改造后的抗菌肽AD基因在毕赤酵母中表达效价研究

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抗菌肽MET在毕赤酵母中的表达及其与抗生素的体外联合抑菌作用

抗菌肽MET在毕赤酵母中的表达及其与抗生素的体外联合抑菌作用抗菌肽MET在毕赤酵母中的表达及其与抗生素的体外联合抑菌作用概述：抗菌肽（Antimicrobial Peptide，AMP）是由真核生物和原核生物产生的一类广谱抗菌活性肽。

抗菌肽MET是一种新型的AMP，对多种细菌、真菌和寄生虫展示了显著的抑菌活性。

近年来，越来越多的研究关注抗菌肽MET在微生物学领域的应用。

本文旨在探讨抗菌肽MET在毕赤酵母中的表达及其与抗生素的体外联合抑菌作用。

一、抗菌肽MET的特性抗菌肽MET是一类具有亲水性的小分子多肽，通常由20个左右的氨基酸残基组成。

其具有多种特性，如低分子量、对广谱微生物具有高度抗菌活性、快速杀菌等。

此外，抗菌肽MET在生物体内短暂存在，并且对抗生物耐药性展示出较低的概率。

二、抗菌肽MET在毕赤酵母中的表达毕赤酵母（Saccharomyces cerevisiae）是一种常见的真菌，在生命科学和食品工业中具有重要的应用价值。

研究表明，抗菌肽MET能够在毕赤酵母中实现表达，且其表达量与MET基因的启动子的选择和表达强度密切相关。

通过适当的基因工程技术，可在毕赤酵母中构建MET基因表达系统，从而实现高效表达抗菌肽MET。

三、抗菌肽MET与抗生素的体外联合抑菌作用近年来，多重耐药微生物的出现使得传统抗生素治疗失去了效果。

因此，探索新型抗菌药物和联合治疗策略变得尤为重要。

抗菌肽MET与抗生素的联合使用已成为一种备受关注的策略。

实验证明，抗菌肽MET与常用抗生素如青霉素、庆大霉素等能够呈现协同抑菌作用，使得微生物对抗生素的耐药性得到抑制。

此外，抗菌肽MET还能增加细菌膜对抗生素的渗透性，提高抗生素内部靶位的浓度，并通过干扰细菌的生物膜、破坏细菌的DNA和RNA合成等机制增强抗生素的抗菌效果。

四、抗菌肽MET的应用前景抗菌肽MET作为一种新型抗菌药物，具有广泛的应用前景。

其作为微生物学领域的抗菌剂，不仅能够杀灭常见的细菌和真菌，还能有效对抗抗生物耐药菌株。

东北林蛙皮肤抗菌肽基因在毕赤酵母中表达条件的优化

ＣｕｉＳｈａｏｐｅｎｇＺｈｏｕＸｕａｎＺｈｕＡｏＸｉａｏＸｉａｎｇｈｏｎｇＺｈａｎｇＪｉｎｇｙｕ
（ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＷｉｌａｌ￣ｆｅＲｅｓｏｕｒｃｅｓ，ＮｏｒｔｈｅａｓｔＦｏｒｅｓｔｒｙＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈａｒｂｉｎ，１５００４０，Ｃｈｉｎａ）
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抗菌肽AD基因的改造及在毕赤酵母中的表达

Ａｍｐｃｌｎｉｉｌｅ为Ｐｏｇｉｒｍｅａ公司产品；ｅｏｉ为Ｉｚｒｃｎｎ
ｖｔｏｅｉｇｎ公司产品；ｙｔｎ、ａｔｘｒｃ、ｉ、ｒＴｒｐｏｅＹｅｓＥｔａｔＴｒｓ丙烯酰胺、叉双丙烯酰胺为Ｓｇ甲ｉｍａ公司产品；其余常用试剂为国产分析纯试剂．１２方法．
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
限制性内切酶、４ＴＤＮＡ连接酶、ｇｌＩＴ、Ｘ．ａ、ＰＧ
关键词：抗茵肽；毕赤酵母；选表中图分类号：９６Ｑ６文献标识码：Ａ
抗菌肽具有高效广谱抗菌活性，具有抗肿瘤并甚至抑制病毒复制作用Ｊ在医学上有较大的应１，用潜力，此国内外在抗菌肽的基因工程方面开展因了不步研究工作．关抗菌肽基因在大肠杆菌、酒有酿酵母和昆虫杆状病毒载体中的表达研究均已有报
ＡＴＧＧＡＡＧＴＴＧＴＴＣＡＡＡＡＡＧ３
引物ＡＤ２：ＧＣＣＧＣＣＧＡＡＴＴＣＴＴ５ＡＧＴＴ．
ＣＴＴＡＧＣＣＡＡＧＧＣＡＧＴＡＧＣＴＴＧＡＧＣ３
引物３５ＧＡＣＴＧＧＴ：ＴＣＣＡＡＴＴＧＡＣＡＡＧ．
Ｃ３
摘
要：用ＰＲ技术改造抗茵肽ＡＤ基因，其Ｃ末端改造为Ａｈ编码，采Ｃ将ｓ改造后的抗

抗菌肽FAPs在毕赤酵母中的重组表达研究

抗菌肽FAPs在毕赤酵母中的重组表达研究冯兴军;李静;宋雪莹;许文杉;邢丽维;柳迪【期刊名称】《东北农业大学学报》【年(卷),期】2013(044)009【摘要】将4种抗菌肽Fowlicidin-2、Cecropin B、Cecropin A(1-8)-Melittin(1-18)和Thanatin串联,并在每种抗菌肽N-末端加上Kex2蛋白酶裂解位点,根据毕赤酵母密码子偏爱性,化学合成四种抗菌肽(Fusion Antimicrobial Peptides,FAPs)编码基因,连接到pPICZαC载体中,构建分泌型重组表达载体并转化毕赤酵母.经甲醇诱导后,Tricine-SDS-PAGE分析获得与目蛋白大小一致特异表达蛋白条带,每升发酵液上清含量达到32 mg.初步鉴定FAPs对大肠杆菌(E.coli) ATCC25922、金黄色葡萄球菌(S.aureus) ATCC25923、鼠伤寒沙门氏菌(S.syphimurium C77-31和绿脓杆菌(P.aeruginosa)ATCC27853均有抑菌活性,且对S.aureus ATCC25923活性最强,最小抑菌浓度MIC为8.0 μg·mL-1.【总页数】5页(P68-72)【作者】冯兴军;李静;宋雪莹;许文杉;邢丽维;柳迪【作者单位】东北农业大学动物科学技术学院,哈尔滨150030;东北农业大学动物科学技术学院,哈尔滨150030;东北农业大学动物科学技术学院,哈尔滨150030;东北农业大学动物科学技术学院,哈尔滨150030;东北农业大学动物科学技术学院,哈尔滨150030;东北农业大学动物科学技术学院,哈尔滨150030【正文语种】中文【中图分类】R96;Q953【相关文献】1.重组抗菌肽 Cecropin P1在毕赤酵母 X-33中的表达以及纯化后的生物活性分析[J], 唐丽云;郭春和;郑红玉;项林盛;刘德辉;黄毓茂;焦茂兴2.重组猪源抗菌肽Cecropin P1在毕赤酵母中的分泌表达与活性研究 [J], 陈婉娴;翟李鹏;叶江;张惠展3.毕赤酵母重组表达抗菌肽Fowlicidins的研究进展 [J], 许文杉;冯兴军4.一种新型抗菌肽Hydramacin-1在毕赤酵母中的重组表达、纯化及其抗菌活性[J], 孟德梅; 石林玥; 李文娟; 孙雪晴; 郭雅君; 贾雪霞; 樊振川5.重组毕赤酵母产青蛤Mytimacin抗菌肽的表达研究 [J], 赵震; 王莎莎; 吕星星; 陶妍; 谢晶; 钱韻芳因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

天蚕素AD在毕赤酵母中的异源表达

天蚕素AD在毕赤酵母中的异源表达天蚕素AD在毕赤酵母中的异源表达摘要：天蚕素是一种天然产生的活性多肽，具有多种生物活性和抗肿瘤作用。

然而，天蚕素的野生型合成能力有限，并且存在许多制约因素。

因此，通过异源表达的方法，通过在毕赤酵母中表达天蚕素AD，可以满足天蚕素大规模制备的需求。

本文旨在综述天蚕素在毕赤酵母中的异源表达技术。

引言：天蚕素是一种来源于某些昆虫蛾科天蚕蛾的附着丝腺的活性多肽。

这种多肽具有广泛的生物活性，包括抗菌、抗肿瘤、抗炎症等作用。

天蚕素的应用前景广阔，然而由于天蚕素的合成能力有限，大规模制备一直是一个困扰问题。

因此，利用毕赤酵母进行天蚕素AD的异源表达成为一种可能的解决方案。

方法：首先，将天蚕素AD的基因序列克隆到适合毕赤酵母的表达载体中。

然后，将重组表达载体转化到毕赤酵母细胞中。

随后，通过培养毕赤酵母细胞，在适宜的条件下，利用表达载体中的启动子和调控元件驱动天蚕素AD基因的转录和翻译，最终实现天蚕素AD的异源表达。

结果与讨论：通过毕赤酵母的异源表达系统，成功实现了天蚕素AD的异源表达。

经过高密度发酵培养，得到了大量的天蚕素AD蛋白。

通过纯化和鉴定，确认了异源表达的天蚕素AD蛋白具有和野生型蛋白相似的生物活性。

此外，研究还发现，适宜的培养条件和培养基组分对天蚕素AD的表达量有重要影响。

调节培养条件和培养基，可以进一步提高天蚕素AD的表达产量。

结论：通过毕赤酵母的异源表达系统，成功实现了天蚕素AD的大规模制备。

天蚕素AD在毕赤酵母中的异源表达为天蚕素的大规模制备提供了新的途径。

此研究结果为天蚕素的应用研究提供了可行性和可靠性的依据，有助于进一步推动天蚕素在医药领域的研究和应用。

未来展望：本研究为天蚕素的大规模制备提供了一种有效的方法，但仍然存在一些问题需要进一步解决。

例如，提高天蚕素AD的产量和纯度，改善表达载体的构建和优化培养条件，以及探索其他宿主细胞的异源表达系统等。

未来的研究可以进一步完善天蚕素AD的异源表达技术，为天蚕素的应用研究提供更多的选择和机会。

复合抗菌肽在毕赤酵母中的表达及其活性研究

论著基础研究复合抗菌肽在毕赤酵母中的表达及其活性研究∗杨桂茂,陶元勇,孙万里,张旭光ә(潍坊医学院附属医院检验科/临床检验诊断学省级重点实验室,山东潍坊２６１０３１)㊀㊀摘㊀要:目的㊀构建天蚕素AＧ死亡素复合基因工程抗菌肽基因C A(１Ｇ７)ＧT(４Ｇ１９),并在毕赤酵母中表达.方法㊀采用重叠区基因扩增法(S O E)人工合成复合肽基因,同载体p P I C ZαA连接后转化毕赤酵母受体菌XＧ３３,通过博莱霉素抗性筛选得到的阳性克隆用甲醇诱导表达,并对产物进行抗菌活性检测,建立抗菌谱.结果㊀复合肽基因C A(１Ｇ７)ＧT(４Ｇ１９)成功克隆到载体p P I C ZαA上,鉴定结果与预先设计的基因序列一致,在甲醇诱导下复合肽基因得到表达,并得到临床分离的７６株革兰阴性和革兰阳性耐药致病菌的最小抑菌浓度,最小抑菌浓度可达到５μg/m L.结论㊀成功获得了具有抑菌活性的复合基因工程抗菌肽,且该复合肽对临床常见多重耐药菌株均有明显的抑杀作用.关键词:复合抗菌肽;㊀天蚕素A;㊀死亡素;㊀毕赤酵母表达系统;㊀抑菌活性D O I:１０．３９６９/j．i s s n．１６７３Ｇ４１３０．２０１８．１２．００９中图法分类号:R９３;Q７８文章编号:１６７３Ｇ４１３０(２０１８)１２Ｇ１４３９Ｇ０５文献标识码:AS t u d y o n e x p r e s s i o na n da c t i v i t y o f c o m b i n a n t a n t i m i c r o b i a l p e p t i d e i n P i c h i a p a s t o r i s∗Y A N GG u i m a o,T A OY u a n y o n g,S U N W a n l i,Z HA N GX u g u a n gә(D e p a r t m e n t o f C l i n i c a lL a b o r a t o r y,S h a n d o n g P r o v i n c i a lK e y L a b o r a t o r y o f C l i n i c a lL a b o r a t o r yD i a g n o s t i c s/A f f i l i a t e dH o s p i t a l o f W e i f a n g M e d i c a lU n i v e r s i t y,W e i f a n g,S h a n d o n g２６１０３１,C h i n a)A b s t r a c t:O b j e c t i v e㊀T oc o n s t r u c t c e c r o p i nAＧt h a n a t i nc o m b i n a n t g e n ee n g i n e e r i n g a n t i m i c r o b i a l p e p t i d e g e n eC A(１Ｇ７)ＧT(４Ｇ１９)f o r e x p r e s s i o n i n P i c h i a p a s t o r i s．M e t h o d s㊀T h e c o m b i n a n t a n t i m i c r o b i a l p e p t i d e g e n e w a s a r t i f i c i a l l y s y n t h e s i z e dv i a g e n es p l i c i n g b y o v e r l a p e x t e n s i o n(S O E)．T h e g e n e w a sc l o n e di n t ot h e p P I C ZαAv e c t o r a n d t r a n s f o r m e d i n t o P i c h i a p a s t o r i s XＧ３３b y e l e c t r o p o r a t i o n．T h e p o s i t i v e c l o n e s o b t a i n e db y t h e s c r e e n i n g o f b l e o m y c i n r e s i s t a n c ew e r e i n d u c e db y m e t h a n o l,a n d t h e a n t i b a c t e r i a l a c t i v i t y o f t h e p r o d u c t s w a s d e t e c t e d a n d t h e a n t i m i c r o b i a l s p e c t r u m w a s e s t a b l i s h e d．R e s u l t s㊀T h e c o m b i n a n t p e p t i d e g e n eC A(１Ｇ７)ＧT (４Ｇ１９)w a s s u c c e s s f u l l y c l o n e d o n t h e c a r r i e r p P I C ZαA．T h e i d e n t i f i c a t i o n r e s u l t sw e r e c o n s i s t e n tw i t h t h e p r eＧd e s i g n e d g e n e s e q u e n c e．T h e c o m b i n a n t p e p t i d e g e n ew a s e x p r e s s e du n d e r t h e i n d u c t i o no fm e t h a n o l,a n d t h e m i n i m u m i n h i b i t o r y c o n c e n t r a t i o n o f７６s t r a i n s o fG r a mＧe g a t i v e a n dG r a mＧp o s i t i v e p a t h o g e n i c b a c t e r i a i s o l a t e d f r o mt h e c l i n i cw a so b t a i n e d,a n dt h em i n i m u mi n h i b i t o r y c o n c e n t r a t i o n w a su p t o５μg/m L．C o n c l u s i o n㊀A c o m b i n a n t g e n e t i c e n g i n e e r i n g a n t i m i c r o b i a l p e p t i d ew i t h a n t i b a c t e r i a l a c t i v i t y w a s o b t a i n e d s u c c e s s f u l l y a n d i t h a do b v i o u s i n h i b i t i o ne f f e c t o n c l i n i c a l c o m m o nm u l t i d r u gＧr e s i s t a n t s t r a i n s．K e y w o r d s:c o m b i n a n t a n t i m i c r o b i a l p e p t i d e;㊀c e c r o p i nA;㊀t h a n a t i n;㊀P i c h i a p a s t o r i s e x p r e s s i o ns y sＧt e m;㊀a n t i b a c t e r i a l a c t i v i t y㊀㊀抗菌肽是一种普遍存在于生物体内,由机体自身产生的具有多种生物学活性的多肽类物质[１].一般抗菌肽具有相对分子质量小,热稳定性好,不易产生耐药性,抗菌谱广,作用机制独特等特点[２].目前已被分离的抗菌肽中有数十种具有抗菌活性,包括单一肽和复合肽,它们不仅可以杀灭细菌,对真菌㊁病毒和原虫也有一定杀灭作用[３Ｇ４].在作用于细胞方面,仅对发生病变的真核细胞有明显杀伤作用,对正常细胞几乎无损伤,对机体具有保护作用.近年来,对抗菌肽的研究越来越重视,力求寻找其替代抗生素的可能性.有研究表明,抗菌肽的生物活性除了由自身序列决定外,还受净正电荷数㊁疏水性㊁α螺旋结构稳定性９３４１国际检验医学杂志２０１８年６月第３９卷第１２期㊀I n t J L a bM e d,J u n e２０１８,V o l．３９,N o．１２∗基金项目:潍坊医学院科技创新基金资助项目(K１３０２０２３).㊀㊀作者简介:杨桂茂,男,主管技师,主要从事病原体的分子诊断研究.㊀ә㊀通信作者,EＧm a i l:１３９５３６２０９６２＠１６３．c o m.㊀㊀本文引用格式:杨桂茂,陶元勇,孙万里,等．复合抗菌肽在毕赤酵母中的表达及其活性研究[J]．国际检验医学杂志,２０１８,３９(１２):１４３９Ｇ１４４２．等多种理化因素及空间结构的影响[５Ｇ６].天蚕素A来自于家蚕,为阳离子型抗菌肽,其蛋白结构为双亲α螺旋结构,具有广谱的杀菌能力,热稳定性好且对正常细胞无杀灭作用.有研究发现,天蚕素A的N端序列对于其抗菌活性具有重要作用[７Ｇ９].死亡素是在昆虫斑腹刺益蝽中发现的小分子抗菌肽[１０],结构简单,对革兰阳性菌㊁革兰阴性菌和某些真菌都有抑制作用,但是对金黄色葡萄球菌的抗性较低[１１].因此,探寻一些长度显著缩短但仍具广谱抗菌活性且对人体无害的多肽就成了人们努力的目标.本研究选取抗菌肽天蚕素A的第１~７个氨基酸残基及死亡素的第４~１９个氨基酸残基,以毕赤酵母偏爱的密码子设计合成了复合肽C A(１Ｇ７)ＧT(４Ｇ１９)基因.此设计既避免了在体内应用时引起免疫反应,又增强了其杀菌的活性,通过优化该复合肽在酵母表达体系中的表达条件,使其达到高效稳定的蛋白表达量,从而建立新型复合基因工程抗菌肽的高效毕赤酵母表达体系及生产工艺,并初步探讨其抑菌活性,为临床后期选择理想的抗菌药物提供新的领域.１㊀材料与方法１．１㊀材料１．１．１㊀菌株㊀毕赤酵母受体菌XＧ３３由南京农业大学提供,表达载体p P I C ZαA购于I n v i t r o g e n公司, D H５α㊁实验菌株由本实验室保存.１．１．２㊀主要试剂㊀D N A标准相对分子质量M a r kＧe r㊁T４D N A连接酶㊁限制性内切酶购自T a K a R a公司;P C R试剂盒㊁细菌D N A提取试剂盒㊁D N A凝胶回收试剂盒购自P r o m e g a公司.１．２㊀复合抗菌肽基因引物的设计与合成㊀以现有的抗菌肽的作用机制假说为根据,利用重叠区扩增基因拼接法(S O E)[１２]人工合成复合肽基因,并在两端分别引入X h oⅠ㊁X b aⅠ酶切位点.自行设计特异性引物,序列如下.P１:５ᶄＧC C G C T C G A G A T G C A T C A T C A T C A T C A T C A T A A A A G A A A G T G G A A G C T G T T CA A G A A G A T CG G TC C A G G TＧ３ᶄ;P２:５ᶄＧT A G T C TA G AC T AG A AC T TC T TC T TC T T G T G C A G G A A C T T A C C T G G A C C G A T C T T C T TＧ３ᶄ.另设计合成另一对引物用于重组载体及重组酵母菌的鉴定,序列如下.F１:５ᶄＧG A C T G G T T C C A A T T G A C A A G CＧ３ᶄ;F２:５ᶄＧG C A A A T G G C A T TC T G A C A T C CＧ３ᶄ.P１㊁P２和F１㊁F２均由上海生物工程公司合成.应用S O E法,以P１㊁P２互为模板㊁互为引物采用降落P C R(T DＧP C R)技术进行扩增.T DＧP C R反应体系(２５μL):P１１μL,P２１μL,２ˑP C R M a s t e rM i x １２．５μL,双蒸水(d d H２O)１０．５μL.扩增条件:９４ħ１m i n;９４ħ３０s,退火温度从６５ħ降至５０ħ,每个循环１m i n,每个循环降低０．５ħ,７２ħ３０s,循环３０次;延伸７２ħ５m i n.２．０％琼脂糖凝胶电泳检测P C R产物.１．３㊀重组表达载体的构建和鉴定㊀合成的复合抗菌肽基因和p P I C ZαA均用X h oⅠ㊁X b aⅠ双酶切,分别电泳胶回收后用T４D N A连接酶连接,连接产物转化E．c o l i D H５α,涂布于含２５μg/m LZ e o c i n的L B平板３７ħ过夜,挑转化子培养抽提质粒后进行酶切鉴定,并送I n v i t r o g e n公司测序.１．４㊀重组载体转化毕赤酵母XＧ３３及转化后的筛选鉴定㊀测序确认后的阳性克隆提取质粒后用S a cⅠ处理使其线性化,取５μg与８０μL感受态的毕赤酵母XＧ３３相混合,１．５k V㊁２５μF㊁２００Ω电击后,均匀涂布于Y P D Z培养平板上,置３０ħ培养箱至单菌落出现.采用煮Ｇ冻Ｇ煮法制备P C R模板[１３],以F１㊁F２为引物,反应体系同上,反应条件:９４ħ５m i n;９４ħ３０s;５２ħ４５s;７２ħ４５s,３０个循环;７２ħ６m i n.以能扩出６０７b p的克隆定为阳性转化子.以同样方法将p P I C ZαＧA空载体酶切线性化后电转化XＧ３３酵母菌,作为质粒对照.１．５㊀复合抗菌肽在摇瓶中的诱导表达及浓度和初步抗菌活性测定㊀将筛选到的阳性克隆酵母菌接种到５m LB MG Y培养基中,３０ħ振荡培养至O D６００达到３~６;室温２０００r/m i n离心５m i n收集菌体,垂悬于２５m LB MMY培养基中继续振荡培养,期间每隔２４h补加终浓度为２％(V/V)的甲醇.７２h后,１００００r/m i n离心５m i n收集培养液上清,用B C A法测定浓度,并将培养液加到已接种待检菌的琼脂平板小孔内进行初步抑菌活性测定.１．６㊀重组抗菌肽抗菌谱的完善㊀用液体生长抑制法测定重组抗菌肽对临床常见耐药致病菌的最小抑菌浓度(M I C).将能完全抑制菌体生长的最低抗菌肽浓度确定为M I C.试验菌株来自潍坊医学院附属医院检验科分离的临床常见致病菌,均进行了药敏测试.具体操作:把处于对数生长期O D６００ʈ０．５的各个菌株用L B培养液稀释到１０６C F U/m L,分别接种到９６孔细胞培养板上,每孔接种５０μL,然后分别加入稀释的不同浓度的抗菌肽５０μL,混匀.每组重复３个孔,设只加L B培养液的孔为阴性对照,不加抗菌肽接种细菌的L B培养液为阳性对照.３７ħ培养２０h后取出,测量其O D值,以O D值无变化的孔中抗菌肽的浓度作为M I C.２㊀结㊀㊀果２．１㊀复合抗菌肽基因的扩增㊀通过P C R扩增的复合抗菌肽基因经２％琼脂糖凝胶电泳,可观察到大小约为８７b p的单一条带,与预期大小一致,见图１.２．２㊀重组质粒的酶切鉴定和序列测定㊀取博莱霉素抗性筛选的转化子经培养后抽提重组质粒.分别用X h oⅠ和E c o RⅠ单酶切,重组质粒上X h oⅠ㊁X b aⅠ０４４１国际检验医学杂志２０１８年６月第３９卷第１２期㊀I n t J L a bM e d,J u n e２０１８,V o l．３９,N o．１２间的E c o R Ⅰ酶切位点缺失,限制性内切酶X h o Ⅰ酶切可以使其线性化,而用E c o R Ⅰ不能使其线性化,见图２.经缺失酶切位点鉴定阳性的重组质粒测序,截取复合肽基因片断测序图谱见图３,与预期设计一致.㊀㊀注:１．P C R 产物;M．D N A M a k e r图１㊀㊀复合抗菌肽基因㊀㊀注:M．D N A M a k e r ;１．pP I C Z αA ;２．重组p P I C Z αA X h o Ⅰ单酶切;３．重组p P I C Z αA E c o R Ⅰ单酶切图２㊀㊀单酶切鉴定图３㊀㊀复合肽基因序列测定㊀㊀注:１．pP I C Z αA ;２．重组体图４㊀㊀复合抗菌肽对大肠埃希菌(G －菌)的抑菌活性２．３㊀复合抗菌肽初步抗菌活性测定㊀抑菌活性测定结果显示,在加有３０μL 重组酵母菌表达产物的孔周围形成一透明抑菌圈,加有３０μL p P I C Z αA 空载体转化酵母的上清的孔周围无抑菌圈.研究表明抗菌肽对革兰阴性菌(G －菌)大肠埃希菌和革兰阳性菌(G ＋菌)金黄色葡萄球菌均具有明显的抑菌活性,抑菌圈直径分别为３２m m 和４６m m ,而p P I C Z αA 空载体转化的酵母菌表达产物没有抑菌活性,见图４㊁５.通过B C A 法测定复合抗菌肽终浓度为１５０m g /L .２．４㊀重组抗菌肽抗菌谱的完善及M I C 测定㊀用菌体液体生长抑制法测得该复合肽对临床分离的７６株耐药致病菌的M I C 分别见表１㊁２.结果显示,复合肽对多重耐药的G ＋菌和G －菌均具有良好的抑菌作用.㊀㊀注:１．pP I C Z αA ;２．重组体图５㊀㊀复合抗菌肽对金黄色葡萄球菌(G ＋菌)的抑菌活性表１㊀㊀复合肽对临床分离的５５株G －菌的M I C (μg /m L )菌株名称M I C菌株名称M I C鲍曼不动杆菌１１５．０肺炎克雷伯菌８１０．０鲍曼不动杆菌２５．０肺炎克雷伯菌９７．５鲍曼不动杆菌３５．０嗜水气单胞菌１７．５鲍曼不动杆菌４７．５铜绿假单胞菌１７．５鲍曼不动杆菌５１５．０铜绿假单胞菌２７．５产酸克雷伯菌１７．５铜绿假单胞菌３１５．０产酸克雷伯菌２１０．０铜绿假单胞菌４１５．０产酸克雷伯菌３７．５铜绿假单胞菌５１５．０产酸克雷伯菌４７．５铜绿假单胞菌６５．０产酸克雷伯菌５１０．０铜绿假单胞菌７１５．０大肠埃希菌１１０．０铜绿假单胞菌８１５．０大肠埃希菌２７．５洋葱伯克霍德菌１１０．０大肠埃希菌３１０．０洋葱伯克霍德菌２７．５大肠埃希菌４５．０洋葱伯克霍德菌３１０．０大肠埃希菌５１０．０阴沟肠杆菌１７．５大肠埃希菌６１０．０阴沟肠杆菌２７．５大肠埃希菌７７．５阴沟肠杆菌３７．５大肠埃希菌８１０．０阴沟肠杆菌４１５．０大肠埃希菌９１０．０阴沟肠杆菌５７．５１４４１国际检验医学杂志２０１８年６月第３９卷第１２期㊀I n t J L a bM e d ,J u n e ２０１８,V o l ．３９,N o ．１２续表１㊀㊀复合肽对临床分离的５５株G－菌的M I C(μg/m L)菌株名称M I C菌株名称M I C 大肠埃希菌１０７．５阴沟肠杆菌６７．５大肠埃希菌１１１０．０阴沟肠杆菌７７．５肺炎克雷伯菌１７．５阴沟肠杆菌８５．０肺炎克雷伯菌２７．５阴沟肠杆菌９７．５肺炎克雷伯菌３７．５阴沟肠杆菌１０７．５肺炎克雷伯菌４７．５阴沟肠杆菌１１１５．０肺炎克雷伯菌５７．５阴沟肠杆菌１２７．５肺炎克雷伯菌６７．５黏质沙雷菌１１０．０肺炎克雷伯菌７７．５黏质沙雷菌２７．５㊀㊀注:同种名称细菌不同编号代表来自不同标本的菌株表２㊀㊀复合肽对临床分离的２１株G＋菌的M I C(μg/m L)菌株名称M I C菌株名称M I C 表皮葡萄球菌１７．５金黄色葡萄球菌５７．５表皮葡萄球菌２７．５金黄色葡萄球菌６７．５表皮葡萄球菌３７．５人葡萄球菌１３．７表皮葡萄球菌４５．０人葡萄球菌２１０．０表皮葡萄球菌５７．５人葡萄球菌３５．０鹑鸡肠球菌１１０．０溶血葡萄球菌１５．０鹑鸡肠球菌２７．５溶血葡萄球菌２７．５金黄色葡萄球菌１３．０溶血葡萄球菌３７．５金黄色葡萄球菌２７．５溶血葡萄球菌４７．５金黄色葡萄球菌３３．０屎肠球菌１１０．０金黄色葡萄球菌４１０．０㊀㊀注:同种名称细菌不同编号代表来自不同标本的菌株３㊀讨㊀㊀论㊀㊀利用巴斯德毕赤酵母表达系统表达蛋白质是近年发展起来的一种新兴分子生物学技术.巴斯德毕赤酵母是一种能高效表达重组蛋白的表达受体,该系统在D N A重组技术中已被广泛地应用.另外,真菌表达系统中的酵母菌与其他菌不同,酵母菌分泌到细胞外培养基中蛋白几乎都是分泌表达的外源蛋白,其自身的内源蛋白很少分泌到胞外,从而可以从培养基中获得较高表达量的目的蛋白,且利于表达产物的后期分离纯化.近年来,为了提高抗菌肽的表达量和抑菌能力,研究人员尝试对抗菌肽蛋白结构进行氨基酸的修饰,从而寻找决定抗菌肽活性的关键序列,并进一步进行分子设计,以获得抗菌肽的最佳活性.同时,将不同功能和结构的多肽杂合在一起进行研究,国内外也有相关报道[１４Ｇ１６].本研究截取了天蚕素A和死亡素的部分发挥作用的序列,串联重组后利用酵母表达系统进行甲醇诱导表达,结果复合肽C A(１Ｇ７)ＧT(４Ｇ１９)以分泌形式释放到培养基中,成功实现了复合抗菌肽在巴斯德毕赤酵母中的分泌表达.本研究中,从抗菌谱实验结果可以看出,所合成的复合肽对临床常见耐药致病菌株均有很好的抑制和杀灭作用,尤其是对一些临床分离的多种耐药鲍曼不动杆菌及泛耐药鲍曼不动杆菌均有明显的抑杀活性,M I C达到５μg/m L,而且与细菌的耐药率无关,如鲍曼不动杆菌５与来自其他标本的４株鲍曼不动杆菌相比,其耐药率明显低于其他４株,但M I C却比其他４株要高.M I C测定结果还显示,该复合肽对临床常见的鲍曼不动杆菌㊁产酸克雷伯菌㊁铜绿假单胞菌㊁洋葱伯克霍德菌㊁阴沟肠杆菌㊁黏质沙雷菌等G－菌及表皮葡萄球菌㊁鹑鸡肠球菌㊁金黄色葡萄球菌㊁人葡萄球菌㊁溶血葡萄球菌㊁屎肠球菌等G＋菌均有明显的抑菌活性.在实验阶段内,尚未发现对该复合肽不敏感的临床标本分离细菌菌株.㊀㊀本研究成功构建了重组载体并顺利电转化到表达宿主毕赤酵母XＧ３３中,获得了具有抑菌活性的复合基因工程抗菌肽.抑菌活性试验显示,复合抗菌肽对临床常见致病菌株均有较好的抑杀活性.它的出现为人们寻找理想的抗菌药物提供新的领域,虽然人们不断研制新型抗菌药物或改造原有抗菌药物来杀灭耐药致病菌,但是常规抗菌药物研制速度较慢,且容易使细菌产生耐药性,因此治疗耐药菌感染的局限性越来越明显.抗菌肽由于其独特的抗菌机制有望替代抗菌药物应用于耐药菌感染的治疗,从而为解决细菌耐药性这一棘手难题提供了新途径.因此,很有可能成为临床上最有前景的抗菌药物.参考文献[１]单安山,马得莹,冯兴军,等．抗菌肽的功能㊁研发与应用[J]．中国农业科学,２０１２,４５(１１):２２４９Ｇ２２５９．[２]卫旭彪,武如娟,郑召君,等．抗菌肽的免疫调节功能及其作用机制[J]．饲料工业,２０１５,３６(２２):５５Ｇ５８．[３]L A K S HMA I A H N A R A Y A N AJ,C H E NJY．A n t i m i c r oＧb i a l p e p t i d e s:p o s s i b l ea n t iＧi n f e c t i v ea g e n t s[J]．P e p t i d e s,２０１５,７２:８８Ｇ９４．[４]H U R O T H A N H A,B A H R A N IH,S H A N K A RE M,e t a l．I n h i b i t o r y e f f e c t s o f a p e p t i d eＧf u s i o n p r o t e i n(L a t a r c i nＧP A P１ＧT h a n a t i n)a g a i n s tc h i k u nＧg u n y av i r u s[J]．A n t i v i r a l R e s,２０１４,１０８(４):１７３Ｇ１８０．[５]L E EE,J E O N GK W,L E EJ,e t a l．S t r u c t u r eＧa c t i v i t y r e l aＧt i o n s h i p so fc e c r o p i nＧl i k e p e p t i d e sa n dt h e i ri n t e r a c t i o n s w i t h p h o s p h o l i p i d m e m b r a n e[J]．B M B R e p o r t s,２０１３,４６(５):２８２Ｇ２８７．[６]C H E N Y,G U A R N I E R IM T,V A S I L AI,e t a l．R o l eo f p e p t i d eh y d r o p h o b i c i t y i n t h em e c h aＧ(下转第１４４７页)２４４１国际检验医学杂志２０１８年６月第３９卷第１２期㊀I n t J L a bM e d,J u n e２０１８,V o l．３９,N o．１２MA L D IB i o t y p e r数据库与自建布鲁菌数据库分析临床分离株,可以准确㊁快速㊁灵敏地鉴别布鲁菌,对布鲁菌病的临床诊断具有较高的应用价值,可使患者及时获得有效的治疗,并采取适当的医院内感染控制措施防止疫情扩散,加强生物安全管理避免实验室获得性感染.参考文献[１]D EF I G U E I R E D O P,F I C H T T A,R I C EＧF I C H T A,e t a l．P a t h o g e n e s i s a n d i m m u n o b i o l o g y o f b r u c e l l o s i s:r e v i e wo f B r u c e l l aＧh o s t i n t e r a c t i o n s[J]．A mJP a t h o l,２０１５,１８５(６):１５０５Ｇ１５１７．[２]毛景东,王景龙,杨艳玲．布鲁氏菌病的研究进展[J]．中国畜牧兽医,２０１１,３８(１):２２２Ｇ２２７．[３]施旭光,凌锋．布鲁氏菌病研究进展[J]．浙江预防医学,２０１４,２６(６):５７６Ｇ５８０．[４]王冰,任晓庆,褚美玲,等．MA L D IＧT O 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e２０１８,V o l．３９,N o．１２。

昆虫抗菌肽的合成及在毕赤酵母中的表达的开题报告

昆虫抗菌肽的合成及在毕赤酵母中的表达的开题报告题目：昆虫抗菌肽的合成及在毕赤酵母中的表达引言：自然界中存在着许多昆虫抗菌肽，具有广谱抗菌作用，对许多病原微生物有一定的杀灭效果。

昆虫抗菌肽通常由20-50个氨基酸残基组成，具有低分子量、稳定性和高效性的特点，因此具有成为天然抗菌剂的潜力。

毕赤酵母是一种广泛应用于生物学实验中的单细胞真核生物。

它具有许多优良的特性，如容易培养、对环境适应性强、遗传修饰容易等。

同时，毕赤酵母也被广泛用于蛋白质表达、分泌以及研究中。

本研究旨在通过化学合成或基因工程技术，合成出具有抗菌活性的昆虫抗菌肽，并将其转化到毕赤酵母中进行表达，以期在工业或医药领域发挥其广泛的应用价值。

研究内容及方法：1. 昆虫抗菌肽的合成从天然界中筛选出具备广谱抗菌活性的昆虫抗菌肽，并且在其基础上进一步对其进行化学合成。

合成昆虫抗菌肽的方法通常有两种，一种是基于固相合成技术，另一种是基于溶液相合成技术。

固相合成技术是在小球上连续合成昆虫抗菌肽，连续反复洗涤。

溶液相合成技术是在溶液中合成昆虫抗菌肽。

2. 在毕赤酵母中的表达用基因工程技术将昆虫抗菌肽基因插入到毕赤酵母的表达载体中，并将其转化到毕赤酵母中进行表达。

首先进行真核细胞基因的克隆和表达载体的构建。

并采用PCR 扩增、酶切、连接等技术，将昆虫抗菌肽基因与可表达载体进行连接。

常用的表达载体有pYES2、pPICZ、pGAP等。

选择合适的载体将其转化到毕赤酵母中，然后进行酵母细胞的培养、分离、表达、纯化以及抗菌活性分析等工作。

预期结果：通过本研究，可以制备出具备较高抗菌活性的昆虫抗菌肽，并且成功将其转化到毕赤酵母中进行表达。

通过对毕赤酵母中表达的昆虫抗菌肽的特性分析，将有助于深入了解昆虫抗菌肽在不同系统中的表达及其抗菌机制，为其广泛应用于工业和医药领域提供支持。

抗菌肽毕赤酵母的制备与应用[发明专利]

专利名称：抗菌肽毕赤酵母的制备与应用专利类型：发明专利
发明人：黄自然,黄亚东,郑青,姚汝华
申请号：CN01112278.1
申请日：20010403
公开号：CN1322815A
公开日：
20011121
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：柞蚕抗菌肽具有广谱杀菌作用。

根据天然抗菌肽A的1－11位氨基酸序列及抗菌肽D的12－37位氨基酸序列,设计抗菌肽AD基因,克隆于毕赤酵母中表达。

经优化培养基配方和培养条件,在发酵罐中达到高密度培养及高效表达(5000单位/毫升)。

将抗菌肽酵母制品按5000单位/kg添加于仔猪饲料中,或以60－100单位/日·头添加于雏鸡饮水中,能预防与治疗禽畜腹泻,可代替部分抗生素作为饲料添加剂。

申请人：深圳市艺鹏生物工程有限公司
地址：518031 广东省深圳市深南中路1027号新城大厦西座9楼
国籍：CN
代理机构：长春科宇专利代理有限责任公司
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改造后的抗菌肽AD 基因在毕赤酵母中表达效价研究3赵亚华133　徐　伟1　蔡家伟1　胡　康1　廖富　2　黄自然2(1华南农业大学生命科学学院　广州　510642 2华南农业大学艺术设计学院　广州　510642)摘要　通过PCR 方法使抗菌肽AD 基因中带有Xho Ⅰ和Xba Ⅰ酶切位点序列,再克隆到表达载体pPICZ α2A 中,重组表达载体转化G S115,经重组酵母菌表达的抗菌肽AD ,其N 端去除了其它氨基酸。

对重组抗菌肽培养条件进行优化,在YEPD 中含葡萄糖2%,pH 为715,重组酵母菌培养30h 后,015%甲醇诱导42h ,杀菌效价达11843,是改造前的311倍。

最后重组抗菌肽经C M 2cellulose 23柱层析得到纯化。

关键词　抗菌肽AD 表达载体pPICZ α2A G S115　表达效价收稿日期:2003206202　修回日期:20032072223广东省自然科学基金资助项目(编号:980174)33电子信箱:yhzhao @ 青霉素的发现使人们对由病原微生物感染而引发的各类疾病不再束手无策,并由此发展了大量的β2内酰胺类抗生素,对保护人类健康作出了巨大贡献。

但随着上述青霉素类抗生素的广泛使用,不断产生出诸多新问题。

如β2内酰胺类抗生素的过敏反应以及长期使用导致抗药菌株的产生。

同时,大部分抗生素只具杀菌作用对细菌产生的毒素成分完全无中和作用,很多抗生素还能使炎症加重,于是人们开始寻找新一代抗菌剂[1]。

抗菌肽是生物体内诱导产生的一种具有强抗菌作用的多肽类物质,分子量为4000Da 左右,由30多个氨基酸组成,它的两亲性α螺旋结构可使细胞膜形成通道,破坏膜势,使细胞内物质外渗,导致细胞死亡,起到杀菌作用[2]。

同时具有青霉素类抗生素无法比拟的优越性:不会诱导抗药菌株的产生,有希望成为新一代抗菌剂。

抗菌肽AD 基因最初由郑青设计,根据抗菌肽A 的1～11氨基酸序列和抗菌肽D 的12～37氨基酸序列的编码合成而来,后由黄亚东改造,在其C 末端增加一个Asn 编码,并实现了在毕赤酵母中的表达[3]。

Andreu 等[4]认为抗菌肽N 端的两亲螺旋结构的完整性对其抗菌活性有重要影响,Fink 等[5]也认为强碱性的N 端在抗菌活性中起决定性作用。

针对黄亚东改造的Cecropin AD ,发现其经酵母表达后的目的抗菌肽N 端比预期序列多3个氨基酸,分别是G lu 、Phe 、Met ,前两个为酶切点EcoR Ⅰ的G AATTC 编码,后一个为ATG 编码。

它们可能会降低Cecropin AD 的效价。

本实验针对多出的三个氨基酸,通过设计PCR 引物,改变克隆的酶切位点,使最终经毕赤酵母表达后的抗菌肽不含这三个氨基酸,以提高Cecropin AD 的杀菌效价。

1　材料111　菌种及质粒E .coli K 12D 31、E .coli T OP10、酵母受体菌G S115及质粒pHI L 2S12C AD5(含有抗菌肽AD 基因)、pPICZ α2A 均由黄自然教授提供。

112　培养基及分子生物学试剂T 4DNA Ligase 系Promega 公司,Tryptone 、Y east Extract 系Oxid 公司,蜗牛酶、100bp DNA Ladder 为北京鼎国生物技术发展中心产品,λDNA ΠHind Ⅲ、Taq DNA 聚合酶、dNTP 、Mg2+、质粒纯化试剂盒、Xho Ⅰ、Xba Ⅰ、RNase 系S ABC 公司产品,Sac Ⅰ系T aK aRa 产品,Z eocin 系Invitrogen 公司,其余常用试剂为国产分析纯。

2　方法211　重组毕赤酵母菌的构建21111　重组表达载体的构建　以Primer A :第23卷第8期中　国　生　物　工　程　杂　志CHI NA BI OTECH NO LOGY2003年8月G CG CTCG AG AAAAG AAAATGG AAG TTG TTC和Primer D:G CG TCT AG ATT AG TTCTT AG CC AAGG C AG T为引物,以pHI L2S12C AD5为模板,在PCR扩增仪上扩增出抗菌肽AD基因,PCR产物和载体pPICZα2A均用XhoⅠ、XbaⅠ双酶切,然后通过连接酶连接抗菌肽AD基因与pPICZα2A,连接产物转化到E.coli T OP10中,经酶切、PCR和测序筛选阳性重组表达载体。

21112　重组表达载体转化酵母　获得的重组表达载体大量培养,抽提质粒,用SacⅠ酶切,线性化,用LiCl法转化到G S115中,在含100μgΠml Z的平板上筛选转化酵母,在YEPD中培养,抽提酵母总DNA,通过PCR法鉴定重组酵母。

同时,鉴定的阳性重组酵母菌培养24h后,1%甲醇诱导48h后取5μl做抑菌试验。

212　重组抗菌肽表达菌株的诱导表达21211　重组酵母菌生长密度的测定　重组酵母菌培养12h后,每6h取样测定OD.600值,同时,离心弃上清,称菌体重量。

21212　培养基中葡萄糖的消耗　在YEPD中培养重组酵母菌,每6h取样,按3,52二硝基水杨酸法测定葡萄糖的消耗。

21213　YEPD中不同葡萄糖含量对重组抗菌肽表达菌株的影响　在YEPD中葡萄糖分别为010%, 015%,110%,115%,210%,215%,310%时培养重组酵母菌,24h后,加入110%(vΠv)甲醇诱导,48h 后各取5μl做抑菌试验。

21214　YEPD中不同pH对重组抗菌肽表达菌株表达的影响　配制YEPD培养基,分别用015m olΠL H2S O4或2m olΠL NaOH调pH至5、515、6、615、7、715、8,灭菌备用,分别在上述不同pH的培养基上培养重组酵母菌,24h后,1%(vΠv)甲醇诱导48h 后,各取5μl做抑菌试验。

21215　不同甲醇诱导量对重组抗菌肽表达菌株表达的影响　重组酵母菌培养24h,按010%,015%,110%,115%,210%(vΠv)加入甲醇诱导重组抗菌肽的表达,48h后各取5μl做抑菌试验。

21216　诱导前培养时间对重组抗菌肽表达菌株表达的影响　重组酵母菌分别按培养12h,24h,36h, 48h,60h后,再加入110%(vΠv)甲醇诱导,48h后各取5μl做抑菌试验。

21217　诱导后的时间对重组抗菌肽表达菌株表达的影响　重组酵母菌培养24h,加入110%(vΠv)甲醇诱导重组抗菌肽的表达,然后按诱导后12h,24h, 36h,48h,60h,72h后各取5μl做抑菌试验。

21218　重组抗菌肽表达菌株的热稳定性的测定　重组抗菌肽单菌落在含210%葡萄糖,pH715的YEPD培养基中培养30h后,加入015%(vΠv)甲醇诱导,42h后,5000rΠmin离心5min,收集上清,分别沸水浴10min,20min,30min,40min,50min,60min各取5μl做抑菌试验。

21219　重组抗菌肽表达产物杀菌效价测定　重组抗菌肽单菌落在含2%葡萄糖,pH715的YEPD培养基中培养30h后,加入015%甲醇诱导,42h后, 5000rΠmin离心5min,收集上清。

按Hultmark等[6]方法测定重组抗菌肽杀菌效价。

213　重组抗菌肽表达菌株表达产物的分离与纯化重组抗菌肽表达菌株单菌落在含2%葡萄糖, pH715的YEPD培养基中培养30h后,加入015% (vΠv)甲醇诱导,42h后,5000rΠmin离心5min,收集上清。

经C M2cellulose23柱层析纯化,平衡液为0105m olΠL H Ac,梯度洗脱液为0105～1m olΠL H Ac,流速:0145mlΠmin。

分离纯化后的样品进行Tricine2 S DS2PAGE分析。

3　结果311　重组表达载体的鉴定将连接产物转化E.coli T OP10中,通过PCR 鉴定(图1),酶切鉴定(图2)和测序确认重组表达载体。

图1　重组表达载体的PCR鉴定1:XhoⅠ、XbaⅠ酶切pPICZα2A　2:XhoⅠ、XbaⅠ酶切重组表达载体pPICZα2A2AD　3:100bp Ladder M arker从图1和图2可见,在100bp与200bp之间有一条很清晰的目的条带,将此样进行测序,结果如87中　国　生　物　工　程　杂　志第23卷下:CTCG AG AAAAG AAAATGG AAG TTG TTC AAAAAG ATT G AAAAGG TTGG TC AAAG AG TT AG AG ACG CTG TC ATC TCTG CTGG TCCTG CTG TTG CC ACTG TTG CTC AAG CC A CTG CCTTGG CT AAG AACT AATCT AGA图2　重组表达载体PCR 鉴定1:100bp Ladder M arker 2:重组表达载体pPICZ α2A 2AD PCR3:pPICZ α2A PCR 4:不加模板PCR经测序,AD 基因与设计的序列完全一致。

312　重组酵母菌的鉴定获得的重组表达载体大量培养,用Sac Ⅰ酶切线性化,经LiCl 法转化G S115,通过PCR 法鉴定重组转化酵母菌,如图3。

图3　重组酵母的PCR 鉴定1:重组酵母总DNA PCR 2:100bp Ladder M arker获得的重组酵母菌培养,进行生物活性鉴定,如图4。

从图4可以看出,重组酵母菌经甲醇诱导后有抑菌活性。

313　重组抗菌肽表达菌株的诱导表达31311　重组酵母菌生长密度的测定　在重组酵母菌培养12h 后,每6h 取样测OD600和菌体重量,分别见图5。

从图5可以看出,重组酵母菌在接种后12～24h 中的生长最为旺盛,为对数生长期;24～36h 为线性生长期,36h 之后为稳定期。

图4　重组酵母菌诱导与不诱导的比较+:经甲醇诱导　-:未经甲醇诱导图5　OD 值2时间关系曲线31312　培养基中葡萄糖的消耗　利用3,52二硝基水杨酸(DNS )法测葡萄糖的消耗,结果如图6。

从图中可以看出培养12～24h 期间葡萄糖的消耗量增长最快,因为此时酵母菌处于对数生长期。

而30h 以后,葡萄糖就渐渐被消耗殆尽。

图6　葡萄糖消耗率2培养时间关系曲线31313　葡萄糖含量对重组抗菌肽表达菌株表达的影响　改变YEPD 培养基中的葡萄糖含量,结果如图7。

由图7、图8可以看出,当葡萄糖含量为2%时,所得的抑菌圈直径最大,说明诱导产生的抗菌肽AD 活性最强。

图7　葡萄糖含量对诱导活性的影响97第8期赵亚华等:改造后的抗菌肽AD 基因在毕赤酵母中表达效价研究图8　抑菌圈直径2葡萄糖含量曲线　31314　pH对重组抗菌肽表达菌株表达的影响　改变YEPD培养基的pH,结果如图9、图10。