肿瘤细胞培养方法和培养基
人肿瘤细胞培养的原理
人肿瘤细胞培养的原理人肿瘤细胞培养是指将来自人体中的肿瘤组织或细胞分离、培养和保存的过程。
这种细胞培养技术不仅在医学研究领域具有重要意义，也被广泛地应用于药物筛选、毒性测试及疾病模型的构建等领域。
人肿瘤细胞培养的原理主要包括以下几个方面：1. 肿瘤细胞的分离和培养基的选择：首先从人体肿瘤组织中获得细胞，通常采用手术、活检或穿刺等方法取得。
然后将组织样本经过切碎、消化酶处理等步骤，使其中的细胞得以分离。
根据所选细胞类型的不同，可以选择适当的培养基来维持细胞的生长、增殖和功能维持。
常用的培养基包括DMEM （Dulbecco's Modified Eagle Medium，杜尔贝科修正鹰鳝培养基）、RPMI 1640（Roswell Park Memorial Institute 1640）、F12（Ham's F-12鹰鳝培养基）等。
2. 细胞的传代：肿瘤细胞培养的过程中，细胞会经过一系列的传代过程。
一般情况下，初始细胞数较少的细胞会在培养基中进行扩增，达到一定的细胞数量后，需要进行传代。
传代是将已经增殖的细胞在一个新的培养器中继续培养的过程。
传代过程需要注意，细胞的数目、培养基的成分和细胞培养器的选择等因素都会影响细胞的传代效果。
3. 培养条件的优化：为了使肿瘤细胞在体外更好地生长和繁殖，需要优化培养条件。
这包括培养基的配方、温度、pH值、气体组成等因素的调整。
培养基中通常会添加适当的营养物质，如氨基酸、脂类、维生素和微量元素等，以满足细胞的生长需求。
同时，细胞培养过程中需要保持适当的温度和湿度，通常将温度维持在37，湿度维持在95％以上。
还需要提供合适的气体环境，如5％CO2 /空气混合体，以维持细胞生长所需要的适宜pH值。
4. 检测细胞的纯度和活力：细胞培养过程中，需要定期检测细胞的纯度和活力。
细胞的纯度是指细胞中肿瘤细胞的比例，可以通过免疫细胞化学、流式细胞术等方法进行检测。
肿瘤干细胞的分离培养及其在肿瘤治疗中的应用
肿瘤干细胞的分离培养及其在肿瘤治疗中的应用随着医学技术的不断前进，对肿瘤治疗的研究也越来越深入。
其中，肿瘤干细胞的研究备受关注。
肿瘤干细胞是指在肿瘤中所存在的一小部分细胞，能够不断分裂增殖，并给予肿瘤再生的可能性。
因此，肿瘤干细胞的分离与培养以及在肿瘤治疗中的应用，成为了当今医学研究的热点话题。
一、肿瘤干细胞的分离方法目前，分离肿瘤干细胞的方法主要包括紫杉醇浸润法、细胞表面标记法、限制稀释法等。
其中，限制稀释法是较为常用的一种。
限制稀释法是将单个肿瘤细胞样本通过连续的稀释、培养与观察，逐渐筛选出肿瘤干细胞。
它通过观察单个细胞的生长、分裂、增殖情况，来得出大量肿瘤细胞当中的干细胞。
虽然这种方法过程复杂、费时费力，但是它能够筛选出更加纯度高的肿瘤干细胞。
二、肿瘤干细胞的培养方法早期肿瘤干细胞的培养，主要采用血清补充的液体培养基进行细胞的培养。
但是在这种培养条件下，肿瘤干细胞很容易分化。
因此，近年来，越来越多的实验室采用无血清培养条件进行肿瘤干细胞的培养，以维持肿瘤干细胞的稳定状态。
无血清培养条件下，需要选择不同种类的培养基，添加多种生长因子与细胞基质，来模拟肿瘤干细胞自身的生长环境。
同时，还需注意对细胞的密度、温度、pH 值、CO2浓度等生理性因素的控制。
三、肿瘤干细胞在肿瘤治疗中的治疗应用肿瘤干细胞的研究在肿瘤治疗中，具有重要的应用价值。
首先，肿瘤干细胞作为肿瘤治疗的靶点，开启了新的临床治疗途径。
其次，肿瘤干细胞可以用于评估肿瘤药物的治疗效果，这一评价标准能够更为准确反映药物的实际效果。
此外，肿瘤干细胞还可以用于评估肿瘤的预后情况，帮助医生选择更加有效的治疗方式。
总之，肿瘤干细胞的研究在肿瘤治疗研究领域，具有非常重要的价值。
分离肿瘤干细胞、培养肿瘤干细胞以及开展针对肿瘤干细胞的治疗策略，将有助于提高肿瘤治疗的效果，为患者带来更好的治疗效果。
肿瘤干细胞培养条件与方法
肿瘤干细胞培养条件与方法
肿瘤干细胞培养条件和方法可能因不同的肿瘤类型和研究目的而有所差异。
以下是一般的肿瘤干细胞培养条件和方法的概述：
1. 肿瘤组织获取：从患者或动物模型中获取肿瘤组织样本。
2. 肿瘤细胞分离：使用适当的方法，如酶消化或机械破碎，将肿瘤组织分离成单个细胞。
3. 细胞筛选：通过特定的标志物或功能特性，如表面标志物表达、干细胞特性等，筛选出肿瘤干细胞。
4. 培养条件：肿瘤干细胞通常需要特殊的培养条件，如无血清或低血清培养基、特定的生长因子和细胞因子、合适的气体环境等。
5. 细胞培养：将筛选出的肿瘤干细胞接种到培养容器中，并提供适当的培养条件，包括温度、湿度、气体环境等。
6. 监测和鉴定：定期观察肿瘤干细胞的生长情况、形态和功能特性，通过免疫荧光染色、流式细胞术等技术鉴定其干细胞特性。
需要强调的是，肿瘤干细胞的培养和研究是一个复杂的领域，需要专业的技术和设备。
肿瘤细胞培养方法
肿瘤细胞培养方法
肿瘤细胞培养成功关键在于：取材、成纤维细胞的排除、选用适宜的培养液和培养底物等几个方面。
在具体培养方法方面，肿瘤细胞培养与正常组织细胞培养并无原则差别，初代培养应用组织块和消化培养法均可。
1、取材：
人肿瘤细胞来自外科手术或活检瘤组织。
取材部位非常重要，体积较大的肿瘤组织中有退变或坏死区，取材时尽量避免用退变组织，要挑选活力较好的部位。
癌性转移淋巴结或胸腹水是好的培养材料。
取材后宜尽快进行培养，如因故不能立即培养，可贮存于4℃中，但不宜栽过24小时。
2、培养基：
肿瘤细胞对培养基的要求不如正常细胞严格，一般常用的RPMII640. DMEM s Mc-Coy等培养基等皆可用于肿瘤细胞培养。
肿瘤细胞对血清的需求比正常细胞低，正常细胞培养不加血清不能生长，肿瘤细胞在低血清培养基中也能生长。
肿瘤细胞对培养环境适应性较大,是因肿瘤细胞有自泌(Autocrine )性产生促生长物质之故。
但这并不说明肿瘤细胞完全不需要这些成分。
按不同细胞需要不同的生长因子；肿瘤细胞与正常细胞之间、肿瘤细胞与肿瘤
细胞之间对生长因子的需求都存在着差异。
但大多数肿瘤细胞培养中仍需要生长因子。
有的还需特异性生长因子〔如乳腺癌细胞等）。
总之培养肿瘤细胞仍需加血清和相关生长因子培养更易成功。
肿瘤细胞培养基本方法
肿瘤细胞培养基本方法(一)准备和安装过滤器清洗好过滤器，干燥，放入一张孔径0.22μm的微孔滤膜，用布包装好，15磅20 min进行高压灭菌处理。
在超净台内打开过滤器架好，胶管一端接入滤泵再插入待除菌的液体中，出口端胶管深入到已消毒好的瓶子中。
用泵过滤，过滤后要检查滤膜是否完好无损。
(二)合成培养基的配制1、根据细胞目录中的说明，按下表选择合适品牌及货号的培养基干粉，用适量超纯水充分溶解。
培养基品牌货号D-MEM/F-12 GIBCO 12400024GIBCO 12800017 Dulbecco's Modified Eagle Medium (D-MEM), powder (highglucose)F-12 Nutrient Mixture (Ham) powder GIBCO 21700075Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) powder GIBCO 12200036Leibovitz's L-15 Medium powder GIBCO 41300039McCOY's 5A SIGMA M4892Minimum Essential Medium (MEM) Alpha Medium powderGIBCO 11900024 (MEMα)with ribonucleosides and deoxyribonucleosidesGIBCO 12000022 Minimum Essential Medium (MEM) Alpha Medium powder(MEMα)without ribonucleosides and deoxyribonucleosidesMinimum Essential Medium (MEM) powder GIBCO 41500034NUTRIENT MIXTURE F12 HAM KAIGHN'SSIGMA N3520 MODIFICATION (F12K)RPMI Medium 1640 GIBCO 31800022EGF SIGMA E9644Sodium pyruvate SIGMA P2256-25GSIGMA M5017 MEDIUM 199, WITH EARLE'S SALTS ANDL-GLUTAMINE, WITHOUT SODIUM BICARBONA TE.CELL CULTURE TESTED2、按要求添加碳酸氢钠、谷氨酸钠、HEPES等，充分搅拌使之溶解。
常用肿瘤细胞株的培养
常用肿瘤细胞株的培养常用肿瘤细胞株的培养是细胞试验室的日常工作之一，常用的肿瘤细胞株无数，各试验室所用法和保存的细胞株种类各异，培养的办法和习惯也不尽相同。
本节介绍了五种常用的肿瘤细胞株的培养和复苏、冻存的办法。
一、乳腺癌细胞株的培养乳腺癌细胞系的种类无数，而且功能各异，下面介绍几种常用的乳腺癌细胞系的培养的办法。
（一）MCF 一细胞株的培养 MCF-7是一种易于培养的人乳腺癌细胞，来源于乳腺腺癌组织，贴壁生长，形态不规章。
普通培养基采纳DMEM，含10％的。
贴壁生长后，2～3天即可传代。
【材料】 1．冻存的MCF-7细胞株。
2．培养基（DMEM）含10％、含EDTA终浓度为0.25％的,75％。
3．培养瓶、无菌的玻璃吸管或自立包装的塑料吸管、离心管。
【办法】 1．培养细胞的换液 (1)预备好超净工作台，将试剂及材料用75％杀菌后置于超净台，开头试验。
(2）从孵箱中取出培养瓶首先要认真观看培养基有无污染或衰退迹象。
(3)观看培养．基的pH和细胞密度及浓度，如培养基从红色变成橙色，或变成黄色，解释培养基的pH已变酸，需要更换培养基；如培养基从红变为紫色，解释培养基的pH已变碱，可能细胞已死亡，需拣出丢弃。
(4）将细胞培养瓶置于无菌工作区域，无菌操作打开培养瓶瓶盖，倒掉培养液。
(5）用PBS反复冲洗细胞2～3遍，细胞培养条件要求苛刻的，可用细胞培养液冲洗细胞。
(6)加入预热的培养基，倒置显微镜下观看，放入培养箱中培养。
2．细胞的传代 (1)预备超净工作台，将试剂及材料用75％杀菌后置于超净台，开头试验。
(2)认真检查培养基DMEM有无污染或衰退迹象。
(3)在镜下观看MCF-7细胞是否需要传代（主要看细胞密度是否长至彼此汇集，铺满培养瓶即可传代），若需要传代，举行如下操作。
(4）将MCF-7细胞置于超净台无菌工作区中，弃去原培养基。
(5)加入无血清培养液并轻轻晃动培养瓶，用培养液清洗细胞，然后弃去清洗液。
肿瘤干细胞实验方法
肿瘤干细胞实验方法肿瘤干细胞是一种新型细胞，具有自我更新，自我修复，多向分化和肿瘤形成的潜能。
它们在肿瘤的形成、发展和复发过程中扮演着重要的角色，因此对肿瘤干细胞的实验研究具有重要的意义。
本文将介绍肿瘤干细胞实验的基本方法。
1. 肿瘤干细胞培养肿瘤干细胞可通过单细胞克隆形成球体的方式进行培养，这种方法又被称为肿瘤球体培养。
其步骤如下：1) 确定肿瘤细胞株中的肿瘤干细胞含量。
2) 将肿瘤细胞株悬浮在无血清培养基中，添加必须的生长因子如EGF和FGF等，使其形成肿瘤球体。
3) 观察肿瘤球体的形成和生长情况，并进行维持和分离。
肿瘤球体与普通二维培养方式相比，具有较高的肿瘤干细胞含量，并具有良好的体外模拟肿瘤生长和浸润的特性。
此外，肿瘤球体可直接用于药物筛选和肿瘤干细胞信号机制的研究。
肿瘤干细胞的鉴定是肿瘤干细胞研究的重要环节。
主要通过以下两种方法进行：1) 流式细胞术通过肿瘤干细胞表面标志物表达的差异，通过流式细胞仪的分析来鉴定和筛选肿瘤干细胞。
常用的肿瘤干细胞表面标志物有CD133、CD44、CD24和ESA等。
2) 功能性鉴定法此方法是通过肿瘤干细胞的自我更新和多向分化的特性来进行鉴定。
肿瘤干细胞应该具有自我更新的能力，同时还具有多向分化的潜能，可以分化成多种类型的细胞。
通过上述方法鉴定出的肿瘤干细胞，需要进一步进行分选。
常用的方法有磁珠分选、流式细胞术和细胞筛等。
磁珠分选法是利用与表面标志物相关的磁珠对肿瘤干细胞进行筛选和富集。
流式细胞术，是利用表面标志物和细胞生物学特性进行筛选和富集。
细胞筛法是根据肿瘤干细胞的体积和生长特性进行富集。
4. 肿瘤干细胞治疗效果评价1) 体内治疗将肿瘤干细胞或肿瘤球体种植到动物体内，并进行药物治疗，以评价药物对于肿瘤干细胞的杀伤效果。
例如, 免疫缺陷小鼠移植瘤模型。
2) 体外药物筛选3) 分子生物学方法通过单细胞的特异性PCR和实时荧光PCR等分子生物学方法，检测肿瘤干细胞相对于肿瘤非干细胞的基因差异，从而评价治疗效果。
ctc培养方法
ctc培养方法CTC培养方法CTC（循环肿瘤细胞）是指从肿瘤组织或肿瘤患者的外周血中检测到的脱落的肿瘤细胞。
CTC的检测和分离是目前肿瘤临床诊断和治疗中的热点研究方向之一。
下面将介绍一种常用的CTC培养方法。
一、细胞准备在进行CTC培养之前，需要从肿瘤患者的外周血中分离出CTC。
首先，采集患者的外周血样本，并利用血液分离管或密度梯度离心法将血液分离为上清液和红细胞沉淀。
然后，使用CTC捕获技术，如磁珠捕获、细胞过滤或微流控芯片等方法，将CTC从上清液中富集出来。
最后，使用显微镜或流式细胞术确认CTC的存在并计数。
二、细胞培养基准备为了成功培养CTC，需要准备适用的细胞培养基。
常用的细胞培养基包括DMEM、RPMI-1640等。
在培养基中加入适当浓度的胎牛血清、抗生素和生长因子，以提供细胞所需的营养物质和生长环境。
三、细胞培养条件将分离出的CTC转移到预先准备好的细胞培养基中。
将细胞培养皿置于恒温培养箱中，保持适宜的温度（通常为37℃）。
此外，还需提供适当的CO2气体环境以维持细胞的酸碱平衡。
四、细胞培养监测在CTC培养的过程中，需要定期观察和监测细胞的生长情况。
使用显微镜观察细胞的形态和数量，并记录相关数据。
此外，还可以通过免疫组化染色、蛋白质检测等方法，对CTC的特征和功能进行进一步分析。
五、细胞培养维持为了维持CTC的生长和增殖，需要定期更换培养基，以提供新鲜的营养物质。
同时，还需注意细胞密度的控制，避免细胞过度生长或过度稀释。
此外，还需注意细胞的传代问题，及时进行细胞的传代以保持CTC的活性和稳定性。
六、细胞培养应用通过CTC的培养，可以进一步研究肿瘤细胞的生物学特性、耐药机制和转移能力等。
此外，还可以利用培养的CTC进行药物敏感性测试，评估不同药物对肿瘤细胞的作用效果，为个体化治疗提供参考依据。
CTC培养是一种重要的肿瘤研究方法，通过适当的细胞准备、细胞培养基准备和培养条件控制，可以成功培养出CTC，并利用其进行肿瘤研究和个体化治疗的相关应用。
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肝癌细胞培养
一、培养基
1、 RPMI-1640+ 10%胎牛血清培养基
2、 DMEM+ 15%胎牛血清培养基
成分表
二、实验前准备工作:
操作者的皮肤、培养瓶的盖和外壁常用酒精消毒。
用紫外线消毒实验室空气、工作台面和一
些不能使用其他方法消毒的培养器皿。
进无菌室前或做完实验后，均应开灯照射 30min 进行消毒。
紫外线照射 60min 可以消灭空气中大部分细菌。
1、玻璃器皿的清洗灭菌（5％盐酸溶液、重鉻酸钾120ml 、硫酸 200ml、蒸馏水200ml ）：（1）浸泡 :新使用或重复使用的玻璃器皿须经5％盐酸溶液或自来水浸泡过夜或煮沸30min ，水洗。
以去除新购进玻璃器皿所带有灰尘、铅、砷等物质，并消除其弱碱性。
（2）刷洗 :浸泡后用软毛刷和优质的洗洁精进行刷洗。
刷洗后经行烘干。
（3）酸浸 :刷洗后的玻璃制品酸浸前须适当晾干或烘干，以免造成酸浸液稀释，影响效果。
将玻璃制品完全浸泡入清洁液中24h。
清洁液具有极强酸蚀作用，操作过程需戴防护用具。
（4）冲洗、烘干备用 :浸酸后的玻璃器皿先用自来水充分冲洗，吸管需冲洗 10min ，器皿需每瓶灌满
自来水、倒掉反复 10 次以上，不留任何酸浸液残迹，然后用蒸馏水漂洗 2～ 3 次，将清洗好的玻璃器
皿放入烘干箱中，烘干后的玻璃器皿要求干净透明，无油烟，不能残留任何有害物质及化学药品等。
（5）包装灭菌 :器材经清洗烤干或晾干后，先应严格包装，然后再行消毒灭菌处理，以防止
消毒灭菌后再次遭受污染。
包装材料常用包装纸、牛皮纸、硫酸纸、棉布、铝饭盒、玻璃或
金属制吸管筒、纸绳等。
2、橡胶制品清洗消毒：
0.5mol/L NaOH 煮沸 15 分钟，流水冲洗，
2 次，蒸馏水煮沸20 分钟， 50℃烤干备用
3、塑料制品的清洗消毒（瓶盖、离心管）0.5mol/L
HCl ：
煮沸15 分钟，流水冲洗，自来水煮沸
使用器皿后立即用清水清洗，浸于自来水过夜，用纱布或棉签和50℃清洗液刷洗，流水冲洗，晾干，浸于清洁液15 分钟，流水冲洗（15－ 20 遍） ,蒸馏水浸洗三次，双蒸水泡24 小时，晾干备用。
三、细胞复苏：
冻存细胞保存管保存在液氮中（ -196℃），取出保存管后必须快速冷冻，以避免冰晶重新结晶
而对细胞造成伤害，致使细胞死亡。
在冻存细胞的保存管中含有对细胞有毒害的成分
DMSO,故在解冻应马上将其去除。
在冷冻活化前应在无菌台上将细胞培养液配好，然后将保存管从液氮中取出，放于 37℃的温水中快速使细胞解冻。
解冻后悬液快速移入培养液中混
匀，离心去掉上清液，再加入细胞培养液。
实验人员穿上无菌实验室操作服用酒精喷于手上消毒，然后就位用酒精棉球擦拭实验台
（1）取一 15ml 离心管用滴管在其内滴加5--9ml 培养液（取 8ml ）。
（2）从液氮罐中取出冻存管，并迅速放入37℃水浴，不时摇动，使其急速融化，30～ 60s 内完成。
（3）冻存管用 70％酒精擦拭消毒后，打开盖子，用吸管将细胞悬液转移入上述离心管中（用培养基把冻存管洗一遍，把粘在壁上的细胞都洗下来）。
（4）低速离心 (1000r ／ min) 5min ，去上清后再用8ml 培养液再清洗离心一次。
（5）离心后倒掉上清液，在离心管中滴加 3ml 培养液（ RPMI-1640），混匀（可用滴管轻柔吹打）。
（6）将离心管中的混合液转移到培养瓶中，并在培养瓶中滴加 15 滴 10%小牛血清，盖上瓶盖，标好细胞种类和日期、培养人姓名等，将培养瓶平放，置于37° C 培养箱中培养。
2-3天换一次培养基。
四、细胞传代：
当观察到培养瓶中细胞铺满度为90%时（细胞生长处于对数期时），解冻复活成功后的细胞要进行分离培养，否则细胞会因生存空间不足或密度过大，营养障碍，影响细胞生长。
细胞由原培养瓶内分离稀释后传到新的培养瓶中培养的过程称之为传代培养。
传代细胞细胞株的最大利处在于提供了大量持久的实验材料，便于实验。
（1）试验台的消毒工作准备好，弃去旧培养液，用PBS液（不含钙，镁离子）洗1-2 次，以免剩余培养液影响胰蛋白酶活性。
（细胞贴壁生长）。
（2）向瓶内加入 1ml 消化液（0.25%Trypsin-0.53mEDTA），置于 37℃孵箱或室温（ 25℃温度）下进行消化， 1--3min 后把培养瓶放在倒置显微镜下进行观察，当发现胞质回缩、细胞间隙
增大后，应立即中止消化（将培养瓶翻转过来，以保证细胞没有脱壁）。
备注：若细胞没有脱壁，生长良好，则直接倒掉消化液，加培养液8ml，离心收集细胞；若发现很多细胞已解离已脱壁（即解离过度），则直接加培养液进行离心收集细胞。
（4）倒出消化液，向瓶内用滴管加入培养液少量（约2ml ），轻轻转动培养瓶，把残留胰蛋
白液消化液冲掉，然后再加3ml 培养液 +15 滴小牛血清。
（5）使用吸管，吸取瓶内培养液，按顺序反复轻轻吹打瓶壁细胞，使之从瓶壁脱离形成细
胞悬液。
吹打时动作要轻柔，以防用力过猛损伤细胞。
（6）将准备好的细胞悬液转入离心管中，离心(1000r ／ min) 5min 。
（7）将离心后离心管中液体倒掉，在离心管中加入3ml 培养液，并反复吹打细胞，制成细
胞悬液。
（8）取 3 个无菌培养瓶，酒精棉球擦拭消毒，并在酒精灯下过火消毒。
（9）在培养瓶中各加入 1ml 细胞悬液、 2ml 培养液（用移液枪）、 15 滴小牛血清，加好后酒
精灯下过火加塞。
（10）细胞培养换液时间应根据细胞生长的状态和实验要求来确定。
一般2～ 3d 后应换一次生长液。
待细胞铺满器皿底面，即可使用；也可继续传代扩大培养或换成维持液。
五、细胞冻存：
细胞的冻存最常用的方法是液氮冷冻保存法，主要是加入适量的保护剂缓慢的冷冻细胞。
由于细胞在不加任何保护剂的情况下，细胞内外水分会很快结成冰晶，从而引起一系列不良反应。
如细胞脱水使局部电解质浓度升高，PH 值改变，部分蛋白质因此变性使细胞内部结构
紊乱，溶酶体膜被破坏而放出大量酶将细胞内部结构破坏。
因此在细胞冻存时的关键是尽可能减少细胞内水分，减少细胞内冰晶的形成，故冻存时采用甘油或DMSO 做保护剂，这两种物质分子量较小，溶解度大，易穿透细胞，可使冰点下降，提高细胞膜对水的通透性，对
细胞毒害作用小，梯度慢速冷冻可使细胞内水分渗出细胞外，减少形成冰晶对细胞产生的伤害。
细胞低温冻存是培养室常规工作和通用技术。
细胞冻存在-196℃液氮中，储存时间几乎是无限的。
细胞冻存及复苏的原则是慢冻快融。
（1）选对数增生期细胞 (细胞铺满度为 90%左右时 )，在冻存前 1d 换液。
（2）试验台的消毒工作准备好，倒掉培养瓶内旧培养液。
（3）向瓶内加入 1ml 0.25%胰蛋白酶液，以能覆盖培养瓶底为宜。
（4）置 37℃孵箱或室温（ 25℃温度）下进行消化， 1--3min 后把培养瓶放在倒置显微镜下进行
观察，当发现胞质回缩、细胞间隙增大后，应立即中止消化。
（5）吸出消化液，在吸除胰蛋白液后，直接加入3ml 培养液 +15 滴小牛血清，终止消化。
（6）使用弯头吸管，吸取瓶内培养液，按顺序反复轻轻吹打瓶壁细胞，使之从瓶壁脱离形
成细胞悬液。
吹打时动作要轻柔，以防用力过猛损伤细胞，按常规方法把培养细胞制备成悬液。
（7）将培养瓶中的细胞悬液转移到15ml 离心管中， (1200r ／ min) 6min ，去掉上清液。
再加3ml 培养液按常规方法形成细胞悬液。
（8）配制冻存培养液（培养液7ml ，10%小牛血清2ml ，10%DMSO 1ml），于离心管中加入
1ml 细胞悬液，加入适量配制好的冻存培养液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀。
（9）将细胞悬液分装入无菌冻存管中，每管 1.5 ml（冻存液要先预冷到 4℃）；在冻存管上标明细胞的名称，冻存时间及操作者。
（10）冻存：标准的冻存程序为降温速率 -1～ -2℃ / min ；当温度达 -25℃以下时，可增至 -5℃～ -10℃ / min ；到 -100℃时，则可迅速浸入液氮中。
也可将装有细胞的冻存管放入 -20℃冰箱 2h ，
然后放入液氮气中过夜，取出冻存管，移入液氮容器内。