抗肿瘤抗生素力达霉素
抗肿瘤抗生素力达霉素
抗肿瘤抗生素力达霉素摘要：力达霉素属于烯二炔类抗肿瘤抗生素，可以通过发酵、生物合成以及化学合成获得。
力大霉素由一个酸性蛋白和一个烯二炔发色团通过非共价键结合而成，通过多种作用机制在体内外对多种肿瘤产生强烈的抗肿瘤作用。
目前，力达霉素已经进入Ⅱ期临床研究，本文介绍了力达霉素的发酵及生物、化学合成方法，抗肿瘤作用和分子作用机制方面的新进展。
关键词：力达霉素；发酵工艺抗肿瘤作用Abstract: Lidamycin, a member of the enediyne anticancer antibiotics family. Can be acquired by fermentation，biosynthesis，chemosynthesis. Lidamycin is composed of chromophore andapoprotein with noncovalent binding. It exerts potent antitumor activities on a variety of cancer in vitro and in vivo by different mechanisms. Lidamycin is currently evaluated in Phase II clinical trials. In this review we discussed recentprogresses in fermentation , biosynthesis , chemosynthesis ,molecular mechanisms and antitumor activities of lidamycin.Key words: Lidamycin; Fermentation process;Antitumor activity前言力达霉素(lidamycin, LDM)原名C1027，是从我国湖北省潜江县土壤中分离出的一株链霉菌Streptomyces globisporus c-1027产生的大分子肽类抗肿瘤抗生素，它是采用精原细胞法筛选得到的，其结构独特，由一个含110个氨基酸的酸性蛋白(MW10, 500)和一个含烯二炔结构的发色团(MW 843)通过非共价键结合而成(图1)，属于烯二炔类抗肿瘤抗生素。
力达霉素抗肿瘤作用及其分子机制研究新进展
Hale Waihona Puke 抗肿 瘤作用 及 分子机 制方 面 的新进 展进行 综述 。 １ 力达霉 素 的抗肿瘤 作用 １１ 体 外抗 肿瘤 作用 ． Ｌ ＤＭ是经 过 精 原细 胞 法 筛选 得 到 的 ，在 体外 具 有 极强 的杀 伤 肿 瘤细 胞 的作 用 。按 克 隆 生 存测 定 的
ａ ｏ ｏ ｅ ｎ ｗｉｈ ｎ ｎｃ ｖ ｌｎ ｉ ｄｉ Ｉ ｘ ｃｓｐｏ ｅ ｔａ ｔｔ ｐ ｐｒ ｔ ｉ ｔ ｏ ｏ ａ ｅ ｔｂ ｎ ｎｇ． ｔ ｅ ｔｎ ｎ ｉ ｅ ｕｍｏ ｃ ｉ ｉｉ ｓｏ ｒｅｙ ｏｆｃ ｎ ｅ ｎｖｉ ｏ ａ ｄ ｉ ｖ ｒａ ｔｖ ｔｅ ｎ ａｖａ ｔ ａ ｃ ｒｉ ｔ ｎ ｖｉ ｏｂｙ ｉ ｒ ｎ ｄｉｆｒ ｎ ｃ ｎｉｍ ｓ ｆｅ ｅ ｔｍｅ ｈａ ｓ ．Ｌｉ ａ ｃ ｎ ｉ ｕ ｒ ｎ ｌ ｖａｕａｅ ｎ Ｐｈ ｓ Ｉｃｉ ｃ ｌｔｉ ｌ．Ｉ ｈ ｓｒ ｖｉｗ ｉｃ ｓ ｅ ｅ ｅ ｄ ｍｙ ｉ ｓｃ ｒ ｅ ｔｙ ｅ ｌ ｔ ｄ ｉ ａ ｅ Ｉ ｌｎｉａ ｒａ ｓ ｎ ｔ ｉ ｅ ｅ ｗｅ ｄ ｓ ｕ ｓ ｄ ｒ ｃ ｎｔ ｐ ｏ ｒ ｓ ｅ ｏ ｅ ｕ ａ ｃ ｎｉｍ ｓａ ｄ ａ ｔｔ ｒ ｇ ｅ ｓ ｓｉ ｍ ｌｃ ｌ ｒｍｅ ｈａ ｓ ｎ ｎ ｉ ｎ ｕｍｏ ｃ ｉ ｉｉ ｓｏ ｄ ｍｙ ｉ ｒａ ｔｖ ｔｅ ｆｌ ａ ｃ ｎ． ｉ
Ｓｒ ｔｍ ｃｓ ｌｂｓｏ ｕ ．０ ７ 生 的大分 子肽 类抗 ｔｐ ｏ ｙ ｅ ｏ ｉ ｒｓｃ１ ２ 产 ｅ ｇ ｐ
抑 制作 用［４ ＤＭ分 子可 以进 行拆 分 重建 ，发色 团 ２］ －。Ｌ 是Ｌ Ｍ 的活 性 部分 ， 当发色 团烯 二炔 芳 构化 后其 活 Ｄ
抗EGFR单链抗体与力达霉素融合蛋白的构建及其抗肿瘤活性研究的开题报告
抗EGFR单链抗体与力达霉素融合蛋白的构建及其抗肿瘤
活性研究的开题报告
一、研究背景
EGFR（Epidermal Growth Factor Receptor）是一种重要的细胞膜受体，在多种
癌症中的异常表达与肿瘤的形成、进展和预后密切相关。
目前，抗EGFR单克隆抗体
已成为肿瘤治疗的重要手段，如西妥昔单抗（Cetuximab）和曲妥珠单抗（Panitumumab）等。
然而，由于其单克隆抗体分子结构的限制，导致其在药物递送
和生物效应方面存在局限性，近年来，越来越多的研究关注如何利用基因工程技术构
建具有更好药效和安全性的抗EGFR分子。
力达霉素（LDM）是一种亲脑性环糖肽抗生素，具有极强的抗肿瘤活性。
通过将抗EGFR单克隆抗体和LDM进行融合，可以同时具有针对肿瘤细胞表面的EGFR靶向
作用和抗肿瘤细胞增殖的活性，从而提高药物的治疗效果。
二、研究目的
本研究旨在构建一个新型的抗EGFR单链抗体与LDM融合蛋白，通过对其药效
学和生物学特性的研究，探究其在抗肿瘤治疗中的应用前景。
三、研究内容
1.构建抗EGFR单链抗体与LDM的融合基因，并进行表达纯化。
2.对融合蛋白的分子特性和靶向性进行分析和验证。
3.对融合蛋白的抗肿瘤活性进行体外和体内实验研究，比较其与西妥昔单抗的治疗效果。
四、研究意义
本研究将利用基因工程技术构建具有更好药效和安全性的抗EGFR分子，为抗肿瘤治疗提供了新的思路和方法。
同时，通过探究抗EGFR单链抗体与LDM的联合应用，有望提高肿瘤治疗的疗效，为临床实践提供有力支持。
新抗癌药隐忍物力达霉素的转换辅基蛋白对肿瘤组织细胞的结合作用
新抗癌药物力达霉素的辅基蛋白对肿瘤组织细胞的结合作用Ƞ王健康ȱȠȠ孟茹松ȲȠ 李忠东ȲȪȠ（1．中国医学科学院医药生物技术研究所ȠȠȲȮȠ空军总医院ȠȠȠȠȠȱȰȰȰȳȶ）ȠȠ据夏俊峰家属透露，夏俊峰在庭审中称，自己先被踢了一脚，后又被打了下身，弯下腰时摸到口袋里的小刀，划拉了几下自己也不知道。
辩护律师认为，该案的起因是2009年5月16日沈河区城管申凯、张旭东等十几人进行野蛮执法。
夏俊峰不属于故意杀人，其行为符合正当防卫的条件。
ȠȠ2009年11月15日，沈阳市中级人民法院一审判决，认定夏俊峰的行为构成故意杀人罪，判其死刑，剥夺政治权利终身。
ȠȠ法院认为，被告人夏俊峰在与城管执法人员因摆摊占道问题发生争执后，持刀在被害人办公室行凶，造成2人死亡、1人受重伤。
其犯罪手段特别残忍，情节极其恶劣，后果极其严重，应依法严惩。
遂作出上述判决。
编辑本段终审判决ȠȠ2011年5月9日上午，沈阳小贩夏俊峰刺死城管案终审宣判，辽宁省高级法院作出刑事裁定，驳回上诉，维持原判：夏俊峰因故意杀人罪，判处死刑。
ȠȠ夏俊峰称，自己在勤务室被申凯、孙旭东两名城管队员殴打，一时激怒拿刀乱刺。
但辽宁省高院认为，没有足够证据表明夏俊峰“遭到了明显的、危及人身安全的不法侵害行为。
ʔȠȠ且由于目击证人被禁止进入法庭，夏俊峰的自卫杀人一说成为孤证，终审法庭未予采纳。
ȠȠ摘要： 背景与目的Ƞ力达霉素是由一个辅基蛋白质和一个发色团组成的烯二炔类抗肿瘤抗生素，在体外对肿瘤细胞显示出极强的杀伤作用。
其发色团对肿瘤细胞有杀伤作用，而其辅基蛋白对发色团有保护和稳定作用，但辅基蛋白对肿瘤细胞是否有结合作用，目前尚未见报导。
本实验研究力达霉素辅基蛋白（ɌɄɐ）对肿瘤细胞是否有结合作用，并考察这种结合作用与肿瘤生物学行为的相关性。
方法 用异硫氰酸荧光素酯（ɆɉɔɃ）与ɌɄɐ进行偶联，以此偶联物与临床常见的肺癌、胃癌、胰腺癌、直肠癌和乳腺癌组织标本在一定条件下孵育，通过荧光显微镜观察荧光染色情况，按荧光强弱程度将着色结果分成阳性、可疑、阴性ȳ级。
我国抗肿瘤新药力达霉素研发获重大进展
我国抗肿瘤新药力达霉素研发获重大进展经过我国医药科研人员近30年的不懈努力，具有完全自主知识产权的创新一类抗肿瘤新药——力达霉素的研发取得重大进展。
经过我国医药科研人员近30年的不懈努力,具有完全自主知识产权的创新一类抗肿瘤新药——力达霉素的研发取得重大进展。
据介绍,这个新一代抗肿瘤药以其广谱高效、低毒副作用等显著优势,不仅将给众多肿瘤病人送去福音,还使中国站到了世界抗肿瘤药物研发的前沿。
抗肿瘤药品行业将由此迎来“新革命”。
力达霉素是中国医学科学院生物技术研究所从土壤里筛选出的一个新的烯二炔类抗肿瘤抗生素,也是迄今为止所有报道的抗肿瘤活性最强的物质之一。
力达霉素被纳入国家“863”项目后,一批国内顶尖的科研人员组成了“攻关”的强大阵容,研发团队以中国工程院院士甄永苏教授为组长,国家药审专家李电东教授、973专家委员会委员邵荣光博士进行基础研究,科学院院士饶子和教授进行分子结构研究,著名毒理学家李培忠教授进行毒理研究,工程院院士刘昌孝教授进行药代动力学研究,工程院院士孙燕教授负责临床研究。
公开报道显示,按克隆生存测定的50％抑制浓度进行比较,力达霉素对肿瘤细胞有强烈的杀伤作用,比阿霉素、甲氨碟呤、顺铂等强6-7个数量级。
力达霉素抗肿瘤的活性强。
检测放射性核素标记胸苷的掺入结果表明,力达霉素加入3-5分钟即显示抑制作用,而浓度高10000倍的阿霉素和丝裂霉素须30-60分钟才能显示抑制作用。
动物实验表明,力达霉素对小鼠移植性肿瘤,包括实体瘤和白血病均有显著抑制作用。
力达霉素单次静脉给药即可显示较强疗效,按等毒性剂量进行比较,力达霉素对小鼠结肠癌26的抑制率明显高于阿霉素与丝裂霉素;力达霉素对移植于裸鼠的人体肝癌、结肠癌均有显著疗效。
除了表现出广谱、高效抑制肿瘤的作用,力达霉素还表现出优越的低毒性、低副作用特性。
在临床前的试验中,实验动物没有产生诸如脱发、脏器毒性病变等其它抗肿瘤药物常见的不良反应,对各系统无影响。
新型烯二炔类抗肿瘤抗生素力达霉素的研究进展
中 图分 类 号 ： ７ ． ４ Ｒ９ ９ １ 文献标识码 ： Ａ
Ａｄ ａ ｃ ｓ ｉ ｈｅ ｒ ｓ ａ ｃ ｆ ｌｄａ ｙ ｉ ｖ ｎ ｅ ｎ ｔ ｅ ｅ ｒ ｈ ｏ ｉ ｍ ｃ ｎ，ａ ｎｅ ｉ ｎ ｎｔｔ ｍ ｏ ｎｔｂ ｏ ｉ ｎ ｅ ｄ ｙ ｅ ａ ｉｕ ｒ ａ ｉ ｉ ｔｃ
Ｐ ｋｎ ｉｎ Ｍｅ ｉ ｌ ｏｌ ｅ Ｂ ｉｎ ０ ０ ０ ｅ ｉｇＵｎｏ ｄ ａ Ｃ ｌ ｇ ・ ｅ ｉ １ ０ ５ ） ｃ ｅ ｊｇ
ＡＢ Ｔ Ｓ ＲＡＣ Ｉｉ ａ ｙ ｉ ｓ ａ ｎ ｄ ｙ ｅ ａ ｔ ｕ ｒ ａ ｔ ｉ ｔｃ ｗｉｈ ｐ ｔ ｎ ｙ ｏ ｏ ｉｉｙ ａ ａ ｎ ｔ ｖ ｒ ｔ ｓ ｏ Ｔ ｄ ｍ ｃｎ ｉ ｎ ｅ ｅ ｉ ｎ ｎ ｉ ｍｏ ｎ ｉ ｏ ｉ ｔ ｂ ｔ ｏ ｅ ｔ ｃ ｔ ｔ ｘ ｃ ｔ ｇ ｉ ｓ ａ ｉ ｉ ｆ ｅ ｅ
ｃ ｍ ｂ ｎ ｔ ｒａ ｉ ｓ ｎ ｈ ｓｓ ｏ ｈ ｓ ｃａ ｓ ｏ ｎ ｉ ｉ ｔ ｓ ｏ ｉ ａ ｏ ｉ ｌ ｏ ｙ ｔ ｅ ｉ ｆｔ ｉ ｌ ｓ ｆａ ｔ ｏ ｉ ． ｂ ｂ ｃ
ＫＥＹ ＯＲＤＳ Ｌｉ ａ ｃ ｎ； Ｅｎ ｄ ｙｎ ｎｔｂｉ ｉ ｓ； Ａ ｉｕ Ｗ ｄ ｍｙ ｉ ｅ ｉ ｅ ａ ｉ ｏｔｃ ｎｔｔ ｍｏｒ
力 达 霉素 （ ｄ ｍｙ ｉ， Ｄ ） １ ａ ｃｎ Ｌ Ｍ 是从 我 国湖北 省潜 江 ｉ 县土 壤 分离 出的 一株 放 线菌 Ｓ ｒｐｏ ｙ ｅ ｌｂ ｐ ｒ ｓ ｔ ｔｒ ｃｓｇｏｉ ｏｕ ｅ ｎ ｓ
为 １ ５ ０ ， 白质 部 分 没有 抗 肿瘤 活 性 ， 对 发 色 团 ００ｕ 蛋 但
力达霉素抗肿瘤作用及其分子机制研究新进展
ＬＤＭ与５００ｎｍｏｌ／Ｌ吉西他滨联用，能够明显抑制
胰腺癌细胞ＰＡＮＣ－ｌ增殖，ＣＤＩ＜０．７５，具有协同抗 肿瘤作用ｆ８ｉ。０．１ｎｍｏｌ／Ｌ ＬＤＭ与５１．ｔｍｏｌ／Ｌ ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ联 合作用时，能够显著抑制肺癌细胞Ｈ４６０增殖，其
万方数据
４０４
力达霉素抗肿瘤作用及其分子机制研究新进展陈淑珍等
表１
Ｔａｂ．１
力达霉素对不同人肿瘤细胞的细胞毒作用（克隆形成法比较）圆
Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｏｆ
ｌｉｄａｍｙｃｉｎ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ（Ｃｌｏｎｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎｌ
‘ＮｒＤ：末进行试验。
万方数据
中国抗生素杂志２０１０年６月第３５卷第６期
．４０３．
＋ＮＤ：未进行试验。
中国抗生素杂志２０１０年６月第３５卷第６期
４０１
文章编号：１００１．８６８９（２０１０）０６－０４０１－０７
力达霉素抗肿瘤作用及其分子机制研究新进展
陈淑珍甄永苏邵荣光
（中国医学科学院，中国协和医学院，医药生物技术研究所，北京１０００５０）
摘要：力达霉素属于烯二炔类抗肿瘤抗生素，由一个酸性蛋白和一个烯二炔发色团通过非共价键结合而成，通过多种作用 机制在体内外对多种肿瘤产生强烈的抗肿瘤作用。目前，力达霉素已经进入ＩＩ期临床研究，本文介绍了力达霉素的抗肿瘤作用 和分子作用机制方面的新进展，为进一步研究力达霉素提供参考。 关键词：力达霉素；抗肿瘤作用；分子机制 中图分类号：Ｒ９７９．１＋４ 文献标志码：Ａ
抗肿瘤作用及分子机制方面的新进展进行综述。
１
力达霉素的抗肿瘤作用
１．１体外抗肿瘤作用
ＬＤＭ是经过精原细胞法筛选得到的，在体外具 有极强的杀伤肿瘤细胞的作用。按克隆生存测定的
抗生素对肿瘤与癌症的治疗
抗生素对肿瘤与癌症的治疗抗生素是一类可以抑制或杀灭细菌的药物，被广泛应用于感染性疾病的治疗。
然而，在医学领域中，抗生素的应用不仅局限于感染性疾病，还被研究和应用于肿瘤与癌症的治疗。
本文将探讨抗生素在肿瘤与癌症治疗中的应用及其潜在机制。
一、抗生素的抗肿瘤作用抗生素在肿瘤与癌症治疗中展示出抗肿瘤作用，这一发现令人兴奋。
不同类型的抗生素在抗肿瘤作用中可能存在不同特点。
以下是一些目前已知的抗生素及其在肿瘤治疗中的作用：1. 替硝唑（Metronidazole）：替硝唑是一种广谱抗生素，它对细菌和一些真菌有抑制作用。
研究发现，替硝唑能抑制肿瘤细胞的增殖和生长，并通过干扰肿瘤细胞内含有反应器破坏剂的酶的正常活性，导致肿瘤细胞死亡。
2. 善水蓟碱（Bleomycin）：善水蓟碱是一种抗生素类化合物，可与DNA结合并导致DNA链断裂，从而抑制肿瘤细胞的增殖。
善水蓟碱广泛用于肿瘤的局部治疗。
3. 阿霉素（Doxorubicin）：阿霉素是一种广谱抗生素，可抑制肿瘤细胞的DNA和RNA合成，并抑制肿瘤细胞的增殖。
阿霉素在治疗多种癌症中被广泛应用。
除了上述抗生素，还有许多其他类型的抗生素在肿瘤治疗中显示出了抗肿瘤的潜力，这为深入研究抗生素在肿瘤治疗中的机制提供了潜在的研究方向。
二、抗生素对肿瘤治疗的机制抗生素对肿瘤治疗的机制尚不完全清楚，但已知的机制包括：1. DNA损伤：一些抗生素可以与肿瘤细胞的DNA结合并导致DNA损伤，从而阻碍肿瘤细胞的增殖和生长。
2. 细胞毒性作用：一些抗生素能够直接杀死肿瘤细胞，通过抑制肿瘤细胞的活性酶或阻断肿瘤细胞的生物代谢途径。
3. 免疫调节作用：抗生素可能通过调节机体免疫系统的功能来抑制肿瘤细胞的增殖和扩散。
需要指出的是，尽管抗生素在肿瘤治疗中显示出潜力，但其应用仍存在一些限制和挑战。
一方面，抗生素的耐药性问题是一个重要的挑战，因为肿瘤细胞可能会逐渐产生抗生素耐药。
另一方面，一些抗生素可能对人体正常细胞有毒性作用，因此在使用时需要控制剂量并监测患者的生理指标。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
抗肿瘤抗生素力达霉素摘要：力达霉素属于烯二炔类抗肿瘤抗生素，可以通过发酵、生物合成以及化学合成获得。
力大霉素由一个酸性蛋白和一个烯二炔发色团通过非共价键结合而成，通过多种作用机制在体内外对多种肿瘤产生强烈的抗肿瘤作用。
目前，力达霉素已经进入Ⅱ期临床研究，本文介绍了力达霉素的发酵及生物、化学合成方法，抗肿瘤作用和分子作用机制方面的新进展。
关键词：力达霉素；发酵工艺抗肿瘤作用Abstract: Lidamycin, a member of the enediyne anticancer antibiotics family. Can be acquired by fermentation，biosynthesis，chemosynthesis. Lidamycin is composed of chromophore andapoprotein with noncovalent binding. It exerts potent antitumor activities on a variety of cancer in vitro and in vivo by different mechanisms. Lidamycin is currently evaluated in Phase II clinical trials. In this review we discussed recentprogresses in fermentation , biosynthesis , chemosynthesis ,molecular mechanisms and antitumor activities of lidamycin.Key words: Lidamycin; Fermentation process;Antitumor activity前言力达霉素(lidamycin, LDM)原名C1027，是从我国湖北省潜江县土壤中分离出的一株链霉菌Streptomyces globisporus c-1027产生的大分子肽类抗肿瘤抗生素，它是采用精原细胞法筛选得到的，其结构独特，由一个含110个氨基酸的酸性蛋白(MW10, 500)和一个含烯二炔结构的发色团(MW 843)通过非共价键结合而成(图1)，属于烯二炔类抗肿瘤抗生素。
LDM在体外对多种肿瘤细胞具有强力的杀伤作用，在体内对小鼠移植肿瘤L1210、P388和S180等有明显的抑制作用，对移植于裸鼠的人体肿瘤也有抑制作用。
LDM分子可以进行拆分重建，发色团是LDM的活性部分，当发色团烯二炔芳构化后其活性丢失；蛋白对发色团起保护作用，游离发色团容易失活，重建LDM与天然LDM活性相同。
目前，LDM在国内已进入Ⅱ期临床研究，现就力达霉素的分子结构与生物合成、化学合成、抗肿瘤作用及其分子作用机制等方面的研究工作成果作一综述。
一、力达霉素的分子结构力达霉素为新型烯二炔类抗肿瘤抗生素,它由1个辅基蛋白和1个发色团成。
蛋白部分由110个氨基酸组成, 含有2个分子内二硫键, 计算相对分子质量为10500u,蛋白质部分没有抗肿瘤活性, 但对发色团有稳定和保护作用,并携带发色团到达肿瘤部位。
发色团在抗肿瘤活性中发挥主要作用,发色团由1个9元环1, 52二炔232烯核心结构与氮氧杂萘甲酸、氨基吡啶核糖和B2酪氨酸结合而成。
这些结构单元不但参与化合物分子的组成, 而且与化合物的生物活性密切相关。
借助核磁共振对辅基蛋白及其与发色团的复合物进行结构分析并确定各个结构单位的相对位置, 发现芳构化的发色团结合在辅基蛋白结构中的“疏水口袋”处, 它们之间的亲和性可能来自辅基蛋白“疏水口袋”区氨基酸侧链与发色团之间形成静电和疏水作用。
二、力达霉素的发酵工艺材料和方法1 菌株力达霉素产生菌Streptomyces globisporus C-1027-20(中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保存,入册编号CGMCC No.0704) 。
2 培养基斜面培养基(g ·100 mL -1) : 可溶性淀粉2.0,3KNO 0.1,32PO KH ·O H 20.05, 4MgSO ·O H 270.05 , 4FeSO 0.001 ,NaCl0.05 ,琼脂粉1.5,pH7.0。
种子及发酵培养基(g ·100 mL -1):淀粉1,葡萄糖0.5,血胨0.5,玉米粉1.5,玉米浆0.5, 4MgSO ·O H 270.02,KI 0.06, 3CaO 0.4 ,豆油0.3,pH7.0 。
3 培养条件用冷干管中保存的菌种在斜面培养基上传代培养,28℃培养7～10d ,传2～3代,备用。
一级种子用500mL 三角瓶内装100mL 培养液,从斜面挖块接种,在转速为190r ·min -1的旋转摇床上28℃培养48 h 。
二级种子用5000mL 三角瓶,内装1000mL 培养液,接种量为10% ,在振荡速率为90r ·min -1的来回摇床上28℃培养24h 。
发酵培养用200L 发酵罐,内装培养液100L ,接种量为2% ,搅拌速度200r ·min -1,28℃培养约96h 放罐。
4 检测方法微生物测定法检测发酵液中力达霉素的含量:取发酵液适当稀释,检定菌为枯草芽孢杆菌[CMCC(B) 63501 ] ,标准品的浓度为5μg ·mL -1 ,用一剂量法测定力达霉素发酵液的抗菌活性。
用二剂量法测定力达霉素发酵提取物的抗菌活性,剂量为12μg mL -1·与3μg ·mL -1。
HPLC 法测定力达霉素发酵提取物的含量:精密称取待测样品和标准品510mg ,用蒸馏水溶解于5mL 容量瓶中,用于HPLC 测定。
色谱条件:Waters 高效液相色谱仪( 600 泵, 2487 紫外检测器,Millennium32色谱工作站) ; 色谱柱:Waters Delts PakC4 柱( 319 mm ×150 mm , 5μm , 30 nm) ; 流动相:01025 %三氟乙酸2乙腈(23∶77) ;检测波长:350 nm 。
液相色谱图见图2。
分别测定力达霉素样品及标准品发色团的峰面积,按照外标法计算样品的效价。
图2力达霉素典型液相色谱图精原细胞法测定力达霉素抗肿瘤活性:使用体重22～28g的雄性小鼠,分别于2侧睾丸内注射被试样品的溶液。
每一种样品的每一浓度用2～3只动物。
注射后2～4d(一般为3d)处死动物,取睾丸固定于Bouin氏液,石蜡包埋切片,切片厚度为5μm ,苏木精2伊红染色,显微镜下观察结果。
药物引起的精原细胞的特异性消失作为阳性。
结果表1为5批中试发酵液的测定结果,表2为5批中试发酵提取物的测定结果。
结果显示:5批发酵液微生物效价平均为450μg·mL-1 ;5批100 L发酵罐平均每罐产合格的力达霉素精品517g。
经过多批中试,摸索出了上罐条件,为力达霉素生产的下游提取提供了充足的发酵液,经过分离纯化,积累了足够的临床试验用药。
讨论此生产菌种较稳定,发酵培养基较廉价,发酵工艺过程也很好控制。
发酵液放罐后,由于力达霉素在常温下不稳定,故发酵液提取须在低温(10℃以下)避光条件下迅速提取,以避免活性成分的丢失。
力达霉素3种检测方法中,HPLC法最准确,但不能直接测定发酵液效价;微生物检定法易操作,经济实用,但不如HPLC法精确;精原细胞法可以测定样品是否具有抗肿瘤活性,但不易操作。
故在发酵液生产阶段用微生物法测定含量,原料药用HPLC法和微生物法测定含量。
从表2结果可以看出,微生物法及HPLC法测定得出的结果是平行一致的。
三、力达霉素化学合成的研在力达霉素的化学结构得到解析后, 很多实验室都进行着有关力达霉素化学合成方面的工作, 希望通过化学手段可以合成出活性相当乃至更强的化合物。
根据逆合成分析,朱锦桃等合成了烯二炔发色团中五元环状中间体, 并在此基础上合成了发色团中烯二炔单元的开链衍生物, 但并未得到闭环的烯二炔结构。
Inoue 等在对发色团的结构进行了充分研究之后对发色团的骨架结构和烯二炔的双环结构进行了合成。
由于辅基蛋白Gly96的H原子参与发色团芳构化后的自身降解, 该实验室还利用同位素氘(D)取代辅基蛋白Gly96的H原子, 改造后的辅基蛋白类似物由于动力学同位素的效应减小了发色团结构降解的速率, 增加其稳定性。
Semmelhack 等报道了由甘露糖出发经12步反应合成力达霉素发色团氨基糖结构单元的路线, 认为合成反应的关键步骤在于C24位的内部N取代从而引顺式氨基以及C25位上烯醇化物的甲基化。
四、力达霉素的生物合成力达霉素的发色团核心的烯二炔结构的生物合成途径一直是人们关注的焦点。
烯二炔结构中首尾相接的乙酸结构单元曾被推测是由不饱和脂肪酸的前体被切割和环化后形成或是通过聚酮合成途径, 由烯二炔聚酮合成酶(polyketide synthase, PKS) 催化聚线性不饱和聚酮中间产物的生物合成，接着采用一种新颖的环化机制而形成烯二炔核心结构。
刘文等运用PCR方法成功地克隆了力达霉素脱氧氨基糖代谢途径中的dNTP2葡萄糖24, 62脱水酶基因(sgcA ) ,并以此为探针,通过基因文库筛选和染色体步移克隆了完整的生物合成基因簇,发现力达素的生物合成起源于聚酮代谢途径, 并确定了基因簇编码1个烯二炔聚酮合成SgcE,排除了由脂肪酸合成然后降解的可能性。
除了聚酮合成酶SgcE, 刘文等还提出了一系列途径特异的结构基因分别控制各个结构单元的合成。
sgcE2-sgcE11、sg cI、sgcJ 、sgcL 和sgcF 等16 个基因负责烯二炔核心的合成; sgcA-sgcA6 等7个基因sgcA1-sgcA6参与脱氧氨基糖的合成; sgcC-sgcC5 6等基因参与β-氨基酸的合成sgcD-sgcD6等7个基因负责杂萘苯环的合成。
通过各自途径生物合成的这三个结构单元分别在糖基转移酶(SgcA6)、缩合酶(SgcC5) 和酰基转移酶(SgcD6)的催化作用下, 与烯二炔核心结合, 构成完整的力达霉素发色团分子。
对力达霉素生物合成基因簇中结构基因的研究正在进行中, 通过生物信息学的分析、在链霉菌中的基因中断实验以及利用基因工程手段将结构基因的片段克隆至大肠埃希菌表达载体中并对表达产物进行酶学分析可以确定这些结构基因在力达霉素生物合成中的相关功能, 并获取更多生物合成途径中有关中间产物和反应步骤的信息。
目前已陆续报道了sgcD、sgcA 1、sgcC1 等结构基因的研究分析结果。
五、力达霉素的抗肿瘤作用1 体外抗肿瘤作用LDM是经过精原细胞法筛选得到的，在体外具有极强的杀伤肿瘤细胞的作用。