基因芯片

基因组差异的发现
在双倍体生物中（假设Ratio=Cy5/Cy3, Cy5标 记实验基因组，Cy3标记正常基因组）
log2Ratio>0.58 或者 log2Ratio<-1则认为有差异
即：Ratio=3/2 或者 Ratio<1/2则认为有差异
CGH芯片的应用（II）
微生物进化及功能分析中的应用：
CG AC G
AC ACG AG CG AG C
Nucleotide Deposition Sequence ACG
G
Mask 3
完成的芯片
CG AC G
AC ACG AG CG AG C
A A A A A
点样芯片
• 预先合成探针
Oligo探针 （GoArrays） PCR产物探针 （Primegens）
原理：根据已经测序的参考基因组（reference genome）的基因来设计探针，和待测菌株的基因组 DNA杂交，就可以检测出该菌株基因组是否含有某基 因。并且可以根据菌株间基因的相似度来反映其进化 关系，也就是说两个菌株共享的基因越多，则两个菌 株亲缘关系越近。 优点：方便快捷准确 ；避免了同一物种的重复测序， 能够节省大量的时间和经费
实验流程
1、小分子量的RNA 提取； 2、加Poly(A)尾巴； 3、利用Oligo(dT)的 连接作用加入荧光； 4、杂交； 5、图像，数据获取。
ChIP-chip(ChIP-seq)
ChIP-chip的基本原理是在生理状 态下把胞内蛋白质和DNA甲醛作用 下交联在一起，用超声波打碎为 0.2-2 kb的染色体小片段，然后通 过目的蛋白质特异性抗体沉淀此复 合物，获得特异地作用于目的蛋白 结合的DNA片段，通过对目的片段 的纯化与检测，从而获得蛋白质与 DNA相互作用的信息。其中共沉淀 的 DNA和合适的对照用荧光标记， 加在载玻片上，用于芯片分析。使 用外源性DNA作为背景，免疫沉淀 DNA与作为背景的对照进行比较， 可以找到特异性蛋白在基因组中的 结合位点。
生物芯片及其应用
一、生物芯片的类型
• • • • • • • 表达谱芯片 CGH芯片 芯片测序 MicroRNA芯片 ChIP-chip （ ChIP-seq） 蛋白质芯片 组织芯片
核酸水平
非核酸水平
CGH芯片工作原理
CGH芯片应用（I）
精确、定量地研究人 类基因组微缺失和微 扩增及其定位方面的 应用，如肿瘤诊断， 发育方面研究的应用。
简单的数据分析主要步骤
• 数值提取 • 归一化 • 差异基因筛选
数据读取（Genepix Pro）
数据框获取： 1、人工获取； 2、Gal文件获取
Flag=-50 Flag=-100
Genepix Pro一些直观数据
为什么要归一化？
• 由于样本差异、荧光标记效率和检出率 的不平衡，需对cy3和cy5的原始提取信 号进行均衡和修正才能进一步分析实验 数据，Normalization正是基于此种目的。
二、表达谱芯片介绍
• • • • cDNA芯片的合成方法 样本的处理方法 数据分析方法简介 芯片种类及应用介绍
基因芯片的合成方法
• 原位合成芯片
光蚀刻原位合成法、电化学原位合成法、喷墨式 原位合成法
• 点样芯片
针点式合成法、喷墨式合成法
原位光刻合成基因芯片原理
光源 遮蔽板
芯片
探针合成
A 3×3 array
• 点制芯片
预先合成好的探针通过类似于喷墨打印机的技术 喷射到玻璃基片表面，或者用针头点在片基上。
样本的处理方法
• 按照样本分
DNA、RNA、DNA-蛋白复合体
• 按照标记信号分子划分
荧光燃料、生物素、放射性元素
• 按照标记方法分
cDNA 直接标记(间接标记)、PCR扩增标记、末端 标记
芯片实验流程
归一化的方法
• 一组内参照基因（如一组看家基因,外参基 因）校正Microarray所有的基因、阳性基因、 阴性基因、单个基因。 • Lowess
差异基因筛选
• 原理：采用cy3/cy5的ratio值对差异基因进 行 判断，或采用统计方法对差异基因进行 统计推断。 方法：倍数法：cy3/cy5比值大于2或者小于 0.5 • Z值法： Z=(X-μ)/σ 作用：发现两个样本间的差异表达基因， 便于后续分析。
芯片测序的特点
• 优点；陕速、成本低、易于自动化。 • 缺点：第一，由于众多寡核苷酸的组成各不相同， 其最佳杂交条件难于统一，易出现假阳性和假阴 性的杂交结果；第二，根据获得的数据无法准确 地排列重叠序列；第三，如果检测核酸存在重复 序列，那么重叠的探针不是唯一的，重组探针无 法再继续。所以，这种方法不能用于含有许多内 部重复和简单序列单元的DNA。但这种方法用于 再测序，即确认已知的核酸序列和研究单核苷酸 多态性(SNP)的检测或突变具有其他方法不可比 拟的优越性。突变分析、疾病分子诊断、基因分 型。
小结
• 芯片数据处理，过程不是越复杂越好（因 为每一步处理都会带进新的误差）； • 不要执迷于软件的选择（各式各样的软件 实在太多），选择通用的软件比较好 （Limma，TM4）； • 不要过分执着于个别基因的情况，应该重 视一类基因表达的模式（pattern）情况。
MicroRNA 芯片
• MicroRNA芯片检测可用于发现样本间差异 表达MicroRNA，从而发现调控基因mRNA 转录后调控的关键因素。 样本间差异基因由mRNA是否翻译成蛋白质 以发挥功能，将受到差异MicroRNA的调控 影响。实验表型的差异将体现在差异基因 功能分布中，通过构建差异MicroRNA与差 异基因功能间的相互作用网3、杂交 （预杂交）
4、洗片
5、扫描
图像扫描
Cy5
Cy3
D.radiodurans 全基因组芯片
D.radiodurans whole genome microarray
建议
1、如可取小量修饰好的玻片进行点样并测试整 个后处理和杂交过程。 2、一旦玻片点样后，应对小量点样玻片进行后 处理，后处理是否成功可用已知应产生良好结果 的 RNA制备的探针进行测试来判定。 3、所有阵列在杂交前应扫描一次，弃去那些有 明显污点的玻片，并弃去那些杂交前背景就高的 阵列。
金黄色葡萄球菌不同菌株的致病基因的组合
芯片测序
基因芯片的测序原理是杂交测 序，即通过与一组已知序列的 核苷酸探针进行杂交完成核苷 酸 序列 测定。用图5-9说明测 序原理。在一块基片表面固定 已知序列的八核苷酸探针，当 溶液中带 有荧光标记的核苷酸 序列TATGCAATCTAG与基因 芯片上对应位置的核酸探针产 生互补杂交时， 通过确定荧光 强度最强的探针位置，获得一 组序列完全互补的探针序列， 据此可重组出靶核 苷酸待测序 列。DNA芯片测序技术包括芯 片制备、样品制备、分子杂交、 检测分析、序列 分析和组装等 过程。 （Solid测序-35bp）
Z值法
对于处在同一张芯片上的基因，一般我们认为只有小部分基因是有 表达差异（在对芯片原始数据做标准化的时候，我们也曾提到过这个假 设） ，同时信号比值在经过对数转换后，整张芯片上的基因比值近似于 正态分布。我们计算每个基因的 Z 值，Z=(X-µ)/ơ，其中，X 表示该基因 的表达比值，µ表示整张芯片上所有基因的比值平均数，ơ 表示整张芯片 上所有基因的方差。当 Z 值大于 2 或者-2时表示基因表达值在平均比值 加 2 倍方差以外，这样的差异就具有统计学意义，可以认为是差异表达 基因。 虽然 Z 值法可以帮助我们发现差异基因，但是它也有很大的缺点， 如果在给定的基因内不存在差异表达基因，当我们利用 Z 值方法来发掘 差异基因时，它总能给出 Z 值的绝对值大于或者小于 2 的基因，即增加 了假阳性率。同时，当我们关于“整张芯片中只有小部分基因是有表达 差异”的假设不成立，既有大量基因有表达差异的时候，Z 值法又会增 加假阴性率。