肿瘤细胞原代培养及药敏_MTT法_的质量控制

肿瘤细胞原代培养及药敏(MTT法)的质量控制
徐文科1,乔小云2
(1.安徽省皖南医学院弋矶山医院,安徽芜湖241001;2.江苏省南京市鼓楼医院,江苏南京210008)
摘要:目的考察肿瘤细胞原代培养及药敏(MTT法)各项操作规程,为质量控制提供实践依据。

方法在操作过程中,注意强化无菌操作、规范化取舍标本、显微镜下控制单细胞悬液浓度、培养和测定条件的控制、工作液稳定性的研究。

结果
肿瘤细胞原代培养及药敏(M TT法)的结果稳定性有了很大的提高。

结论通过严格控制实验操作程序,肿瘤药敏M TT 法的临床相符性令人满意,可在实际工作中推广。

关键词:肿瘤细胞;培养;药敏;质量控制
肿瘤细胞培养和药敏实验是筛选抗肿瘤药物的主要研究方法[1,2]。

不合适的临床抗肿瘤化疗药物不仅使治疗失败,同时能诱导肿瘤细胞产生耐药性。

因此,对提高临床疗效、减轻毒副作用也具有重要的意义[3]。

目前国内的医疗机构中,对肿瘤组织进行细胞培养及药敏实验大多采用体外四氮唑盐(M TT)法,具有操作简便、成本低廉、耗时少、无放射性等优点[4~6]。

该法主要的缺陷是,结果不稳定导致与临床相符性差。

究其原因,因为在整个操作过程中,需要严格质量控制的步骤较多,各种操作过程需要多次试验来验证[7,8]。

我们在实际工作中,通过流程质量控制,获得了比较满意的结果。

现报道如下。

1操作规范化
1.1强化无菌操作在细胞培养及药敏实验时,需要配制1640培养液、工作浓度的试剂和抗肿瘤药物、含有抗生素的生理盐水等。

这些药液的配制要求必须在净化的空间中配制,以免有细菌的污染。

参与配制的玻璃瓶、培养皿、不锈钢细胞滤筛、试管、移液管、吸头等器械均需在清洗后121e、30 m i n水蒸汽湿热灭菌。

对微量移液系统、洗耳球等不宜湿热灭菌的物品,在实验操作前后,用75%乙醇或0.1%醋酸氯己定溶液擦拭灭菌,可以获得较好的无菌效果。

1.2病理标本的规范化取舍一般来说,在室温条件下,组织细胞离体2h,后,活性受影响。

由于患者的情况不一,肿瘤的大小、分型不同,对标本的处理需加强/时效0观念。

必须与手术医师、手术室、病理科加强沟通。

标本离体后,应在第一时间送到病理科(或由病理科医师在手术室将标本进行处理),尽量去除标本上的坏死组织、成纤维组织、脂肪组织、肿瘤周围的正常组织,洗净血水、分泌物等,浸泡于含抗生素的生理盐水瓶中,尽快送到肿瘤药敏实验室。

但是对标本量的多少,有学者建议为1.5c m[3,4],由于受肿瘤组织本身大小的限制,可能无法提供如此体积的标本。

根据我们的经验,0.5 c m@0.5c m@0.5cm或略小,只要研磨充分,也可以制备出良好的单细胞悬液。

1.3肿瘤细胞单悬液的制备在将标本放入不锈钢筛网进行研磨时,最合适的细胞浓度是每毫升1@105~1@106[4,5]。

此操作的浓度较大,必须边研磨,随时用显微镜观察,直到视野中有均匀、多量的单细胞为止。

研磨时间的长短可以根据不同的标本调整。

若在工作中没有控制好研磨时间,导致细胞浓度过高,产生的紫色甲臜结晶较多,将难以判断药物的抑制率。

1.4培养时间的确定一般要求在37e、5%CO
2
培养箱中培养48~72h,在整个过程中,不能断电、断气,否则效果受影响。

如果培养24~36h后,培养液的颜色已经变黄,即可以进行下一步的操作而不需继续培养,缩短出报告的时间,降低成本。

1.5甲臜结晶的溶解现有的操作程序要求在标本中加入
10%十二磺基硫酸钠(SDS)后,震荡30m in,再置于室温30~ 120m i n,待结晶完全溶解后测定。

我们的工作体会是,震荡
30m i n后,置于37e、5%CO
2
培养箱中继续培养1h,能达到完全溶解甲臜结晶的目的,并且测定结果相当稳定。

2根据工作需要,探讨相关研究
2.1抗肿瘤药物浓度的探讨相关的文献报道有采用人体药物峰浓度、2倍峰浓度和5倍峰浓度甚至10倍浓度等[5,9,10]。

由于体内体外环境的差异,如果低浓度在体外有良好的抑制作用,采取1/2倍峰浓度是否可行有待于在以后的工作中继续探索、验证。

特别是对昂贵的部分药物来说,降低成本对医院、对病人均有重要的经济意义。

2.2工作液的冻融稳定性研究含抗互素的生理盐水、M TT 液均不稳定,需现配现用。

由于所需的浓度均很低(青霉素100~200I U#m l-1链霉素100~200I U#m l-1、M TT2~5 g#L-1)。

为了防止浪费,整个配制过程中耗时较长。

可以一次配制合适的量并冷冻(-20e)保存,需要时再室温解冻。

抗肿瘤药物由于品种多,相对浓度不一,临时配制困难多。

预先储备,大多数药物的稳定性又差,在2~8e范围内推荐保存24h。

短期的冷冻储存不影响药物的抑制活性。

如果一次配制多量后冷冻储存,随着解冻次数的增加,药物对肿瘤细胞的抑制率偏低,影响结果的稳定性。

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(收稿日期:2007-12-27)
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