分离科学试题

1.SPE与SPME的特点各是什么？相同性？相异性？SPE特点：SPE技术基于液-固相色谱理论，采用选择性吸附、选择性洗脱的方式对样品进行富集、分离、净化，是一种包括液相和固相的物理萃取过程。

其特点主要为：可同时完成样品富集与净化，大大提高检测灵敏度；比液液萃取更快；更节省溶剂,；可自动化批量处理；重现性好。

SPME特点：集萃取、浓缩、解吸、进样于一体的样品前处理新技术，它以固相萃取(SPE)为基础，保留了SPE的全部优点，排除了SPE需要柱填充物和使用有机溶剂进行解吸的缺点，并可用于GC和HPLC等仪器上直接进样。

它具有样品用量少、选择性高、使用方便、快捷等特点。

共同点：节约有机溶剂不会出现乳化现象缩短样品预处理时间容易操作可自动化控制不同点：SPME 提高了较SPE相比降低了预处理陈成本，提高了回收率，改善了吸附剂孔道易堵塞的问题，排除了SPE 需要柱填充物和使用有机溶剂进行解吸的缺点，并可用于GC和HPLC等仪器上直接进样。

2.SPE中各种萃取模式的特点及适用范围？固相萃取实质上是一种液相色谱分离，其主要分离模式也与液相色谱相同，可分为正相SPE，反相SPE，离子交换SPE和吸附SPE。

正相SPE所用的吸附剂都是极性的，用来萃取（保留）极性物质。

在正相萃取时目标化合物如何保留在吸附剂上，取决于目标化合物的极性官能团与吸附剂表面的极性官能团之间的相互作用。

正相固相萃取可以从非极性溶剂样品中萃取极性化合物。

反相固相萃取所用的吸附剂通常是非极性的或极性较弱的，所萃取的目标化合物通常是中等极性到非极性化合物。

目标化合物与吸附剂间的作用是疏水性相互作用，主要是非极性非极性相互作用，范德华力或色散力。

主要用于从强极性溶剂中萃取非极性或弱极性化合物。

离子交换固相萃取所用的吸附剂是带有电荷的离子交换树脂，目标化合物与吸附剂之间的相互作用是静电吸引力，用于萃取带有电荷的化合物。

吸附SPE：一般指用的吸附剂是综合性的、多功能的萃取方法。

2.优化SPE的步骤是什么？选择吸附剂样品预处理活化上样淋洗洗脱4、何谓双水相萃取答：某些亲水性高分子聚合物的水溶液超过一定浓度后可以形成两相，并且在两相中水分均占很大比例，即形成双水相系统。

利用亲水性高分子聚合物的水溶液可形成双水相的性质，开发了双水相萃取法。

双水相萃取与水-有机相萃取的原理相似，都是依据物质在两相间的选择性分配。

当萃取体系的性质不同时，物质进入双水相体系后，由于表面性质、电荷作用和各种力（如憎水键、氢键和离子键等）的存在和环境因素的影响，使其在上、下相中的浓度不同。

5、双水相相图中各区域的含义是什么答：双水相相图是一根双节线，当成相组分的配比在曲线下方时，系统为均匀的单相。

混合后溶液澄清透明，称为均相区；当配比在曲线的上方时，能自动分成两相，称为两相区，当配比在曲线上，混合后，溶液由澄清变为浑浊。

6、常见的双水相构成体系有哪些答：可形成双水相的双聚合物体系很多，如聚乙二醇（PEG）/葡聚糖（Dx）,聚丙二醇/聚乙二醇，甲基纤维素/葡聚糖。

双水相萃取中采用的双聚合物系统是PEG/Dx，该双水相的上相富含PEG，下相富含Dx。

另外，聚合物与无机盐的混合溶液也可以形成双水相，例如，PEG/磷酸钾（KPi）、PEG/磷酸铵、PEG/硫酸钠等常用于双水相萃取。

PEG/无机盐系统的上相富含PEG,下相富含无机盐。

7.双水相适合萃取什么样品答：主要是分离蛋白质，酶，病毒，脊髓病毒和线病毒的纯化，核酸，DNA的分离，干扰素，细胞组织，抗生素，多糖，色素，抗体等。

此外双水相还可用于稀有金属/贵金属分离8、影响生物分子在两水相中分配的因素有哪些答：由于溶质在双水相系统两相间的分配时至少有四类物质在两个不同相系统共存，要分配的物质和各相组分之间的相互作用是个复杂的现象，它涉及到氢键、电荷相互作用、范德华力、疏水性相互作用以及空间效应等，因此，可以预料到溶质在双水相系统中两相间的分配取决于许多因素，它既与构成双水相系统组成化合物的分子量和化学特性有关，也与要分配物质的大小、化学特性和生物特性相关。

大量研究表明，生物分子在双水相系统中的实际分配是生物分子与双水相系统间静电作用、疏水作用、生物亲和作用等共同作用的结果，形式上可以将分配系数的对数值分解为几项：InK = InKm+InKe+In Kh+InKb+InKs+InKc式中，Ke-----静电作用对溶质分配系数的贡献；Kh----- 疏水作用对溶质分配系数的贡献；Kb-----生物亲和作用对溶质分配系数的贡献；Ks----- 分子大小对溶质分配系数的贡献；Kc----- 分子构型影响对溶质分配系数的贡献；Km -----除上述因素外的其它因素影响对溶质分配系数的贡献。

值得指出的是，这些因素中虽然没有一个因素完全独立于其它因素，但一般来说，这些不同的因素或多或少是独立存在的。

影响待分离物质在双水相体系中分配行为的主要参数有成相聚合物的种类、成相聚合物的分子质量和总浓度、无机盐的种类和浓度、pH 值、温度等。

9电泳分离蛋白质的原理是什么蛋白质是两性电解质，当PH > pI时带负电荷,在电场作用下向正极移动:PH > PI时带正电荷,在电场作用下向负极移动：PH=PI时净电荷为零，在电场作用下既不向正极移动也不向负极移动，此时的PH值即是该蛋白的PI值。

各种蛋白质中由不同种类的氨基酸一不同的比例组成，因而有不同的等电点，这是其固有的理化常数。

蛋白质在电场中汰动一段时间后，便会集中到确定的位置上呈一条致密区带。

若样品为混合的蛋白质溶液时，由于不同蛋白质的等电点和分子量是不同的，因此经电泳后，就形成了泳动度不同的区带。

利用此性质，便可把混合液中不同的蛋白质(或其它物质)分离开，也可用其对样品的纯度进行鉴定。

10、简述影响带电质点的泳动速度的因素（1）颗粒性质带电颗粒在电场中泳动的速度与带电颗粒的净电荷量成正比，与颗粒的半径成反比。

（2）电场强度E 愈高，带电颗粒的泳动速度愈快。

（3）溶液性质pH 偏离分子的等电点愈远，解离度愈大，净电荷愈多，泳动速度越快；离子强度加大，电流加大，泳动速度加快;泳动速度与溶液黏度成反比。

（4）电渗是支持物本身所带的电荷吸附溶液中性质相反的离子，在电场中移动的结果。

其带电愈高，电渗力愈大。

当颗粒的泳动方向与电渗方向一致时，加快颗粒的泳动速度；当颗粒的泳动方向与电渗方向相反时，则降低颗粒的泳动速度。

（5）焦耳热电泳过程中释放的热量与电流强度的平方成正比。

当电场强度或电极缓冲液离子强度增高，电流强度也增加，不仅降低分辨率(即电泳谱带的展宽和组分的热混和)，严重时甚至烧断或熔化支持介质。

（6）筛孔在筛孔大的凝胶中溶质颗粒的泳动速度快。

11、什么是电渗？带电质点泳动速度与电渗的关系如何？电渗是支持物本身所带的电荷吸附溶液中性质相反的离子，在电场中移动的结果。

其带电愈高，电渗力愈大。

当颗粒的泳动方向与电渗方向一致时，加快颗粒的泳动速度；当颗粒的泳动方向与电渗方向相反时，则降低颗粒的泳动速度。

12、PAGE、SDS-PAGE、IEFE中文名称是什么？简述各自的分离原理聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(Acr)和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺(Bis)在加速剂N,N,N,N-四甲基乙二胺(TEMED)和催化剂过硫酸铵(AP)或核黄素(C17H2O6N4)的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)。

不连续PAGE，（1）凝胶层的不连续；浓缩胶浓度为2.5%-4%，分离胶则根据被分离样品的情况而定。

（2）缓冲液离子成分的不连续；在两层凝胶中加入前导离子，在电极缓冲液中加入尾随离子。

为保持溶液的电中性及一定的pH，在缓冲液中加入一种与前导和尾随离子符号相反的离子，为缓存配对离子。

在分离蛋白质样品时，常用的前导离子为Cl，甘氨酸根负离子为尾随离子，采用三羟甲基氨基甲烷（Tris）作为缓冲配对离子。

（3）电位梯度的不连续：前导离子后面形成了高的电位梯度。

当前导离子、尾随离子和蛋白质迁移率和电位梯度的乘积相等是，则三种离子移动速度相同。

在前导离子和尾随离子之间形成一个稳定的不断向阳极移动的界面。

也就是在高电位梯度和低电位梯度之间形成一个迅速移动的界面。

（4）pH值的不连续：在浓缩胶和分离胶之间有pH的不连续，这是为了控制尾随离子的解离度，从而控制其有效迁移率。

要求在浓缩胶中，慢离子较所有被分离样品的有效迁移率低，以使样品夹在前导和尾随离子界面之间，使样品浓缩。

而在分离胶中尾随离子的有效迁移率比所有样品的有效迁移率高，使样品不再受离子界面的影响。

SDS－PAGE 是在电泳样品中加入含有SDS 和β-巯基乙醇的样品处理液的一种电泳方法。

SDS即十二烷基硫酸钠(CH3-(CH2)10-CH2OSO3- Na+)，是一种阴离子表面活性剂即去污剂，它可以断开分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质分子的二级和三级结构，强还原剂β-巯基乙醇可以断开半胱氨酸残基之间的二硫键，破坏蛋白质的四级结构。

SDS会与变性的多肽，并使蛋白带负电荷，由于多肽结合SDS的量几乎总是与多肽的分子量成正比而与其序列无关，因此SDS多肽复合物在丙稀酰胺凝胶电泳中的迁移率只与多肽的大小有关IEFE是一种利用具有PH梯度的支持介质分离等电点不同的蛋白质电泳技术。

其原理就是在电泳介质中放入载体两性电解质，当通以直流电时，两性电解质即形成一个由阳极到阴极逐步增加的PH 梯度，在此体系中，不同蛋白质即一定到货聚焦于其相当的等电点位置上，也就是说被聚焦于一个狭的区带中，电泳技术中的等电点聚焦也被称为聚焦电泳。

13、PAGE与SDS-PAGE原理上有何不同？聚丙烯酰胺凝胶电泳能有效地把不同类型的蛋白质分开的主要依据．是样品中各种物质的电荷和分子量的差异性。

SDS-PAGE分离原理的主要依据，则是各种物质分子量的差异性。

因为当SDS与蛋白质结合后，蛋内质分子即带有大量的负电荷．并远远超越其原来的电荷，从而使天然蛋白质分子间的电荷差别就降低乃至消除。

与此同时蛋白质在SDS的作用下结构变得松散，形状趋向—致。

多肽与SDS结合的量几乎总成正比而与其序列无关。

所以各种SDS蛋白质复合物在电泳时产生的泳动率差异，就反映出分子量的差异。

在此条件下，样品分子量的对数与其在凝胶中的迁移率呈直线关系。

14、用SDS-PAGE测定蛋白质分子量时为什么要用巯基乙醇强还原剂β-巯基乙醇可以断开半胱氨酸残基之间的二硫键，破坏蛋白质的四级结构。

使蛋白质分子被解聚成肽链形成单链分子。

巯基乙醇使蛋白二硫键还原,有利于蛋白质与SDS的结合,蛋白质—SDS复合物带上相同密度的负电荷，并可引起蛋白质构象改变，使蛋白质在凝胶中的迁移率，不再受蛋白质原的电荷和形状的影响，而取决于分子量的大小，因此聚丙烯酰胺凝胶电泳可以用于测定蛋白质的分子量。