客户端请求，将测试用例发送到服务器。
在GSTP中，可以使用自定义的脚本或工具来实现请求的发送。
这些工具可以模拟不同的网络环境、请求频率和负载情况，从而对服务器的性能和稳定性进行全面测试。
服务器接收到客户端的请求后，会进行相应的处理，并生成相应的响应结果。
GSTP会将服务器的响应结果返回给测试者，以方便对响应结果进行分析和评估。
在分析响应结果时，可以根据预先设定的评估指标对服务器的性能进行评估。
评估指标可以包括响应时间、并发数、吞吐量等。
通过分析这些指标，可以了解服务器在不同负载下的性能表现，并找出潜在的性能瓶颈。
通过GSTPull Down实验原理，测试者可以对服务器的性能和稳定性进行全面的评估。
它可以帮助测试者发现服务器的性能瓶颈，优化服务器的配置和性能，提高服务器的负载能力。
GSTPull Down实验原理是GSTP中的一种测试方法，通过模拟客户端请求和服务器响应的交互过程，对服务器的性能和稳定性进行评估和验证。
GST pull-down
百泰派克生物科技
GST pull-down
Pull down（拉下实验）是一种体外亲和纯化蛋白的技术，Pull down技术将已知蛋白（诱饵蛋白）利用亲和试剂标签（如谷胱甘肽-S-转移酶、组氨酸六肽、生物素）进行标记，再特异性识别混合体系中的配体蛋白（靶蛋白），以达到富集、分离、纯化某种配体蛋白质的目的，是在体外研究蛋白与蛋白相互作用的有力工具。
GST pull-down实验，也称GST融合蛋白沉降技术，是利用谷胱甘肽S-转移酶（GST）标记诱饵蛋白进行的Pull down实验。
GST pull-down可用于证实已知的蛋白或肽的相互作用，也可以用来挖掘未知的蛋白或肽的相互作用。
百泰派克生物科技提供高效快速的GST pull-down 蛋白互作分析服务，可用于鉴定两种已知的兴趣蛋白质可能存在的直接相互作用，以及寻找可能与目标蛋白存在相互作用关系的未知蛋白，欢迎免费咨询。
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➢ 3、以预实验确定的最佳IPTG浓度、时间和温度诱导表达靶蛋 白（IPTG 0.5mM，28℃，200 rpm培养10~16小时）;
➢ 4、诱导适当时间后，4℃，5000 rpm/min离心10min后弃上清 （如需要该步沉淀能保存在-80℃）；
GST pull-downFra bibliotek示意图Western Blot
GST pull-down应用
Western Blot
用于验证两个已知蛋白的相互作用 筛选与已知蛋白相互作用的未知蛋白
GST pull-down流程
GST-A融合蛋白的制备 • B蛋白的制备 • 体外蛋白的结合 • Western blot检测
Western Blot
➢ 1.1 GST-A融合蛋白的表达
➢ 5、重悬沉淀：按10ml菌液沉淀用1ml PBS重悬，并加入PMSF； ➢ 6、冰上超声沉淀重悬液：5S 间隔5S 至悬液透明（一般可容性
蛋白：10ml菌液沉淀用1ml PBS重悬液超声6~9min可透明）; ➢ 7、12000 rpm/min，4℃离心10min，将上清转移至新的离心管，
B蛋白的来源： ➢ 1.1 (His)-B融合蛋白的原核表达与纯化 ➢ 1.2 (HA/Myc/Flag)-B融合蛋白的真核表达
Western Blot
➢ 1.1.1 (His)-B融合蛋白的原核表达
➢ 1、活化冻存菌种His和His-B：按1: 50比例将表达蛋白的冻存菌 液加入5ml LB(Amp＋)，37℃，200 rpm培养过夜；
Western Blot
1. GST-A融合蛋白的制备
➢ 1.1 GST-A融合蛋白的表达 ➢ 1.2 GST-A融合蛋白的纯化
Western Blot
Western Blot
➢ 1.1 GST-A融合蛋白的表达
➢ 1、活化冻存菌种GST和GST-A：按1: 50比例将表达蛋白的冻存 菌液加入5ml LB(Amp＋)，37℃，200 rpm培养过夜；
➢ 3、在管中加入预冷的200微升Wash Buffer（沿壁加入，小心勿 剧烈，以免打断珠子与蛋白的连接），轻晃悬浮珠子，将珠子 洗涤一次， 3000 rpm/min，4℃离心3min，弃上清;
➢ 4、重复步骤3三次（最后一次以小枪头吸净珠子表面液体，吸 净但不吸走珠子），即获得结合有His融合蛋白的Ni-NTA；
加DTT至终浓度1mmol/L。
Western Blot
➢ 1.2 GST-A融合蛋白的纯化
➢ 1、 在新鲜制备的裂解液上清中加入适量体积的50%Glutathione Sepharose 4B，4℃缓慢摇动，反应30~60min；
➢ 2、 3000 rpm/min，4℃离心3min，弃上清。该Sepharose上结合 了GST-A融合蛋白。
加DTT至终浓度1mmol/L。
Western Blot
➢ 1.1.2 (His)-B融合蛋白的纯化
➢ 1、 在新鲜制备的裂解液上清中加入适量体积的Ni-NTA珠子， 4℃缓慢摇动，反应30~60min；
➢ 2、 3000 rpm/min，4℃离心5min，弃上清。该Ni-NTA珠子上结 合了His-B融合蛋白。
➢ 3、在管中加入预冷的200微升PBS（沿壁加入，小心勿剧烈，以 免打断珠子与蛋白的连接），轻晃悬浮珠子，将Sepharose洗涤 一次， 3000 rpm/min，4℃离心3min，弃上清;
➢ 4、重复步骤3三次（最后一次以小枪头吸净珠子表面液体，吸 净但不吸走珠子），即获得结合有GST-A融合蛋白的Sepharose；
GST pull-down 实验技术
主讲：段志强
Western Blot
GST pull-down原理 GST pull-down实验流程
Western Blot
GST pull-down原理：
GST pull down 是一种在体外研究蛋白质相互作用的 方法。
原理： 利用DNA重组技术将已知蛋白与GST (Glutathione S transferase) 融合，融合蛋白通过GST与固相化在载体 上的GTH（Glutathione）亲和结合。因此，当与融合 蛋白有相互作用的蛋白通过层析柱时或与此固相复合 物混合时就可被吸附而分离。
➢ 2、将过夜培养物按1:100比例接入200ml LB(Amp＋) ，220 rpm， 30℃培养至OD600=0.4-0.6;
➢ 3、以预实验确定的最佳IPTG浓度、时间和温度诱导表达靶蛋 白（IPTG 0.5mM，20℃，200 rpm培养10~16小时）;
➢ 4、诱导适当时间后，4℃，5000 rpm/min离心10min后弃上清 （如需要该步沉淀能保存在-80℃）；
Western Blot
➢ 1.1.1 (His)-B融合蛋白的原核表达
➢ 5、重悬沉淀：按10ml菌液沉淀用1ml PBS重悬，并加入PMSF； ➢ 6、冰上超声沉淀重悬液：5S 间隔5S 至悬液透明（一般可溶性
蛋白：10ml菌液沉淀用1ml PBS重悬液超声6~9min可透明）; ➢ 7、12000 rpm/min，4℃离心10min，将上清转移至新的离心管，
➢ 1.2 GST-A融合蛋白的纯化
Western Blot
➢ 5、如果用于检测，在Sepharose 加入15~20微升1×蛋白电泳上 样缓冲液，于沸水中煮5~10min。
➢ 6、12000 rpm/min离心5min，取上清做SDS-PAGE和WB检测。
2. B蛋白的制备
Western Blot
Western Blot
GST pull-down原理：
基本原理：
假定A蛋白和B蛋白可能有相互作用，将纯化的融合GST 标签的A蛋白和纯化的B蛋白以及能特异结合GST的 Sephrose 4B beads 孵育一定时间，充分洗涤未结合的蛋 白，煮沸beads进行SDS-PAGE电泳，通过Western blotting 检测，可以看见GST-A和B分别对应的条带,表明A和B因 相互作用而被GST-A pull-down；而GST对照组始终仅有 一个条带。