还原糖和总糖的测定

生物化学综合实验报告

题目：3,5-二硝基水杨酸比色法测定还原糖和总糖

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1.实验目的

用比色法测定山芋中还原糖和总糖含量

2.实验原理

先用已知浓度的葡萄糖标准溶液与DNS反应测其分光度，制得标准曲线，在测山芋中糖与DNS反应后的分光度A从而得其总糖和还原糖含量。

3.实验仪器和试剂

试剂：1g/L葡萄糖标准液、3,5-二硝基水杨酸、6mol/L HCl，6mol/L NaOH

仪器：25,100ml容量瓶、1,5ml吸量管、50ml移液管、100ml 量筒、试管、滴管、离心管、玻璃棒、洗耳球、100ml容量瓶、比色皿离心机、分光光度计、恒温水箱

4.实验步骤

一、取六只比色管向其中加入葡萄糖标液0、0.2、0.4、0.6、

0.8、1.0毫升在加入蒸馏水2.0、1.8、1.6、1.4、1.2、1.0毫升，最后向其中各加入DNS试剂1.5毫升混合均匀后100摄恒温水浴5min，冷却后加入蒸馏水至25ml刻度线，用1号样调零，测其分光度，制得标准曲线。

二、还原糖提取:取3g山芋粉，加入30ml水，搅匀后在50摄水中保温20min，离心，取滤液，用100ml容量瓶定容得还原糖待测液。

总糖提取：取0.2克山芋粉，加入试管中吸取5ml HCL溶液，8ml蒸馏水搅匀，100摄下恒温水浴30min，冷却，NaOH调节PH至中性，离心，滤液用100ml容量瓶定容，得总糖待测液。

测定时取5支比色管分别加入还原糖0、1.0、1.0、0、0毫升，总糖0、0、0、0.5、0.5毫升，蒸馏水2.0、1.0、1.0、1.5、1.5毫升，DNS试剂1.5毫升100摄恒温水浴5min后冷却，稀释至25毫升用一号管调节分光度为0，测总糖和还原糖的分光度。

5数据处理

测量得还原糖和总糖：

m还原糖=0.4235*（A6+A6’）/2=0.0019mg

m总糖=0.4235*（A7+A7’）/2=0.1910mg

ω还原糖=m曲线葡萄糖*(V总/V测）/m样品*100% ω还原糖=0.0019*(100/1)/3000*100%=0.0063% ω总糖=m曲线葡萄糖*(V总/V测）/m样品*100% ω总糖=0.191*(100/0.5)/200*100%=19.1%

6.注意事项

⏹离心时中心对称的离心管质量要基本相等

⏹可以增加山芋粉的质量来使得还原糖易于测量

7．思考题

⏹DNS比色法是如何对总糖进行测定的？

用HCl水解总糖中的非还原性糖从而得到还原糖进而测其所含的量

⏹绘制标准曲线时所取得物质质量和体积必须精确，标准物

质浓度不能过高否则与分光度不成线性关系，在测分光度前必须用空白样调零等等。