荧光定量PCR快速检测食品中沙门氏菌方法的建立及初步应用_钟伟军

本 研 究 针 对 编 码 沙 门 氏 菌 肠 毒 素 ｓｔｎ 基 因 设 计 引物和探针， 经过优化各个反应条件和体系， 建立 了 检 测 食 品 中 沙 门 氏 菌 的 荧 光 定 量 ＰＣＲ 方 法 ， 为 沙 门氏菌的检测提供了更快速、敏感的方法。
１ 材料和方法
１．１ 材 料 １．１．１ 菌 株 ： 鼠 伤 寒 沙 门 氏 菌 Ｃ７７－３１ 株 、 鸡 白 痢 沙 门 氏 菌 Ｃ７９－１３、 猪 霍 乱 沙 门 氏 菌 Ｃ７８－２ 株 、 金 黄 色 葡 萄 球 菌 ＡＴＣＣ ２５９２３ 株 和 巴 氏 杆 菌 Ｃ４８－７ 株 均 购 于 中 国 兽 医 药 品 监 察 所 ； 鸡 白 痢 沙 门 氏 菌 Ｃ７９－１ 株 由山东省农业科学院家禽研究所惠赠； 禽伤寒沙门 氏 菌 、 Ｅ．ｃｏｌｉ Ｏ１５７： Ｈ７、 腊 状 芽 孢 杆 菌 、 藤 黄 八 叠 球菌、奇异变形杆菌和肺炎克雷伯氏菌等分离株均 由华南农业大学兽医学院微生物学教研室保存。 １．１．２ 工 程 菌 ： 基 因 工 程 菌 Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α 由 中 山 大 学达安基因生物有限公司保存。 １．１．３ 酶及其它相关试剂： Ｅｘ Ｔａｑ 酶、ｄＮＴＰｓ、ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ ＤＬ２０００ 和 ｐＭＤ１８－Ｔ 载 体 均 为 宝 生 物 工 程 （大 连 ）有 限 公 司 产 品 ； 琼 脂 糖 凝 胶 ＤＮＡ 回 收 试 剂 盒 和 质 粒 抽 提 试 剂 盒 为 ＯＭＥＧＡ 公 司 产 品 。 缓 冲 蛋 白 胨 水（ＢＰ）、 营 养 肉 汤 、 营 养 琼 脂 和 ＳＳ 培 养 基 为 环 凯 生 物技术公司产品。 １．２ 荧 光 定 量 ＰＣＲ 检 测 方 法 建 立 １．２．１ 模 板 ＤＮＡ 的 制 备 ： 取 培 养 过 夜 的 菌 液 １ ｍＬ， 置 于 Ｅｐ 管 中 ， １２ ０００ ｒ／ｍｉｎ 离 心 ５ ｍｉｎ， 灭 菌 生 理 盐 水 洗 涤 ２ 次 ， 最 后 用 ０．２５ ｍＬ 蒸 馏 水 悬 浮 ， 煮 沸 １５ ｍｉｎ， １２ ０００ ｒ／ｍｉｎ 离 心 １５ ｍｉｎ， 取 上 清 ， 即 为 ＤＮＡ 模 板 。 １．２．２ 引物和探针的设计： 根据已发表的鼠伤寒沙
（１． 华 南 农 业 大 学 兽 医 学 院 ， 广 东 广 州 ５１０６４２ ； ２． 中 山 大 学 达 安 基 因 股 份 公 司 ， 广 东 广 州 ５１０６６５）
摘 要 ： 根 据 编 码 鼠 伤 寒 沙 门 氏 菌 肠 毒 素 ｓｔｎ 基 因 的 核 苷 酸 序 列 设 计 １ 对 引 物 和 荧 光 探 针 ， 通 过 对 荧 光 定 量
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ ： Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ； ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ； ｒａｐｉｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ
＊Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ａｕｔｈｏｒ 沙门氏菌引起的中毒病例在世界各地的食物中
毒 病 例 中 所 占 数 量 比 例 非 常 高 ［１， ２］。 有 资 料 统 计 ， 在 我 国 ７０ ％～８０ ％细 菌 性 食 物 中 毒 事 件 是 由 沙 门 氏 菌 引 起 ， 而 引 起 沙 门 氏 菌 中 毒 的 食 品 中 ， 约 ９０ ％ 是 肉 、蛋 、奶 等 畜 产 品［３］。目 前 ， 在 进 行 食 品 质 量 安 全 监 控 的 中 国 计 量 认 证 （Ｃｈｉｎａ ｍｅｔｒｏｌｏｇｙ ａｃｃｒｅｄｉｔａｔｉｏｎ， ＣＭＡ） 检 测 时 ， 沙 门 氏 菌 的 检 测 已 成 为 必 检 的 卫 生
ＰＣＲ 反 应 体 系 和 反 应 条 件 的 摸 索 ， 建 立 了 检 测 沙 门 氏 菌 的 核 酸 荧 光 定 量 ＰＣＲ 方 法 。 对 该 方 法 的 特 异 性 与 敏 感 性
研 究 结 果 显 示 ， 该 方 法 检 测 沙 门 氏 菌 结 果 均 为 阳 性 ， 而 非 沙 门 氏 菌 均 为 阴 性 ； 对 带 有 沙 门 氏 菌 肠 毒 素 ｓｔｎ 基 因 的
第 ３０ 卷 第 ３ 期 ２００８ 年 ３ 月
中国预防兽医学报 Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ
Ｖｏｌ．３０， Ｎｏ．３ Ｍａｒ． ２００８
荧光定量 ＰＣＲ 快速检测食品中沙门氏菌方法 的建立及初步应用
钟 伟 军 １， 赵 明 秋 １＊， 邓 中 平 ２， 陈 金 顶 １， 徐 艳 芳 １
Ａｂｓ ｔｒａｃｔ： Ａ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｏｆ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ ｗａｓ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｕｓｉｎｇ ａ ｐａｉｒ ｏｆ ｐｒｉｍｅｒｓ ａｎｄ ａ ｐｒｏｂｅ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｓｔｎ ｇｅｎｅ ｔｈａｔ ｅｎｃｏｄｅｓ ｔｈｅ ｅｎｔｅｒｔｏｘｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ． Ｔｈｅ ａｓｓａｙ ｈａｄ ａ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｌｉｍｉｔ ｏｆ ４ ｃｏｐｉｅｓ／μＬ （１００ ｃｏｐｙ／２５ μＬ） ｆｏｒ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｐｌａｓｍｉｄ， ａｎｄ １ ＣＦＵ／ｇ ａｎｄ １ ＣＦＵ／ｇ ｆｏｒ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌｌｙ ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｅｄ ｆｒｅｓｈ， ｍｅａｔ ａｎｄ ｅｇｇｓ， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． Ｔｈｉｓ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ｒａｐｉｄ， ｈｉｇｈｌｙ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ａｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃ， ｗｈｉｃｈ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ｉｎｔｏ ａ ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ ｋｉｔ ｆｏｒ ｒａｐｉｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｆｏｏｄ．
门 氏 菌 肠 毒 素 ｓｔｎ 基 因 的 核 苷 酸 序 列 ， 应 用 ＡＢＩ 公 司 提 供 的 Ｐｒｉｍｅｒ ｅｘｐｒｅｓｓ ２．０ 软 件 设 计 出 引 物 和 荧 光 探 针 ， 上 游 引 物 ： ５＇－ＡＡＡＴＣＧＴＧＣＡＧＴＧＧＣＴＴＡ－３＇， 下 游 引 物 ： ５＇－ＡＡＧＧＣＧＣＧＧＴＣＴＴＴＡＣＴＡＴＣ－３＇， 荧 光 探 针 ： ５＇－ＴＴＴＴＴＣＣＧＣＧＴＡＴＣＡＧＣＣＴＴＧＴＡ－３＇。 引 物 扩 增 片 段 的 理 论 跨 幅 大 小 为 １１９ ｂｐ， 引 物 与 探 针 均由中山大学达安基因公司合成。 １．２．３ 实 时 荧 光 定 量 ＰＣＲ： 荧 光 定 量 ＰＣＲ 的 反 应 体 系 为 ２５ μＬ ， 各 组 份 为 ５ × ｂｕｆｆｅｒ ５ μＬ 、 ｄＮＴＰｓ （１０ ｍｍｏｌ／Ｌ） ０．５ μＬ、ＭｇＣｌ２ （２５ ｍｍｏｌ／Ｌ） ３．０ μＬ、 上 游 引 物 （１０ μｍｏｌ ／Ｌ） ０．５ μＬ、 下 游 引 物 （１０ μｍｏｌ ／Ｌ） ０．５ μＬ、荧光探针（５ μｍｏｌ ／Ｌ） １ μＬ、Ｔａｑ 酶（３ Ｕ／μＬ） １ μＬ、 ＤＮＡ 模 板 １ μＬ 和 去 离 子 水 １２．５ μＬ。 反 应 参数如下： 预变性 ９３ ℃， ５ ｍｉｎ； ９３ ℃， ３５ ｓ； ５５ ℃， ４５ ｓ； 共 ４０ 个 循 环 。 反 应 结 束 后 ， 对 获 得 的 信 号 、 数据进行处理。 １．２．４ 阳 性 重 组 质 粒 的 制 备 与 检 测 标 准 曲 线 的 建 立 ： 用 引 物 对 鼠 伤 寒 沙 门 氏 基 因 组 ＤＮＡ 进 行 ＰＣＲ 扩 增 ， 回 收 ＰＣＲ 产 物 ， 产 物 与 ＰＭＤ１８－Ｔ 连 接 后 转 化 感 受 态 细 胞 ， 涂 板 筛 选 ， 经 ＰＣＲ 鉴 定 为 阳 性 的 菌 落进行培养， 抽提质粒， 对可疑阳性重组质粒进行 序 列 测 定 。 将 已 知 拷 贝 数 的 质 粒 １０ 倍 倍 比 稀 释 作 为 模 板 ， 进 行 荧 光 定 量 ＰＣＲ 扩 增 ， 得 到 相 应 的 动 力 学 曲线， 并计算产生相应的标准曲线。 １．２．５ 荧 光 定 量 ＰＣＲ 特 异 性 ： 以 各 菌 株 的 基 因 组 ＤＮＡ 为 模 板 ， 进 行 实 时 荧 光 定 量 ＰＣＲ 扩 增 ， 测 试 其特异性。 １．２．６ 荧 光 定 量 ＰＣＲ 敏 感 性 ： 将 本 试 验 所 制 备 的 阳 性 重 组 质 粒 倍 比 稀 释 ， 稀 释 成 质 粒 含 量 分 别 为１０８ 拷 贝 ／μＬ、１０７ 拷 贝 ／μＬ～１０２ 拷 贝 ／μＬ、１０１ 拷 贝 ／μＬ 和 １００ 拷 贝 ／μＬ， 并 用 相 应 引 物 与 探 针 进 行 荧 光 定 量 ＰＣＲ 扩 增 ， 测 试 其 敏 感 性 。 １．３ 荧 光 定 量 ＰＣＲ 检 测 食 品 中 的 沙 门 氏 菌 １．３．１ 沙 门 氏 菌 计 数 ： 取 鼠 伤 寒 沙 门 氏 菌 Ｃ７７－３１ 株 接 种 于 ５ ｍＬ 营 养 肉 汤 ， ３７ ℃ １５０ ｒ／ｍｉｎ 摇 震 培 养 过 夜 ， 取 １ ｍＬ 菌 液 用 灭 菌 生 理 盐 水 １０ 倍 倍 比 稀 释 成 ９ 个 稀 释 度 ， 即 １０－１、 １０－２、 １０－３、 １０－４、 １０－５、 １０－６、 １０－７、 １０－８ 和 １０－９。 取 上 述 各 稀 释 度 的 菌 液 １ ｍＬ， 应 用倾注法接种于普通营养琼脂平板， 每个稀释度接 种 ２ 个 平 板 ， ３７ ℃培 养 ２４ ｈ 后 进 行 菌 落 计 数 。 １．３．２ 样品处理： 散装鲜猪肉、鲜鸡蛋均从某超市 购入， 根据标准方法无菌操作， 将待检样品放入匀
指 标 之 一 ［４］。 传 统 的 检 测 方 法 是 先 采 用 非 选 择 性 和 选择性增菌， 然后分离培养、生化反应和血清学鉴 定， 检验程序十分繁琐， 且肠杆菌科细菌间的生化 反应多有交叉， 需 ４ ｄ～７ ｄ 才能完成， 因此传统的 检测方法在快速、敏感与特异性等方面有自身的局 限 性 ［５］。 随 着 分 子 生 物 学 及 分 子 细 菌 学 的 发 展 ， 普 通 ＰＣＲ 以 其 迅 速 、 简 便 和 灵 敏 等 优 点 成 为 科 研 和 临