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测序PPT
生工Sangon Biotech
α-互补
• 即：携带lacz’基因的质粒编码的α肽链和宿 主编码的N端有缺陷的β半乳糖苷酶突变体 互补，产生完整β半乳糖苷酶的能力——把 X-gal分解成蓝色物质的能力。
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TA克隆的优点
• 1、不需使用含限制酶序列的引物
• 2、不需要把PCR产物优化 • 3、不需要把PCR产物平末端处理 • 4、不需要把PCR产物加接头
生工Sangon Biotech
克隆测序要求
• 1、PCR以纯化：浓度≥20ng/ul，体积20ul • 2、PCR未纯化：浓度≥50ng/ul，体积25ul • 3、务必订单上注明PCR所用引物序列，以 便用于克隆结果的核对分析 • 4、克隆片段信息：名称、大小、样品是否 带A尾以及PCR产物类型
• 4、质
粒：20ul,浓度>100ng
生工Sangon Biotech
样品处理
• 1、菌液：
过夜培养 质粒提取 鉴定 反应
结果报告
序列分析
上机测序
生工Sangon Biotech
样品处理
• 2、PCR未纯化：
纯 化 鉴定 反 应
结果报告
序列分析
上机测序
生工Sangon Biotech
样品处理
生工Sangon Biotech
样本要求
• 1、甘油菌或穿刺菌：请注明其培养基、抗 生素抗性、载体名称及是否需要诱导等信 息；
• 2、质粒DNA：浓度需≥ 100 ng/μl，总量≥ 1 μg，OD 值介于1.80～2.00 之间，并确保 DNA 没有发生降解。
生工Sangon Biotech
流
挑取克隆、液体 LB培养基培养
临床基因组学：第七章-第3讲 Sanger测序及高通量测序技术
• 2012年，《自然》杂志报道了1092个人类基因组序列。
• NHLBI Cohort (ESP6500)
• NHLBI美国国家心脏、肺、血液研究所 • 6503个样本：
• 2203 African-Americans • 4300 European-Americans
遗传病的基因突变
微小突变
苯丙酮尿症 甲基丙二酸血症 肝豆状核变性 RETT综合征
residue where a
established
where LOF is a
different pathogenic pathogenic variant known
missense change has PS1
• 起始密码子(Met1)变异：
• P.Met1？
• 缺失变异（deletions）
• p.Gln8del • p.Gly4_Gln6del
• 重复突变（duplications）
• p.Gln8dup • p.Gly4_Gln6dup
• 无义突变
• P.Trp26X
• 插入变异（insertions） • p.Lys2_Leu3insGlnSer
计算机 预测
Multiple lines of computational Multiple lines of
evidence suggest no impact on Computational
gene/gene product BP4
evidence support a
deleterious effect on
Variant impact on gene, transcript, protein sequence
Sequence conservation Phylogenetic and structural characteristics
• NHLBI Cohort (ESP6500)
• NHLBI美国国家心脏、肺、血液研究所 • 6503个样本：
• 2203 African-Americans • 4300 European-Americans
遗传病的基因突变
微小突变
苯丙酮尿症 甲基丙二酸血症 肝豆状核变性 RETT综合征
residue where a
established
where LOF is a
different pathogenic pathogenic variant known
missense change has PS1
• 起始密码子(Met1)变异：
• P.Met1？
• 缺失变异（deletions）
• p.Gln8del • p.Gly4_Gln6del
• 重复突变（duplications）
• p.Gln8dup • p.Gly4_Gln6dup
• 无义突变
• P.Trp26X
• 插入变异（insertions） • p.Lys2_Leu3insGlnSer
计算机 预测
Multiple lines of computational Multiple lines of
evidence suggest no impact on Computational
gene/gene product BP4
evidence support a
deleterious effect on
Variant impact on gene, transcript, protein sequence
Sequence conservation Phylogenetic and structural characteristics
基因组测序基本原理ppt课件
基因组测序基本原理
大纲
I. 核酸DNA的发现以及测序历史简介 II. 双脱氧化(Sanger dideoxy method)测序 III.大片段的DNA测序与基因组测序的大发展 VI.人类基因组 V. 1000美元个体化基因组测序计划(The “$1,000 dollar genome)
On WebCT -- “The $1000 genome” -- review of new sequencing techniques by George Church
Part I.核酸测序原理
核酸发现与测序简史
DNA测序的简史
MC chapter 12
DNA测序的方法
A. 双脱氧法 (Sanger dideoxy) (primer extension/chaintermination) method: 最流行也是最广为接受的方法。
Maxam-Gilbert化学剪切法(chemical cleavage method): DNA is labelled and then chemically cleaved in a sequence-dependent manner. This method is not easily scaled and is rather tedious 焦磷酸测序(Pyrosequencing): measuring chain extension by pyrophosphate monitoring。焦磷酸测序技术是新一代 DNA序列分析技术，该技术无须进行电泳，DNA片段也无 须荧光标记，操作极为简便，可以快速、准确地确定DNA 序列。
测序的趋势
相对而言一般很少实验室会自己做测序，一则自身测序费用比较高，而且荧光试剂容 易粹灭，同时也比较消耗时间，另外可能出现一些其它问题引起结果不成功。所以大 部分的测序都是送到相关的测序中心或者公司完成:
大纲
I. 核酸DNA的发现以及测序历史简介 II. 双脱氧化(Sanger dideoxy method)测序 III.大片段的DNA测序与基因组测序的大发展 VI.人类基因组 V. 1000美元个体化基因组测序计划(The “$1,000 dollar genome)
On WebCT -- “The $1000 genome” -- review of new sequencing techniques by George Church
Part I.核酸测序原理
核酸发现与测序简史
DNA测序的简史
MC chapter 12
DNA测序的方法
A. 双脱氧法 (Sanger dideoxy) (primer extension/chaintermination) method: 最流行也是最广为接受的方法。
Maxam-Gilbert化学剪切法(chemical cleavage method): DNA is labelled and then chemically cleaved in a sequence-dependent manner. This method is not easily scaled and is rather tedious 焦磷酸测序(Pyrosequencing): measuring chain extension by pyrophosphate monitoring。焦磷酸测序技术是新一代 DNA序列分析技术，该技术无须进行电泳，DNA片段也无 须荧光标记，操作极为简便，可以快速、准确地确定DNA 序列。
测序的趋势
相对而言一般很少实验室会自己做测序，一则自身测序费用比较高，而且荧光试剂容 易粹灭，同时也比较消耗时间，另外可能出现一些其它问题引起结果不成功。所以大 部分的测序都是送到相关的测序中心或者公司完成:
Sanger测序原理
未来发展方向
未来发展方向
未来技术改进
未来应用领域
随着技术的不断进步，Sanger 测序的未来发展方向包括提高 测序速度、降低成本和提高分 辨率。此外，开发能够同时进 行DNA和RNA测序的多模式测 序技术也是未来的一个重要趋 势。
未来Sanger测序技术的改进可 能包括改进荧光染料和检测系 统以提高分辨率，开发新型聚 合酶以降低误差率，以及开发 能够同时进行多路测序的微流 体芯片和纳米孔测序技术。
成本较低
随着技术的不断改进，Sanger测序的 成本逐渐降低，使得更多研究机构和 个人能够承担测序费用。
缺点
速度慢
Sanger测序技术的速度相对较慢， 对于大规模基因组测序存在一定 的限制。
成本高
虽然Sanger测序技术成本相对较 低，但对于大规模基因组测序来 说仍然较高，需要更多的资金支 持。
无法检测基因突变
02
03
合成引物
根据待测DNA序列，设计 并合成测序引物，用于引 导DNA聚合酶合成互补链。
合成互补链
使用DNA聚合酶，根据引 物的引导，合成与待测 DNA互补的链。
标记终止子
在合成互补链的过程中， 引入标记终止子，以便后 续的检测和识别。
聚合酶链式反应（PCR）扩增
设计PCR引物
根据待测DNA序列，设计PCR引物，用于扩增待测DNA片段。
电泳分离
经过凝胶电泳分离后，根据各个DNA片段的长度差异，可以确定每个碱基的位置，从而 确定整个DNA序列。
应用领域
基因组学
01
用于测定基因组中所有基因的序列，研究基因组的变异和进化。
分子生物学
02
用于研究基因表达、转录和翻译等过程，以及蛋白质的结构和
【培训课件-临床基因组学】_临床基因组学-Sanger测序及高通量测序技术-广州医学大学
Applied Biosystems® 3730系列基因分析仪
Applied Biosystems® 3500xl 系列基因分析 仪
第二代测序
进入21 世纪，以Roche 公司的454 技术、Illumina 公司的Solexa 技术和ABI 公司的 SOLiD 技术为标志，诞生了第二代DNA 测序技术（next generation sequencing， NGS）
dNTP vs ddNTP
dNTP 5'磷酸基 3'羟基
ddNTP 5'磷酸基
dNTP vs ddNTP
dNTP 1 dNTP2 dNTP3 dNTP4…………………………dNTPN
DNA链顺利延伸
dNTP vs ddNTP
dNTP 1 dNTP2 dNTP3 ddNTP
双脱氧核苷酸链终止
基本原理
第一代测序与第二代测序之间的主要差别是测序通量：
前者每个反应 仅测一个DNA 片段 后者每次反应可检测几百万个DNA 片段
第二代测序
Roche 454 焦磷酸测序 ABI SOLiD 连接法测序
ABI ion torrent 半导体测序
Illumina SBS测序
第三代测序
第三代测序技术是指单分子测序技术，也被称为下下代测序 (Next-Next-generation sequencing)
如在第一个反应体系中加入ddATP，则ddATP 会随机地 代替dATP 参加反应，从而在第一个反应体系中产生以A 结尾的不同长度的核苷酸链。同理其余三个反应体系分 别产生了以T、G、C 结尾的不同长度的片段。
通过高分辨率的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE） 和 放射自显影检测可读取模板DNA 链互补的序列。
Applied Biosystems® 3500xl 系列基因分析 仪
第二代测序
进入21 世纪，以Roche 公司的454 技术、Illumina 公司的Solexa 技术和ABI 公司的 SOLiD 技术为标志，诞生了第二代DNA 测序技术（next generation sequencing， NGS）
dNTP vs ddNTP
dNTP 5'磷酸基 3'羟基
ddNTP 5'磷酸基
dNTP vs ddNTP
dNTP 1 dNTP2 dNTP3 dNTP4…………………………dNTPN
DNA链顺利延伸
dNTP vs ddNTP
dNTP 1 dNTP2 dNTP3 ddNTP
双脱氧核苷酸链终止
基本原理
第一代测序与第二代测序之间的主要差别是测序通量：
前者每个反应 仅测一个DNA 片段 后者每次反应可检测几百万个DNA 片段
第二代测序
Roche 454 焦磷酸测序 ABI SOLiD 连接法测序
ABI ion torrent 半导体测序
Illumina SBS测序
第三代测序
第三代测序技术是指单分子测序技术，也被称为下下代测序 (Next-Next-generation sequencing)
如在第一个反应体系中加入ddATP，则ddATP 会随机地 代替dATP 参加反应，从而在第一个反应体系中产生以A 结尾的不同长度的核苷酸链。同理其余三个反应体系分 别产生了以T、G、C 结尾的不同长度的片段。
通过高分辨率的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE） 和 放射自显影检测可读取模板DNA 链互补的序列。
Sanger测序法的原理及应用
Sanger测序法的原理及应用
肿瘤靶向药与基因突变检测
肿瘤靶向药
靶向药=高度选择性
威罗菲尼（Vemurafenib ）
只杀死发生V600E突变的癌细胞， 对于正常细胞和组织没有伤害。
是一种BRAF酶的小分子抑制剂，能够选择性抑制含有V600E 突变的BRAF蛋白，大约有60%黑色素瘤患者携带有该突变。
1 2011年NCCN结直肠癌临床实践指南（中国版） 2 Chapman PB et al N Engl J Med. 2011; 364(26):2507-2516
基因检测与基因测序技术
病原 鉴定
产前 诊断
疾病 分型
基因 检测
遗传 疾病
一代测序
肿瘤 Sanger测序法 用药 二代测序
高通量、低成本
该方法是由生物化学家Frederick Sanger及同事 在1977年发明的一种DNA测序方法。 Frederick Sanger也因此在3年后，获得了人生的 第二个诺贝尔化学奖。
Frederick Sanger （1918-2003）
Sanger测序法的原理 1/3
反应组分
与PCR反应组分类似
dNTP掺入新生链， 使链继续延伸。
ddNTP掺入， 使新生链的合成终止。
Sanger测序法的原理 3/3
4种反应体系
反应过程
4泳道分析
凝胶电泳
“链终止” DNA链片段
毛细管电泳 测序仪
单泳道分析
测序结果解读
测序峰图
信号： DNA终止链所携带的ddNTP的荧光信号。
峰越高表示 荧光信号越强。
读长：序列读取的碱基长度。
基因检测对靶向药的临床指导意义
BRAF V600E基因突变的临床意义
肿瘤靶向药与基因突变检测
肿瘤靶向药
靶向药=高度选择性
威罗菲尼（Vemurafenib ）
只杀死发生V600E突变的癌细胞， 对于正常细胞和组织没有伤害。
是一种BRAF酶的小分子抑制剂，能够选择性抑制含有V600E 突变的BRAF蛋白，大约有60%黑色素瘤患者携带有该突变。
1 2011年NCCN结直肠癌临床实践指南（中国版） 2 Chapman PB et al N Engl J Med. 2011; 364(26):2507-2516
基因检测与基因测序技术
病原 鉴定
产前 诊断
疾病 分型
基因 检测
遗传 疾病
一代测序
肿瘤 Sanger测序法 用药 二代测序
高通量、低成本
该方法是由生物化学家Frederick Sanger及同事 在1977年发明的一种DNA测序方法。 Frederick Sanger也因此在3年后，获得了人生的 第二个诺贝尔化学奖。
Frederick Sanger （1918-2003）
Sanger测序法的原理 1/3
反应组分
与PCR反应组分类似
dNTP掺入新生链， 使链继续延伸。
ddNTP掺入， 使新生链的合成终止。
Sanger测序法的原理 3/3
4种反应体系
反应过程
4泳道分析
凝胶电泳
“链终止” DNA链片段
毛细管电泳 测序仪
单泳道分析
测序结果解读
测序峰图
信号： DNA终止链所携带的ddNTP的荧光信号。
峰越高表示 荧光信号越强。
读长：序列读取的碱基长度。
基因检测对靶向药的临床指导意义
BRAF V600E基因突变的临床意义
【培训课件-临床基因组学】_第七章 Sanger测序及高通量测序技术-广州医学大学
A
G
T
C
A
A
G
C
G
T
C
C
C
A
T
G
...---Ion Sphere™ Particle
G
Key Sequence Sequence of Interest
Flows 9+
A “cycle” is four consecutive dNTP flows: for instance, T-A-C-G = 1 cycle
‘TACGTACGTCTGAGCATCGATCGATGTACAGC’
T ACG T ACG T C T GAGCA T CGA
T
Flows 1-4 Flows 5-8 …9-12
… etc.
C
T CAG T T CGCA GGGT AC
G
Ion
Sphere
-----Primer------
A
G
T
C
A
Particle
G
Key Sequence Sequence of Interest
Flows 5-8
A “cycle” is four consecutive dNTP flows: for instance, T-A-C-G = 1 cycle
Sequencing: Flows
• A “flow” is the event of exposing the chip to one particular dNTP (T, A, C, or G), followed by a washing step
• The flow order repeats with pattern:
sanger测序结果解读
sanger测序结果解读sanger测序是一种经典的测序技术，被广泛应用于DNA测序领域。
它以其高可靠性和较低的成本而闻名，是许多基因研究项目的首选测序方法。
在本文中，我们将以“sanger测序结果解读”为主题，详细介绍sanger 测序的原理、步骤以及如何解读测序结果。
一、Sanger测序原理sanger测序是基于DNA链延伸原理的一种测序方法。
它利用了DNA合成时的一种特性，即位置固定的链终止。
当DNA合成反应中加入了一种特殊的二进制链终止剂（即dideoxynucleotide），DNA合成过程会被阻止。
在sanger测序中，使用一小部分含有4种不同的二进制链终止剂的反应混合物，其中每种终止剂对应一个特定的碱基（A、T、C、G）。
通过测定反应混合物中各个碱基的浓度，可以确定DNA序列中每个位置上的碱基。
二、Sanger测序步骤1. DNA模板制备：首先，需要从目标DNA样本中提取DNA，并对其进行纯化和扩增，以获得足够的DNA模板用于测序。
2. 反应混合物制备：将DNA模板与引物（即反向和正向引物）以及核苷酸（dNTPs）和dideoxynucleotide（ddNTPs）混合。
其中ddNTPs对应着A、T、C和G中的每一个，只是与相应碱基缺失了3'-OH基团，从而阻止相应碱基的链延伸。
3. PCR扩增：反应混合物经过PCR（聚合酶链反应）扩增，使得DNA模板在冷却和加热循环中得以复制。
4. 电泳分离：扩增后的DNA片段通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离。
电泳的原理是根据DNA分子大小，让DNA片段按照大小排列形成“梯度”。
5. 测序反应：将电泳分离后的DNA片段放入4个不同反应管中，每个管中添加一个ddNTP，并在每个管中使用DNA聚合酶进行扩增。
6. 电泳分析：使用高分辨率聚丙烯酰胺凝胶电泳将反应产物进行分离，并根据分子量和颜色的大小排列顺序，读取出测序长度。
三、解读sanger测序结果在sanger测序过程中，通过对反应产物进行电泳分析，可以获得一系列不同长度的DNA片段。
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sanger测序---基因检测的 金标准
上海吉凯基因化学技术有限公司 Shanghai Genechem Co., Ltd.
曹尚志
sanger测序原 理
• 双脱氧末端终止法
• 引物设计 • 实验流程 • 上机测序
Sanger测 序的基本 流程
测序结果 的分析
• 怎样分析结果 • 问题峰图分析
一、Sanger测序原理——双脱氧末端终止法
根据设计好的参数，设置使用PCR仪器扩 增.
3.2 PCR产物纯化
纯化的意义
去除PCR反应液的 残留
1.残留的引物：保证引物特异性，避免多重测序 2.残留的dNTP:以保持dNTPs / ddNTPs的最佳 比例 3.盐成分：避免抑制测序酶活性 4.非特异PCR产物：避免扩增出同源性区域
依赖于
纯化（试剂盒） 方式选择
5’ 3’
ddNTP被加到正在合成的链上，由于它的3’-OH已被氧化，下一个dNTP 的5’-磷酸基团不能与之形成磷酸二酯键，使合成终止。 在引物等延伸反应过程中，ddNTP在不同位置掺入，产生了一系列不同 长度的新的DNA片段。
5’
3’
一、Sanger测序原理——双脱氧末端终止法
二、Sanger测序的实验基本流程（以MTHFR(RS1801133)检测为例）
电泳图/QV值 峰图
Raw：峰图
Electropherogram：电泳图
QV值 QV值越高，读图越准确。 QV值为蓝色，表示可信。 QV值为黄色，表示不准确，需要人工判读。 QV值为红色，表示不可信 QV值
2.怎样得到位点基因型（分析软件Chromas）
根据得到位点信息，将位点3‘保守序列（10个碱基左右），在软件中Chromas 查找，前面即为突变基因型。 PS:如果是反向引物测序需要将测序结果反向互补
3.常见峰图介绍及分析
正常及无信号测序峰图 样品内部结构影响及测序峰图
测序仪器影响及测序峰图
纯化因素影响及测序峰图 引物质量影响及测序峰图
染料峰（纯化操作不规范或者ddntp过量）
Raw：
Electropherogram：
返回
3.常见峰图介绍及分析
正常及无信号测序峰图 样品内部结构影响及测序峰图
测序仪器影响及测序峰图
纯化因素影响及测序峰图 引物质量影响及测序峰图
引物降解或者不纯
Raw：
Electropherogram：
Thanks！
上海吉凯基因化学技术有限公司 Shanghai Genechem Co., Ltd.
Raw：ElectΒιβλιοθήκη opherogram：返回
测序信号中断（二级结构导致）
Raw：
Electropherogram：
返回
序列结构高GC导致信号衰减
Raw：
Electropherogram：
返回
3.常见峰图介绍及分析
正常及无信号测序峰图 样品内部结构影响及测序峰图
测序仪器影响及测序峰图
纯化因素影响及测序峰图 引物质量影响及测序峰图
峰图出现断层（可先重跑看是否解决，需要换Buffer）
Raw：
Electropherogram（电泳图、QV正常）
毛细管堵塞导致拖尾（可先重跑看是否解决，或者清理毛细管）
Raw：
Electropherogram（展开图正常）
毛细管堵塞导致宽峰（可先重跑看是否解决，或者清理毛细管）
Raw：
Electropherogram：
3.测序PCR模板的制备 稀释引物
根据合成回来的引物浓度稀释，一般工作 液10umol/ul(4℃保存)，母液100umol/ul（ -20℃保存）
3.1 PCR扩增
设计方案
1.PCR扩增三步法：变性--退火--延伸 2.退火温度：(Ftm+Rtm)/2-5 3.延伸时间：1kb=1min
pcr仪扩增
1.根据rs号得到位点信息及目标序列 2.引物设计
3.测序PCR模板的制备
4. 测序样品的制备 5.上机测序
1.根据rs号得到位点信息及目标序列
2.引物设计
2.1 primer primer 5.0
+
2.引物设计
2.2 引物特异性检查
2.3 设计引物还需注意
引物纯度（PAGE纯化方式） 不能使用兼并引物测序 测序引物位置距离位点最多600bp，至少50bp 避免荧光标记 测序引物长度16-25bp，TM值50-65℃为宜,55℃最佳 测序引物位置避免Poly（A.T）和高GC结构
•PCR反应的优化程 •PCR产物的质量 选择最佳的纯化方法
1.柱纯化：用于特异PCR产物纯化或存在 <100bp的非特异产物的纯化 (如：引物二聚体) 2.切胶回收：可用于任何质量的PCR产物纯化 切下条带，去除非特异PCR产物和引物二聚体
4.测序样品制备
测序PCR
测序产物 纯化
测序PCR（以回收PCR产物为模板）：96 ℃1 min -(96 ℃ 10 sec 50 ℃ 5 sec - 60 ℃ 4 min) x 25循环-4 ℃保温 酒精/EDTA/NaAc法：•去除残留的BigDye Terminator(染料 峰) •测序产物脱盐 •纯化好的测序产物比较稳定
Raw：
Electropherogram：
信号弱（有较完整峰型、信号值较低、峰图部分可信）
Raw：
Electropherogram：
3.常见峰图介绍及分析
正常及无信号测序峰图
样品内部结构影响及测序峰图 测序仪器影响及测序峰图 纯化因素影响及测序峰图 引物质量影响及测序峰图
poly（A、T）结构导致后双峰
3.常见峰图介绍及分析
正常及无信号、信号弱测序峰图 样品内部结构影响及测序峰图 测序仪器影响及测序峰图 纯化因素影响及测序峰图 引物质量影响及测序峰图
正常峰图（有完整峰型、单一峰尖锐独立、QV值基本上为蓝色)
Raw：
Electropherogram：
无信号（无完整峰型、无信号或信号值较低、峰图杂乱无章、绝大部分不可信）
测序PCR与普通PCR的区别
5. 上机测序
5.1 测序样品变性
pcr扩增仪器中95℃变性4min。 .
5.2 上机操作
三、 测序结果分析
怎样看测序结果
怎样得到位点基因型
常见峰图介绍
保证测序结果的准确性
1.怎么看峰图（分析软件Sequence Analysis）
峰图判断三要素：电泳图(Electropherogram)、峰图(Raw)、QV值
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sanger测序原 理
• 双脱氧末端终止法
• 引物设计 • 实验流程 • 上机测序
Sanger测 序的基本 流程
测序结果 的分析
• 怎样分析结果 • 问题峰图分析
一、Sanger测序原理——双脱氧末端终止法
根据设计好的参数，设置使用PCR仪器扩 增.
3.2 PCR产物纯化
纯化的意义
去除PCR反应液的 残留
1.残留的引物：保证引物特异性，避免多重测序 2.残留的dNTP:以保持dNTPs / ddNTPs的最佳 比例 3.盐成分：避免抑制测序酶活性 4.非特异PCR产物：避免扩增出同源性区域
依赖于
纯化（试剂盒） 方式选择
5’ 3’
ddNTP被加到正在合成的链上，由于它的3’-OH已被氧化，下一个dNTP 的5’-磷酸基团不能与之形成磷酸二酯键，使合成终止。 在引物等延伸反应过程中，ddNTP在不同位置掺入，产生了一系列不同 长度的新的DNA片段。
5’
3’
一、Sanger测序原理——双脱氧末端终止法
二、Sanger测序的实验基本流程（以MTHFR(RS1801133)检测为例）
电泳图/QV值 峰图
Raw：峰图
Electropherogram：电泳图
QV值 QV值越高，读图越准确。 QV值为蓝色，表示可信。 QV值为黄色，表示不准确，需要人工判读。 QV值为红色，表示不可信 QV值
2.怎样得到位点基因型（分析软件Chromas）
根据得到位点信息，将位点3‘保守序列（10个碱基左右），在软件中Chromas 查找，前面即为突变基因型。 PS:如果是反向引物测序需要将测序结果反向互补
3.常见峰图介绍及分析
正常及无信号测序峰图 样品内部结构影响及测序峰图
测序仪器影响及测序峰图
纯化因素影响及测序峰图 引物质量影响及测序峰图
染料峰（纯化操作不规范或者ddntp过量）
Raw：
Electropherogram：
返回
3.常见峰图介绍及分析
正常及无信号测序峰图 样品内部结构影响及测序峰图
测序仪器影响及测序峰图
纯化因素影响及测序峰图 引物质量影响及测序峰图
引物降解或者不纯
Raw：
Electropherogram：
Thanks！
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Raw：ElectΒιβλιοθήκη opherogram：返回
测序信号中断（二级结构导致）
Raw：
Electropherogram：
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序列结构高GC导致信号衰减
Raw：
Electropherogram：
返回
3.常见峰图介绍及分析
正常及无信号测序峰图 样品内部结构影响及测序峰图
测序仪器影响及测序峰图
纯化因素影响及测序峰图 引物质量影响及测序峰图
峰图出现断层（可先重跑看是否解决，需要换Buffer）
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Electropherogram（电泳图、QV正常）
毛细管堵塞导致拖尾（可先重跑看是否解决，或者清理毛细管）
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Electropherogram（展开图正常）
毛细管堵塞导致宽峰（可先重跑看是否解决，或者清理毛细管）
Raw：
Electropherogram：
3.测序PCR模板的制备 稀释引物
根据合成回来的引物浓度稀释，一般工作 液10umol/ul(4℃保存)，母液100umol/ul（ -20℃保存）
3.1 PCR扩增
设计方案
1.PCR扩增三步法：变性--退火--延伸 2.退火温度：(Ftm+Rtm)/2-5 3.延伸时间：1kb=1min
pcr仪扩增
1.根据rs号得到位点信息及目标序列 2.引物设计
3.测序PCR模板的制备
4. 测序样品的制备 5.上机测序
1.根据rs号得到位点信息及目标序列
2.引物设计
2.1 primer primer 5.0
+
2.引物设计
2.2 引物特异性检查
2.3 设计引物还需注意
引物纯度（PAGE纯化方式） 不能使用兼并引物测序 测序引物位置距离位点最多600bp，至少50bp 避免荧光标记 测序引物长度16-25bp，TM值50-65℃为宜,55℃最佳 测序引物位置避免Poly（A.T）和高GC结构
•PCR反应的优化程 •PCR产物的质量 选择最佳的纯化方法
1.柱纯化：用于特异PCR产物纯化或存在 <100bp的非特异产物的纯化 (如：引物二聚体) 2.切胶回收：可用于任何质量的PCR产物纯化 切下条带，去除非特异PCR产物和引物二聚体
4.测序样品制备
测序PCR
测序产物 纯化
测序PCR（以回收PCR产物为模板）：96 ℃1 min -(96 ℃ 10 sec 50 ℃ 5 sec - 60 ℃ 4 min) x 25循环-4 ℃保温 酒精/EDTA/NaAc法：•去除残留的BigDye Terminator(染料 峰) •测序产物脱盐 •纯化好的测序产物比较稳定
Raw：
Electropherogram：
信号弱（有较完整峰型、信号值较低、峰图部分可信）
Raw：
Electropherogram：
3.常见峰图介绍及分析
正常及无信号测序峰图
样品内部结构影响及测序峰图 测序仪器影响及测序峰图 纯化因素影响及测序峰图 引物质量影响及测序峰图
poly（A、T）结构导致后双峰
3.常见峰图介绍及分析
正常及无信号、信号弱测序峰图 样品内部结构影响及测序峰图 测序仪器影响及测序峰图 纯化因素影响及测序峰图 引物质量影响及测序峰图
正常峰图（有完整峰型、单一峰尖锐独立、QV值基本上为蓝色)
Raw：
Electropherogram：
无信号（无完整峰型、无信号或信号值较低、峰图杂乱无章、绝大部分不可信）
测序PCR与普通PCR的区别
5. 上机测序
5.1 测序样品变性
pcr扩增仪器中95℃变性4min。 .
5.2 上机操作
三、 测序结果分析
怎样看测序结果
怎样得到位点基因型
常见峰图介绍
保证测序结果的准确性
1.怎么看峰图（分析软件Sequence Analysis）
峰图判断三要素：电泳图(Electropherogram)、峰图(Raw)、QV值