基于p38MAPK表达的烟草毒理学评价

山西农业科学2018，46（3）：371-374基于p38MAPK 表达的烟草毒理学评价张璇1,魏克强1,杨进文2（1.山西大学生命科学学院，山西太原030006；2.山西农业大学农学院，山西太谷030801）摘要:利用2个基因型烟草卷制的单料烟Y-1和Y-2，分别对SD 大鼠进行60d 的烟雾暴露，构建出COPD 动物模型，分别于30，60d ，各处理组取右肺组织行H.E.染色、组织病理学评分，免疫组化法分析p38与p-p38的表达水平。

结果表明，与健康大鼠相比，烟熏大鼠肺组织呈现出典型的COPD 病理变化，p38的表达及其磷酸化水平均显著升高（P ＜0.05）；与Y-2组相比，Y-1组的p38表达与活化水平明显上调（P ＜0.05）。

COPD 大鼠肺组织p38的表达、激活与烟草的基因型密切相关，这可能是由于不同基因型烟草的化学成分存在较大差异，p38有可能作为烟草导致“特定机体损伤”毒理学效应的一个潜在标志物。

关键词:COPD ；p38MAPK ；病理评分；烟雾暴露中图分类号:S572文献标识码:A文章编号:1002-2481（2018）03-0371-04Tobacco Toxicological Evaluation Based on p38MAPK ExpressionZHANG Xuan 1，WEI Keqiang 1，YANG Jinwen 2（1.College of Life Science ，Shanxi University ，Taiyuan 030006，China ；2.College of Agronomy ，Shanxi Agricultural University ，Taigu 030801，China ）Abstract ：The COPD animal model was constructed by exposing SD rats to cigarette smoke,which was produced from two genotypes tobacco Y-1and Y-2,respectively.The right lung tissue was sampled at 30d and 60d,then histopathological score was analyzed with H.E.staining.The expression of p38and p-p38was detected with immunohistochemical method.The results showed that compared with control group,smoking rats showed typical COPD pathological changes in the lung tissue,and the expression of p38and phospho-p38was obviously increased （P ＜0.05）.Meanwhile,the expression and activation levels of p38in Y-1group were significantly higher than those in Y-2group （P ＜0.05）.These results indicated that the expression and activation of p38in COPD rats was closely related to tobacco genotypes,because there were large differences between their chemical components.The p38could be a potential biomarker in vivo evaluate the toxicological effect of tobacco.Key words ：COPD;p38MAPK;pathological score;cigarette smoke exposure收稿日期:2017-11-24基金项目:山西省回国留学人员科研资助项目（2017-013）；山西省重点研发计划（社会发展）项目（201603D321002）作者简介:张璇（1992-），女，山西太原人，在读硕士，研究方向：动物分子细胞生物学。

魏克强为通信作者。

烟草的化学成分直接影响卷烟制品的安全性和可用性，其形成与品种类型、栽培措施、生态环境等因素密切相关[1-3]。

研究表明，不同基因型烟草品种的化学成分存在较大差异；香烟烟雾气溶胶含有近5000种化学成分，其中,1/3直接来源于烟草本身，而2/3则是在香烟的燃烧、裂解、蒸馏、冷凝等一系列物理化学作用中新产生的[4]。

采用体外毒理学评价方法，即哺乳动物细胞系细胞毒性分析（中性红试验）、细菌诱变分析（Ames 试验）和细胞遗传学分析（微核试验），以及“特定机体损伤”即慢性阻塞性肺疾病（COPD ）的动物模型评价方法，山西大学生命科学学院实验室发现不同基因型烟草的毒理学效应差异显著[5-7]，这对培育低毒少害的烟草新品种具有一定的指导意义。

COPD 是一种以持续性气流受限为特征的慢性呼吸系统疾病，吸烟被认为是诱发COPD 最主要的危险因素[8-9]，其致病机制涉及免疫应答失衡、氧化/抗氧化失衡、蛋白酶/抗蛋白酶失衡、细胞增殖/凋亡失衡等，在疾病进程中多种炎症细胞、细胞因子及转录因子、信号通路发挥了重要作用[10-11]。

特别是，p38丝裂原活化蛋白激酶（p38MAPK ）参与了细胞应激、炎症反应、细胞凋亡等生理和病理过程，是多条信号途径的交汇点和共同通道，其表达的变化有可能作为评价烟草毒理学效应的潜在标志物[12-13]。

本研究以2个基因型的烟草品种为材料，采用单纯烟熏法构建出大鼠的COPD 模型，通过H.E.染371··山西农业科学2018年第46卷第3期色、组织病理学分析以及p38、磷酸化p38（p-p38）的免疫组化分析，评价了不同基因型烟草对大鼠肺组织的毒理学效应，旨在为揭示空气污染物暴露的毒理学机制、建立标准的香烟烟雾毒理学评价方法提供理论依据。

1材料和方法1.1试验材料1.1.1试验动物健康清洁级雄性SD大鼠24只（5周龄，体质量约185g），购自军事医学科学院实验动物中心。

试验前在恒温恒湿条件下暂养7d，自由饮水与进食。

2个基因型烟草品种，由山西农业大学烟草育种研究室提供，其烟叶由山西昆明烟草有限责任公司分别卷制成单料烟Y-1和Y-2。

1.1.2主要试剂与仪器兔抗大鼠p38，p-p38多克隆抗体，分别购自Proteintech Grope及爱必信（上海）生物科技有限公司；山羊抗兔IgG SABC免疫组化染色试剂盒，购自武汉博士德生物工程有限公司；浓缩型DAB试剂盒，购自北京中杉金桥生物技术有限公司；戊巴比妥钠、多聚甲醛、乙醇、二甲苯、伊红、苏木精等均为国产分析纯。

仪器主要有石蜡切片机（Leica RM2255，德国）；ZKPJ-1A展烤片机（天津天利航空机电有限公司）；光学显微镜（Olympus BX51，日本）；HHS-21-4型电热恒温水浴锅（上海博迅实业有限公司）等。

1.2试验方法1.2.1COPD模型构建及采样将大鼠随机分为3组：健康对照组（CK）、Y-1组、Y-2组，每组8只。

CK组大鼠仅吸入新鲜空气，Y-1，Y-2组大鼠置于染毒箱（60cm×80cm×100cm）内，分别以卷制的单料烟Y-1，Y-2进行60d的烟雾暴露染毒：每组同时点燃10支烟，通过气泵和导管装置将烟雾导入染毒箱，持续暴露染毒1h，每天2次，每次间隔4h，每周染毒6d。

分别于染毒30，60d后，每组随机取4只大鼠，腹腔注射1%戊巴比妥钠（3mL/kg）麻醉，解剖取右肺组织，用预冷的生理盐水冲洗干净，置于4%多聚甲醛中固定。

1.2.2肺组织H.E.染色及病理评分将固定的肺组织行常规石蜡包埋、切片（5滋m）、H.E.染色。

参考文献[14]的方法，每张切片随机选取5个视野于100倍光镜下观察肺组织的病理改变，并从7个方面进行评分：（1）气道腔阻塞；（2）气道上皮糜烂脱落；（3）气道上皮杯状化生；（4）气道上皮鳞状化生；（5）气道壁炎症细胞浸润；（6）气道壁纤维结缔组织增生；（7）气道壁平滑肌增生。

以上每项从无明显改变到严重改变分别用0～4分表示，各项评分合计为一个视野的病理评分。

1.2.3免疫组化法检测石蜡切片常规脱蜡，免疫组化三步法（SABC法）检测p38，p-p38的表达，DAB显色，苏木精复染。

每张切片中随机选取5个视野，使用Image-Pro Plus6.0软件读取每个视野下阳性物质表达区域的平均光密度值。

1.3数据处理应用SPSS17.0软件处理数据，所有计数资料以“均数±标准差（x±s）”表示；多组间比较采用单因素方差分析（One-Way ANOVA），P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2结果与分析2.1肺组织H.E.染色及病理学评分观察结果显示，CK组鲜见炎症细胞聚集，气道上皮完整，管腔内无黏液分布，管壁无增厚。

随烟雾暴露时间的延长，Y-1组和Y-2组呈现出不同程度的病理改变：暴露30d后，小气道周围出现少量聚集的炎症细胞，气道上皮轻微脱落，上皮细胞出现鳞状和杯状细胞化生，管腔内偶见黏液，气道壁结缔组织和平滑肌开始增生；烟熏60d后，Y-1组与Y-2组气道周围出现大量聚集的炎症细胞，气道上皮脱落严重，上皮细胞化生现象频繁，细胞排列不规则，黏膜皱襞增多、黏液分泌导致气道狭窄、堵塞，气道壁明显增厚，表现出COPD典型的病理特征。

病理学评分显示，与CK组相比，Y-1组与Y-2组的病理改变显著（P＜0.01）；与Y-2组相比，Y-1组的病理改变更为严重，但差异不显著（P＞0.05）。

这表明，不同基因型烟草释放的烟雾对COPD进程有不同程度的影响（图1）。

2.2肺组织p38及p-p38的表达免疫组化分析表明，在60d的疾病进程中，各处理组COPD大鼠肺组织的p38表达水平变化不显著（P＞0.05）；但与CK组相比，Y-1组、Y-2组的p38表达水平均显著升高，且Y-1组明显高于Y-2组（P＜0.05）。

随暴露时间的延长，Y-1组、Y-2组的p38磷酸化水平逐渐升高；与CK组相比，Y-1组的p-p38表达明显上调（P＜0.05）；在烟熏30d时，Y-1组p-p38的表达明显高于Y-2组（P＜0.05）。

表明香烟烟雾能够激活大鼠肺组织p38的表达及其磷酸化，且p38的表达与活化受不同基因型烟草释放烟雾的明显影响。