人3型腺病毒GZ13株的分离鉴定及六邻体蛋白的分子进化研究_张其威

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腺病毒分型诊断研究进展

腺病毒分型诊断研究进展
谭耀驹;谢菲
【期刊名称】《广东医学》
【年(卷),期】2008(029)001
【摘要】人腺病毒（human adenoviruses，HAdVs）共有51种血清型，根据
免疫学、生物化学等特性又可以分成6个亚型（A～F）。

腺病毒可以感染呼吸道、肠道、眼睛、膀胱以及肝脏，并造成流行病传播。

拥有正常免疫力的人感染腺病毒后一般会产生抗体，自行治愈；对于免疫力受到抑制的病患或者儿童来说，腺病毒感染可能是致命的。

在过去数年中，腺病毒作为一种基因载体被广泛应用于基因治疗中，而腺病毒感染会阻碍这种基因治疗的疗效。

【总页数】2页(P156-157)
【作者】谭耀驹;谢菲
【作者单位】广东省广州市胸科医院,510095;中山大学达安基因股份有限公司,广州,510060
【正文语种】中文
【中图分类】R3
【相关文献】
1.核酸扩增技术在人腺病毒诊断检测的研究进展 [J], 李文贵;俞乃胜
2.人腺病毒及其分型方法研究进展 [J], 陈晓飞;刘琪琦;周伟;张五星;李颖
3.原发性痛经中医证型诊断标准及其常见辨证分型的研究进展 [J], 杨莹莹;王天芳;
赵丽红;田禄;王燕平;汤玲;李宁;李昕;张文征
4.肾淀粉样变性病的病理诊断与分型、分级的研究进展 [J], 陈思羽;韩伟霞;王晨
5.儿童髓母细胞瘤分子病理学分型与诊断及预后的研究进展 [J], 高鑫义;邹有瑞;黄灵;马辉
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人3型腺病毒六邻体基底区重组蛋白的克隆表达和纯化

Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＯｂｊｅｃｔｉｖｅＴｏｃｌｏｎｅａｎｄｅｘｐｒｅｓｓｂａｓａｌｒｅｇｉｏｎｆｒａｇｍｅｎｔｏｆｈｅｘｏｎｐｒｏｔｅｉｎｆｒｏｍ
ＣＵＩＱｉ，ＤＯＮＧＴｕｏ，ＷＡＮＧＹｉｎｇ．ｃｈｅｎ，ＬＩＹｕ，ＱＩＢｉｎ－ｂｉｎ，ＶｌａｄｉｍｉｒＩ．Ｚｌｏｂｉｎ，Ｙｕｒｉ
Ｐ．Ｄｚｈｉｏｅｖ，ＯｌｅｇＮ．Ｒｅｖａ，ＱＵＺｈａｎｇ－ｙｉ（．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆ．ＨｙｇｉｅｎｉｃＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，ＰｕｂｌｉｃＨｅａｌｔｈＣｏｌｌｅｇｅ，ＨａｒｂｉｎＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅ￣ｉｔｙ，Ｈａｒｂｉｎ１５００８１，Ｃｈｉｎａ；２．ＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅｆｏｒＢｉｏｅｄｍｉｃａｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＩｒｋｕｔｓｋＳｔａｔｅＭｅｄｉｃａｌＵｎｗｅ￣ｉｔｙ，ｌｒｋｕｔｓｋ６６４００３，Ｒｕｓｓｉａ；３．ＤｅｐａｔｒｅｎｍｔｏｆＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ＢｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｃｉｓａｎｄＣｏｍｐｕ。ｔａｔｉｏａｌｎＢｉｏｌｏｇｙＵｎｉｔ。ＵｎｉｖｅｎｉｔｙｏｆＰｒｅｔｏｒｉａ，ＰｒｅｔｏｒｉａＤ０Ｄ２，Ｓｏｕｔｈ０）

211240638_一株鸭腺病毒3型的分离、鉴定及致病性分析

畜牧兽医学报 2023,54(5):2050-2061A c t a V e t e r i n a r i a e t Z o o t e c h n i c a S i n i c ad o i :10.11843/j.i s s n .0366-6964.2023.05.026开放科学(资源服务)标识码(O S I D ):一株鸭腺病毒3型的分离㊁鉴定及致病性分析曹秀芸1,刘吉文1,汤智辉1,郑紫怡1,闫丽萍1,2*,宋素泉1*(1.南京农业大学动物医学院动物健康与食品安全实验室,南京210000;2.南京农业大学免疫研究所,南京210000)摘要:从现地分离一株3型鸭腺病毒(d u c k a d e n o v i r u s 3,D A d V -3)并命名为D A d V -3Y N 株,分析该毒株的基因特征与致病特性,本研究选用L MH 细胞进行病毒分离与纯化,并对Y N 株的h e x o n ㊁p e n t o n b a s e ㊁f i b e r 1和f i b e r 2基因进行测序分析㊂通过腿部肌肉注射病毒感染7日龄番鸭,观察番鸭精神状态,记录体重变化㊁脏器剖检特征㊁组织病理学变化㊁计算脏器载毒量㊁泄殖腔拭子排毒量以及血清生化等数据,同时测定法氏囊与脾内凋亡相关基因转录水平以探究Y N 株对宿主免疫功能的影响㊂结果显示,番鸭感染Y N 株后体重增长受到显著抑制(P <0.01;P <0.0001);体内各脏器均出现不同程度病变,攻毒组鸭的肝组织与肾组织脏器系数均大于对照组且在攻毒后第7天差异极显著(P <0.01);攻毒组番鸭血清内丙氨酸氨基转移酶㊁天冬氨酸氨基转移酶和尿素氮含量均显著高于对照组(P <0.001,P <0.0001);同时,法氏囊与脾内细胞凋亡相关基因m R N A 水平显著上升(P <0.01;P <0.001)㊂以上结果提示,Y N 株感染7日龄番鸭后,可以导致肝和肾等脏器损伤,同时可以诱导法氏囊与脾内细胞凋亡从而影响番鸭免疫功能㊂关键词:鸭腺病毒3型;基因特征;致病力;免疫功能中图分类号:S 858.32 文献标志码:A 文章编号:0366-6964(2023)05-2050-12收稿日期:2022-05-18基金项目:禽腺病毒亚单位疫苗平台的构建及应用项目(J B G S 202103)作者简介:曹秀芸(1997-),女,浙江绍兴人,硕士生,主要从事病毒分离工作,E -m a i l :1677588114@q q.c o m *通信作者:闫丽萍,主要从事动物传染病学研究,E -m a i l :y a n l i p i n g @n j a u .e d u .c n ;宋素泉,主要从事临床兽医相关研究,E -m a i l :s u q u a n .s o n g@n ja u .e d u .c n I s o l a t i o n ,I d e n t i f i c a t i o n a n d P a t h o g e n i c i t y A n a l y s i s o f a D u c k A d e n o v i r u s T y pe 3C A O X i u y u n 1,L I U J i w e n 1,T A N G Z h i h u i 1,Z H E N G Z i y i 1,Y A N L i p i n g 1,2*,S O N G S u qu a n 1*(1.A n i m a l H e a l t h a n d F o o d S a f e t y L a b o r a t o r y ,C o l l e g e o f V e t e r i n a r y Me d i c i n e ,N a n j i n g A g r i c u l t u r a l U n i v e r s i t y ,N a n j i n g 210000,C h i n a ;2.N a n j i n g A g r i c u l t u r a l U n i v e r s i t y I n s t i t u t e of I mm u n o l og y ,N a n j i n g 210000,C h i n a )A b s t r a c t :T h e p u r p o s e o f t h i s s t u d y wa s t o i s o l a t e a n o v e l D u c k a d e n o v i r u s 3(D A d V -3)Y N s t r a i n a n d e l u c i d a t e i t s g e n e t i c c h a r a c t e r i s t i c s a n d p a t h o g e n i c i t y.L MH c e l l s w e r e s e l e c t e d f o r v i -r u s i s o l a t i o n a n d p u r i f i c a t i o n ,a n d t h e n t h e v i r u s g e n e s ,i n c l u d i n g h e x o n ,pe n t o n b a s e ,f i b e r 1,a n d f i b e r 2w e r e s e q u e n c e d a n d a n a l y z e d .S e v e n -d a y s -o l d M u s c o v y d u c k s w e r e i n f e c t e d b y i n t r a -m u s c u l a r i n j e c t i o n i n t h e l eg s ,a n d th e m e n t a l s t a t e o f t h e d u c k s w a s o b s e r v e d .B e si d e s ,t h e b o d yw e i g h t c h a n g e s ,n e c r o p s y c h a r a c t e r i s t i c s o f o r g a n s ,h i s t o p a t h o l o g i c a l c h a n ge s ,v i r a l l o a d of o r -g a n s ,c l o a c a s w a b d e t o x i f i c a t i o n ,a n d s e r u m b i o ch e mi s t r y w e r e r e c o r d e d a n d a n a l y z e d .F u r t h e r -m o r e ,t h e t r a n s c r i p t i o n l e v e l s o f a p o p t o s i s -r e l a t e d g e n e s i n t h e b u r s a a n d t h e s pl e e n w e r e m e a s -u r e d t o e x p l o r e t h e e f f e c t o f Y N s t r a i n o n i mm u n e f u n c t i o n .T h e r e s u l t s s h o w e d t h a t t h e w e i gh t g a i n o f i n f e c t e d d u c k s w a s s i g n i f i c a n t l y i n h i b i t e d (P <0.01,P <0.0001),a n d d i f f e r e n t d e gr e e s o f l e s i o n s a p p e a r e d i n v a r i o u s o r g a n s .T h e c o e f f i c i e n t s o f l i v e r s a n d k i d n e y s o f t h e e x pe r i m e n t a l5期曹秀芸等:一株鸭腺病毒3型的分离㊁鉴定及致病性分析g r o u p w e r e l a r g e r t h a n t h o s e o f t h e c o n t r o l g r o u p,a n d t h e d i f f e r e n c e w a s e x t r e m e l y s i g n i f i c a n t o n t h e7t h d a y a f t e r t h e c h a l l e n g e.A l a n i n e a m i n o t r a n s f e r a s e,a s p a r t a t e a m i n o t r a n s f e r a s e,a n d u r e a n i t r o g e n i n t h e s e r u m o f t h e M u s c o v y d u c k s i n t h e c h a l l e n g e g r o u p w e r e s i g n i f i c a n t l y h i g h e r t h a n t h o s e i n t h e c o n t r o l g r o u p(P<0.001,P<0.0001).A t t h e s a m e t i m e,t h e m R N A l e v e l s o f a p-o p t o s i s-r e l a t e d g e n e s i n t h e b u r s a a n d t h e s p l e e n i n c r e a s e d s i g n i f i c a n t l y(P<0.01,P<0.001).(C o n c l u s i o n)T h e a b o v e r e s u l t s s u g g e s t t h a t D A d V-3Y N s t r a i n c a n d a m a g e l i v e r s a n d k i d n e y s w h e n c h a l l e n g i n g t h e7-d a y s-o l d M u s c o v y d u c k s,s i m u l t a n e o u s l y,i t c a n a f f e c t t h e i mm u n e f u n c-t i o n o f M u s c o v y d u c k s b y c a u s i n g a p o p t o s i s o f c e l l s i n t h e b u r s a a n d t h e s p l e e n.K e y w o r d s:d u c k a d e n o v i r u s3;g e n e t i c c h a r a c t e r i s t i c s;p a t h o g e n i c i t y;i mm u n e f u n c t i o n*C o r r e s p o n d i n g a u t h o r s:Y A N L i p i n g,E-m a i l:y a n l i p i n g@n j a u.e d u.c n;S O N G S u q u a n,E-m a i l: s u q u a n.s o n g@n j a u.e d u.c n鸭腺病毒(d u c k a d e n o v i r u s,D A d V)被发现最早可以追溯到1977年法国番鸭场中爆发的一场大规模疾病之中,在疫病中被感染的番鸭体重下降,站立不稳,直到1982年,B o u q u e t等[1]通过中和试验,确认该病毒不同于之前所知的禽腺病毒属成员,是一种新型腺病毒㊂2011年,H a r r a c h等[2]提议将这种病毒命名为2型鸭腺病毒(d u c k a d e n o v i r u s2, D A d V-2),但是因为缺乏全株基因序列,该提议并没有被国际病毒委员会(T h e I n t e r n a t i o n a l C o m-m i t t e e o n T a x o n o m y o f V i r u s e s,I C T V)所采纳㊂2014年,奥地利科学家M a r e k等[3]成功获得D A d V-2全基因组序列㊂同年在我国广东,部分番鸭养殖场也出现了类似D A d V-2感染的症状,对所分离毒株进行全基因组测序发现,分离株不同于先前的D A d V-2G R株,被认为是3型鸭腺病毒(d u c k a d e n o v i r u s3,D A d V-3)的候选毒株[4-5]㊂根据I C-T V最新分类,D A d V-2和D A d V-3均属于禽腺病毒属成员㊂目前,国内多地流行的鸭腺病毒仍以D A d V-3为主[6],被感染番鸭主要表现为肝㊁肾肿胀出血和轻微心包积液㊂发病率在40%~55%之间,死亡率可达35%~43%,给各地养殖场带来极大的经济损失[6]㊂2021年7月,云南某番鸭养殖场内7日龄雏鸭纷纷发病,呈现典型D A d V-3的感染症状,本实验室在此批病料中分离获得1株D A d V-3,命名为D A d V-3Y N株㊂本研究拟通过分析毒株的4段主要结构蛋白基因,并感染7日龄番鸭观察分析其临床症状㊁脏器变化㊁脏器载毒量以及法氏囊内细胞凋亡相关基因转录水平,对D A d V-3的遗传特性和致病特征做出全面系统描述,以期为临床对D A d V-3的科学防控提供理论支持㊂1材料与方法1.1试剂材料T r e l i e f T M A n i m a l G e n o m i c D N A K i t购自擎科生物有限公司,2ˑH i e f f P C R M a s t e r M i x㊁H i f a i r Ⅱ1s t S t r a n d c D N A S y n t h e s i s K i t㊁H i e f f U N I C O N q P C R S Y B R G r e e n M a s t e r M i x购自翌胜生物, R N A i s o l a t e r T o t a l R N A E x t r a c t i o n R e a g e n t购自诺唯赞生物公司;D L600D N A M a r k e r㊁D L2000 D N A M a r k e r㊁p M D T M18-T V e c t o r C l o n i n g K i t购自T a k a R a宝日医生物公司㊂1.2样品处理与病原检测2021年7月,云南某番鸭养殖场内7日龄番鸭广泛发病,主要临床病变为肝肾肿胀出血㊂无菌采集番鸭肝组织冷藏运送至实验室进行检测㊂取适量肝组织置于E P管内,充分研磨后取组织悬液上清,按照说明书提取组织D N A和R N A㊂使用常见鸭源病毒引物进行检测,P C R阳性产物连接T载体后送往擎科生物有限公司进行测序验证,每样质粒送3份样品㊂1.3病毒扩增与纯化选取雄性莱昂鸡肝癌(L e g h o r n m a l e h e p a t o-m a,L MH)细胞按照文献中内容进行病毒扩增,当80%以上细胞出现病变后收取培养上清[7]㊂采取有限稀释法进行病毒纯化,3轮有限稀释法后用P C R 方法检测无外源病毒,随后使用蚀斑试验进一步纯化病毒株㊂1.4病毒T C I D50测定L MH细胞接种于96孔板,根据文献中方法接毒[8-9],采用R e e d-M u e n c h两氏法计算T C I D50为107.8㊃m L-1㊂收集细胞培养上清用于后续试验㊂1502畜牧兽医学报54卷1.5Y N株主要结构蛋白基因序列分析参照N C B I上已有D A d V-3G D MM10株(MH777398)的h e x o n㊁p e n t o n b a s e㊁f i b e r1和f i-b e r2基因序列,设计5对引物进行序列扩增,引物由擎科生物有限公司合成,相关信息见下表㊂按照各自退火温度进行P C R扩增,在1%琼脂糖凝胶上电泳,切下明亮条带连接T载体后送往擎科生物有限公司进行测序㊂所得测序结果使用D N AMA N 软件进行序列拼接并使用M E G A7进行序列比对分析㊂表1测序引物信息表T a b l e1T h e i n f o r m a t i o n o f s e q u e n c i n g p r i m e r s引物名称P r i m e r n a m e 引物序列(5'ң3')S e q u e n c e(5'ң3')片段长度/b pP r o d u c t l e n g t h退火温度/ħA n n e a l i n g T e m p e r a t u r eD-h e x o n-A F:A T C G C G T A G A C G A A T GR:T G G C A G G T A A T C A G C A 140660D-h e x o n-B F:T A A T A T C C C G G C T T C T AR:G C T G A C T G T C G G T G G T T 156460D-p e n t o n F:T A G C C A A T A A C T T A C C G CR:A T C C T A G A G C A C G A C C T T 168162D-f i b e r1F:A A G G C A G G A T T C A G A G GR:C A G A A C G G A T A T G T T A G G T C 151357D-f i b e r2F:C G T A C C T A G C G A A G A T T GR:T G C C A T G C G A G T A C A T T 160053F.上游引物序列;R.下游引物序列㊂下同F.F o r w a r d p r i m e r s e q u e n c e.R.R e v e r s e p r i m e r s e q u e n c e.T h e s a m e a s b e l o w1.6D A d V-3Y N株动物致病性试验1.6.1试验动物分组与攻毒设计1日龄番鸭(购自南京特给力种植有限公司)适应性饲养至7日龄,随机分为攻毒组与对照组㊂对照组包含12只番鸭,攻毒组分为观察组与剖检组,每组各10只㊂攻毒组番鸭腿部肌肉注射0.3m L病毒液(3ˑ106.8㊃m L-1 T C I D50),对照组相同部位注射0.3m L P B S㊂攻毒组与对照组番鸭在不同房间饲养,并由不同人员管理,其余条件相同,连续观察14d,记录观察组番鸭临床变化,攻毒后每间隔2d称量番鸭体重并采集泄殖腔拭子㊂剖检组与对照组番鸭在攻毒后第3与第7天随机剖检3只㊂攻毒后14d安乐死剩余攻毒组与对照组番鸭并进行剖检㊂1.6.2剖检观察与切片制作番鸭静脉采血后处死㊂对番鸭进行解剖,观察有无脏器病变㊂称取心㊁肝㊁肾重量并计算脏器系数,脏器系数的计算公式为:脏器重量(g)/体重(g)*100%㊂采集脏器保存于-80ħ冰箱准备后续检测病毒,固定攻毒后第7天番鸭相应脏器,送往武汉皮诺飞生物公司制作切片㊂1.6.3血清生化检测攻毒后第3㊁7和14天分别采集攻毒组与对照组血清,使用南京建成生物工程研究所检测试剂盒检测番鸭血清内丙氨酸氨基转移酶(a l a n i n e a m i n o t r a n s f e r a s e,A L T)㊁天冬氨酸氨基转移酶(a s p a r t a t e a m i n o t r a n s f e r a s e,A S T)和尿素氮(u r e a n i t r o g e n,B U N)三种酶含量,每个样本重复检测3次㊂参照说明书计算分析酶活性㊂1.6.4番鸭排毒量与脏器病毒载量测定攻毒后第3㊁7和14天分别采集攻毒组与对照组番鸭脏器,攻毒后每隔2d采集泄殖腔拭子㊂依照说明书步骤提取病毒D N A㊂以D A d V-3Y N株h e x o n基因序列为模板,使用P r i m e r5软件设计引物,引物信息见表2,引物由擎科生物有限公司合成㊂以实验室所构建T-h e x o n质粒为阳性模板,按照文献方法[10],10倍比稀释制作荧光定量标准曲线㊂q P C R检测脏器与泄殖腔拭子所含病毒,将攻毒组C t值数据带入标准曲线公式内计算拷贝数㊂每个样品重复3次㊂根据10c o p i e s病毒量为界限, 3个重复孔C t值大于35的判定为阴性,反之则判断为阳性㊂1.6.5法氏囊与脾凋亡基因m R N A转录水平测定 T R I z o l法提取法氏囊和脾总R N A并反转录成c D N A,S Y B R G r e e n q P C R进行检测,所得数据基于2-әәC t的方式进行计算,获得促凋亡基因25025期曹秀芸等:一株鸭腺病毒3型的分离㊁鉴定及致病性分析B a x,B a k-1,c a s p a s e-3和c a s p a s e-9以及抑凋亡基因B c l-2的转录水平㊂引物参考现有文献内序列,相关信息见表3,由擎科生物有限公司合成㊂表2D A d V-3病毒定量P C R引物信息T a b l e2P r i m e r i n f o r m a t i o n o f q u a n t i t a t i v e P C R d e t e c t i o n f o r D A d V-3引物名称P r i m e r n a m e 引物序列(5'ң3')S e q u e n c e(5'ң3')片段长度/b pP r o d u c t l e n g t hD A d V-3-F G T C T G C T C A G G T A C G C T T A A T T CD A d V-3-R T C T A C T G C C T G A T T C C A T A G T G C149表3引物信息表T a b l e3P r i m e r i n f o r m a t i o n引物名称P r i m e r n a m e 引物序列(5'ң3')S e q u e n c e(5'ң3')片段长度/b pP r o d u c t l e n g t hB a x[11]F:A A AC C A A G C G G C T C A G C G A G TR:G G C C C C A G T T G A A G G C T C C G T C C 162B a k-1[12]F:G G T G A GC C A G C G T T A G A A A GR:G C T C C T G T C A C C A T G T T C C T 135B c l-2[12]F:G G A G G GC T G A A A G A A A A A GR:T A T G A T G C G G C A C G A C T G 213c a s p a s e-3[12]F:C G G A C T G T C A T C T C G T T C A G G C A CR:G T C C T T C A T C G C C A T G G C T T A G C 200c a s p a s e-9[11]F:A T C C T G T C C C A C G G C T G T C AR:T C G G G T G A A T C G C A A T C C A C T 212β-a c t i n[12]F:A T G T C G C C C T G G A T T T C GR:C A C A G G A C T C C A T A C C C A A G A A1651.7数据分析本研究中使用G r a p h P a d P r i s m整理试验数据并绘图,数据均表示为平均值ʃ标准误差(m e a nʃS E M) ,通过双因素方差分析(T w o-w a y A N O V A)对不同组数据之间的差异性进行统计学检验㊂*Pɤ0.05被认为具有显著性差异㊂2结果2.1病毒的分离番鸭样品经过检测发现禽流感病毒㊁减蛋综合征病毒㊁4型禽腺病毒等常见病原均为阴性,但D A d V-3呈强阳性,同时伴随着鸭瘟病毒(d u c k e n-t e r i t i s v i r u s,D E V)和番鸭细小病毒(M u s c o v y d u c k p a r v o v i r u s,M D P V)感染㊂P C R产物经过测序比对确认无误㊂选择L MH细胞进行病毒分离,病毒接种于L MH细胞24h后,细胞出现典型的细胞病变(图1A):细胞皱缩呈现葡萄串状,大量死细胞脱落漂浮于培养上清中,与腺病毒接毒后病变相似[13]㊂病毒在细胞上多次传代均可见一致的细胞病变㊂收取细胞培养上清,P C R结果显示培养上清中可扩增得到633b p的特异性条带(图1B)㊂2.2Y N株基因进化分析鸭腺病毒主要依据h e x o n与f i b e r等基因序列的同源性进行种属分类[6,14]㊂序列比对结果显示(图2),Y N株h e x o n,p e n t o n b a s e和f i b e r1基因与D A d V-3G D MM10株以及C H-G D-12-2014株高度同源(100%);f i b e r2在第1338个碱基处存在突变,由腺嘌呤(A)突变为胞嘧啶(C),翻译的氨基酸由异亮氨酸变为谷氨酰胺,与G D MM10等毒株相同源性99.93%㊂与禽腺病毒的一些血清型相比,Y N 株与G o o s e a d e n o v i r u s-4同源性更高,相比之下禽腺病毒虽然也能感染鸭,但与Y N株同源性相对较低㊂3502畜牧兽医学报54卷A.接毒后L MH 细胞产生病变;B .D A d V -3P C R 后电泳结果:M.D L 2000D N A M a r k e r ;1.阳性对照;2.细胞培养上清;3.阴性对照A.C y t o p a t h i c e f f e c t (C P E )w a s p r o d u c e d i n L MH c e l l s p o s t -i n f e c t i o n o f t h e v i r a l i s o l a t e ;B .E l e c t r o ph o r e s i s r e s u l t s o f D A d V -3a f t e r P C R :M.D L 2000D N A M a r k e r ;1.P o s i t i v e ;2.C e l l c u l t u r e s u p e r n a t a n t ;3.N e ga t i v e c o n t r o l 图1 Y N 株接毒后细胞病变与P C R 检测F i g .1 C y t o pa t h i c e f f e c t d e t e c t e d i n L M H c e l l a n d P C R d e t e c t i o n o f Y N s t r a in A.h e x o n 基因进化树;B .p e n t o n b a s e 基因进化树;C .f i b e r 1基因进化树;D.f i b e r 2基因进化树㊂方框内为本研究中Y N 株A.G e n e t i c e v o l u t i o n a r y t r e e o f h e x o n g e n e ;B .G e n e t i c e v o l u t i o n a r y t r e e o f p e n t o n b a s e g e n e ;C .G e n e t i c e v o l u t i o n a r y tr e e o f f i b e r 1g e n e ;D.G e n e t i c e v o l u t i o n a r y t r e e o f f i b e r 2g e n e .T h e Y N s t r a i n w a s s h o w e d b y a bo x 图2 D A d V -3Y N 株基因进化树F i g .2 G e n e t i c e v o l u t i o n a r yt r e e o f D A d V -3Y N s t r a i n 2.3 攻毒后番鸭临床症状7日龄番鸭攻毒后出现精神沉郁,蹲卧好静等情况,未见死亡病例㊂对照组番鸭精神状态良好,生长发育正常㊂每隔2d 对番鸭进行称重(图3),结果显示,攻毒组番鸭体重在第7与第9天显著低于对照组(P <0.0001),攻毒后第11天攻毒组仍显著低于对照组(P <0.05)㊂直至攻毒后第13天,两组番鸭体重差异不显著㊂结果表明,7日龄番鸭攻毒后体重增长受到一定抑制㊂2.4 攻毒后番鸭脏器病变2.4.1 脏器解剖学病变雏鸭通过腿部肌肉注射感染病毒后,在感染后第3㊁7和第14天进行剖检,发现攻毒组番鸭出现轻微心包积液(图4A ),心表观未见明显变化㊂在第3㊁7天肝组织略显肿大并45025期曹秀芸等:一株鸭腺病毒3型的分离㊁鉴定及致病性分析*.P <0.05;**.P <0.01;***.P <0.001;****.P <0.0001,下同*.P <0.05;**.P <0.01;***.P <0.001;****.P <0.0001.T h e s a m e a s b e l o w图3 攻毒后番鸭体重(n =5)F i g .3 B o d y w e i g h t o f M u s c o v y du c k s a f t e r i n f e c t i o n (n =5)存在出血点,第14天肝充血肿胀,边缘略显钝圆,存在明显出血点(图4B )㊂此外,攻毒组番鸭肾组织存在不同程度的肿胀,颜色加深(图4C )㊂脾淤血肿胀,边缘钝圆,颜色暗红(图4D )㊂2.4.2 脏器组织病理学变化固定脏器相应部位后制作切片,显微镜观察未发现心肌细胞出现明显变化㊂攻毒组番鸭肝细胞变性,染色不均,肝细胞排列混乱,肝索结构消失㊂脾淤血,大量红细胞分布于脾细胞间㊂攻毒后番鸭肾组织内肾小球萎缩,与小囊间间隙增大且肾小囊内血细胞增多,肾小管上皮细胞变性㊁肿大突入管腔内导致管腔狭窄,小管结构不清(图5)㊂A.番鸭出现心包积液;B .番鸭肝组织病变;C .攻毒后番鸭肾组织病变;D.番鸭脾组织病变㊂心包内积液由黑色箭头指出,肝组织出血点由白色箭头指出㊂d pi 表示攻毒后天数A.P e r i c a r d i a l e f f u s i o n a f t e r i n f e c t i o n ;B .P a t h o l o g i c a l c h a n g e s o f l i v e r s ;C .P a t h o l o g i c a l c h a n g e s o f k i d n e y s ;D.P a t h o l o gi -c a l c h a n g e s o f s p l e e n s .P e r i c a r d i a l e f f u s i o n w a s s h o w e d b y b l a c k a r r o w s a n d b l e e d i n g p o i n t i n l i v e r s w a s s h o w e d b y w h i t e a r -r o w s .d p i m e a n s d a ys p o s t i n f e c t i o n 图4 攻毒后番鸭脏器病变F i g .4 O r g a n s p a t h o l o g i c a l c h a n g e s o f M u s c o v y du c k s a f t e r i n f e c t i o n 2.4.3 脏器系数变化通过计算脏器系数,发现攻毒组与对照组番鸭心脏系数无明显差异,攻毒组番鸭的肝脏与肾脏系数在攻毒后均大于对照组,在攻毒后第7天存在显著差异(图6A ,P <0.01),提示攻毒后肝㊁肾存在一定肿胀㊂2.4.4 血清生化指标变化检测血清A L T ,A S T 以及B U N 三种酶的含量㊂结果显示,血清内B U N 含量在攻毒后第3㊁7㊁14天都显著高于对照组(P <0.001)㊂A L T 在攻毒后第3㊁7与14天差异极显著(P <0.01,P <0.001)㊂攻毒组血清A S T5502畜牧兽医学报54卷图5 不同脏器病理切片(400ˑ)F i g .5 P a t h o l o g i c a l s e c t i o n o f d i f f e r e n t o r ga n s (400ˑ)A.心脏系数;B .肝脏系数;C .肾脏系数;D.血清B U N 含量;E .血清A L T 含量;F .血清A S T 含量A.C a r d i a c c o e f f i c i e n t ;B .L i v e r c o e f f i c i e n t ;C .K i d n e y co e f f i c i e n t ;D.L e v e l o f B U N ;E .L e v e l o f A L T ;F .L e v e l o f A S T 图6 脏器系数与血清生化指标(n =3)F i g .6 O r ga n c o e f f i c i e n t a n d s e r u mb i oc h e m i c a l i nde x (n =3)含量在攻毒后第3天(P <0.01),第7天(P <0.001)和第14天(P <0.01)与对照组相比差异极显著(图6B )㊂结果提示攻毒后番鸭肝与肾均存在一定损伤㊂2.5 攻毒后番鸭排毒量与脏器载毒量使用荧光定量P C R 对所采集泄殖腔拭子以及不同组织脏器进行检测,结果显示,攻毒后番鸭排毒量持续在102~103c o pi e s ㊃m L -1,攻毒后第1天排毒量最高,直至试验结束仍可向环境中持续排毒(图7A )㊂攻毒后番鸭肝与心载毒量较高,在攻毒后第7和14天分别达105和104c o p i e s ㊃g -1,攻毒后第7与14天,肝载毒量逐渐升高,与其他脏器差异显著(P <0.01,P <0.001,P <0.0001)㊂攻毒后脾脏载毒量较其他脏器略低,约103~104c o p i e s ㊃g -1㊂试验过程中对照组番鸭的泄殖腔拭子与脏器载毒量检测均呈阴性㊂2.6 法氏囊与脾凋亡相关基因转录水平由结果可知(图8㊁9),攻毒后番鸭法氏囊与脾65027502 5期曹秀芸等:一株鸭腺病毒3型的分离㊁鉴定及致病性分析A.攻毒后试验组番鸭泄殖腔排毒情况;B.攻毒后3d脏器载毒量;C:攻毒后7d脏器载毒量;D.攻毒后14d脏器载毒量㊂数据分析采用双因素方差分析(n=3)㊂相同字母表示两组数据无显著差异,不同字母表示两组数据存在显著差异,肝与其他脏器差异性用*表示A.E x p e l l i n g o f t o x i n i n c l o a c a o f e x p e r i m e n t d u c k s a f t e r i n f e c t i o n;B.O r g a n v i r u s l o a d i n3d a y s p o s t-c h a l l e n g e;C.O r g a n v i r u s l o a d i n7d a y s p o s t-c h a l l e n g e;D.O r g a n v i r u s l o a d i n14d a y s p o s t-c h a l l e n g e.D a t a w e r e a n a l y z e d u s i n g t w o-w a y A N O-V A(n=3).T h e s a m e l e t t e r i n d i c a t e s n o s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e b e t w e e n t h e t w o g r o u p s a n d t h e d i f f e r e n t l e t t e r s i n d i c a t e s i g-n i f i c a n t d i f f e r e n c e s b e t w e e n t h e t w o g r o u p s o f d a t a,t h e d i f f e r e n c e b e t w e e n t h e l i v e r a n d o t h e r o r g a n s i s i n d i c a t e d b y*图7攻毒后试验组番鸭泄殖腔排毒量与脏器组织病毒载量F i g.7V i r a l l o a d o f c l o a c a l s w a b a n d v i s c e r a i n e x p e r i m e n t d u c k s a f t e r i n f e c t i o n图8法氏囊凋亡相关基因转录水平(n=3)F i g.8T r a n s c r i p t i o n l e v e l o f a p o p t o s i s-r e l a t e d g e n e s i n b u r s a(n=3)畜牧兽医学报54卷图9 脾凋亡相关基因转录水平(n =3)F i g .9 T r a n s c r i p t i o n l e v e l o f a p o p t o s i s -r e l a t e d g e n e s i n s pl e e n (n =3)促凋亡基因转录水平出现不同程度升高㊂攻毒组番鸭在攻毒后第7天法氏囊内4种促凋亡基因B a x ㊁B a k -1㊁c a s p a s e -3和c a s pa s e -9转录水平显著高于对照组(P <0.0001),攻毒后第14天B a x (P <0.01)㊁B c l -2(P <0.001)㊁c a s pa s e -3(P <0.0001)和c a s pa s e -9(P <0.0001)也显著高于对照组㊂抑凋亡基因B c l -2则在攻毒后第7天(P <0.0001)和第14天(P <0.01)显著下降,B c l -2/B a x 比值也在攻毒后显著下降(P <0.001,P <0.0001)㊂结果表明攻毒后番鸭法氏囊内细胞凋亡水平上升㊂攻毒后第7天番鸭脾内凋亡相关基因转录水平均显著高于对照组(P <0.0001),抑凋亡基因转录水平显著下降(P <0.01,P <0.0001);攻毒后第14天B a x (P <0.01)㊁B a k -1(P <0.001)和c a s p a s e -3㊁c a s pa s e -9(P <0.0001)也显著升高㊂B c l -2/B a x 比值也在攻毒后第7与14天显著下降,以上数据提示攻毒后番鸭脾内细胞凋亡水平上升㊂3 讨论2014年从广东番鸭体内分离到第一株D A d V -3后[15],国内报告D A d V -3临床感染的情况越来越多㊂2018年,S h i 等[14]自福建㊁浙江㊁安徽和广东分离得到4株鸭腺病毒㊂2016 2019年间,S h i 等[6]分离得到7株D A d V -3,全基因组测序发现O R F 67存在缺失,可能是新的突变株㊂2018 2020年间,广东㊁福建与广西三省番鸭养殖场发生多起D A d V -3感染病例,Y i n 等[16]从病料中分离获得12株D A d V -3㊂本实验室从来自云南的病料中分离得到1株D A d V -3Y N 株,序列比对后发现该毒株与目前在国内流行的C H -G D -12-2014株以及G D MM 10株等相应片段相似度为99.93%~100%㊂不同于现有突变株存在的O R F 67截断突变,Y N 株f i b e r 2蛋白长短未改变,也未见对盲肠存在明显致病效果[6]㊂目前对禽腺病毒的研究发现,毒株的致病能力强弱主要由h e x o n ,f i b e r 2蛋白决定[17-18],有研究表明,f i -b e r 2作为保护性抗原可针对病原感染提供免疫保护[19-20],也有学者认为,f i b e r 1在病毒侵染宿主过程中起到主要作用[21]㊂因此,研究4段主要结构蛋白的基因序列对预测分离株的毒力有一定的指导意义㊂之前的研究报道中,鸭腺病毒可以抑制受感染番鸭的生长发育[1,4],同属的禽腺病毒也存在相同的抑制作用[22]㊂本研究中感染番鸭精神状态不佳,体重增长受到显著抑制,与之前研究相一致㊂对攻毒后番鸭脏器进行检测发现各脏器均存在病毒扩增,在肝组织中拷贝量最高㊂番鸭感染D A d V -3后可向环境中持续排毒,这可能对同群番鸭造成感染风险㊂这也与之前对禽腺病毒的研究相符合:禽腺病毒可以通过口-粪传播途径造成水平传播[23]㊂85025期曹秀芸等:一株鸭腺病毒3型的分离㊁鉴定及致病性分析剖检结果显示,番鸭感染Y N株后肝㊁肾等脏器均出现一定病变,与之前C H-G D-12-2014株感染后病变相似[4]㊂相应脏器固定后切片染色,可观察到相对应的组织学病变,同之前S h i等[6]与Y i n等[16]所观察的D A d V-3导致的组织病理学变化相似㊂A L T㊁A S T和B U N分别在肝与肾细胞受到损伤时逸出到血液中[24],因此,本研究攻毒组番鸭血清A L T㊁A S T和B U N含量升高也从侧面证明了番鸭的肝与肾受损㊂B a x与B a k-1作为同一促凋亡家族蛋白,两者之间可形成二聚体激活c a s p a s e[11,25];c a s p a s e-9为凋亡初始阶段发生作用蛋白,c a s p a s e-3则为凋亡的执行者 ,一旦被激活则使细胞发生不可逆的凋亡[26]㊂本研究中,攻毒组番鸭在感染后法氏囊与脾内B a x等促凋亡基因的表达量均显著上升,B c l-2/ B a x则在攻毒后显著降低,提示法氏囊与脾功能可能受到损害㊂法氏囊是禽类主要免疫器官,在体液免疫中起到重要作用,与宿主抵抗病毒时抗体水平息息相关[27]㊂一些疾病如传染性法氏囊损伤法氏囊后,宿主的免疫功能受到影响[28]㊂研究发现,当传染性法氏囊与禽腺病毒共同感染鸡时,可以导致宿主免疫反应降低以及死亡率增加[29]㊂脾是全身免疫的重要器官,与禽类的先天性免疫息息相关[30],在病毒侵入机体时积极响应[31]㊂已有研究发现,当一些病原感染机体后通过使脾坏死从而削弱宿主的免疫能力[32]㊂本研究中番鸭中枢免疫与外周免疫器官均受到一定影响,势必会增加其他病原的共感染风险㊂流行病学调查发现禽类养殖场内常存在腺病毒与其他病原混合感染的情况[33-35],亦有报道称D A d V-3与其他病原混合感染后可能会导致D A d V-3临床症状加剧[14,16]㊂本研究检测发现,D A d V-3Y N株存在与D E V㊁M D P V混合感染的情况,番鸭免疫机能受到影响,可能导致养殖场内番鸭在混合感染的情况下D A d V-3的临床症状加剧或者其他病原在番鸭体内致病能力增强,这也从侧面解释了实验室感染D A d V-3Y N株后致病能力弱于当地番鸭的临床感染㊂4结论本研究自云南番鸭养殖场分离得到1株鸭腺病毒,通过对分离株的主要基因序列进行分析证实该病毒为D A d V-3㊂致病性试验证实该病毒以较为温和的方式在番鸭群体中流行,感染番鸭后影响其生长性能,损害多个脏器,且导致番鸭持续向环境中排毒,还可以影响番鸭的免疫功能㊂因此,本研究对D A d V-3的分离鉴定和早期防控都具有重要意义㊂参考文献(R e f e r e n c e s):[1] B O U Q U E T J F,MO R E A U Y,M C F E R R A N J B,e ta l.I s o l 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携带可调控人胰岛素基因的腺病毒载体的构建和鉴定

携带可调控人胰岛素基因的腺病毒载体的构建和鉴定徐美东;张轶群;沈坤堂;姚礼庆;秦新裕【期刊名称】《中国临床医学》【年(卷),期】2006(013)002【摘要】目的:构建携带葡萄糖依赖性促胰岛素多肽(GIP)启动子控制下的人胰岛素基因的腺病毒载体.方法:将GIP-hIns基因自pCDNA3-GIP-hIns质粒中酶切下来,克隆至切除CMV启动子的pCA13-△CMV质粒中,形成转移质粒pCA13-GIP-hIns,然后与质粒pBHGE3共转染至293细胞株,在其中同源重组形成腺病毒颗粒.采用PCR方法对重组体进行鉴定,同时测定病毒滴度.体外转染STC-1细胞,并采用RT-PCR检测感染腺病毒的细胞内有无hIns mRNA的转录.结果:由pCA13-GIP-hIns和pBHGE3共转染至293细胞后,可得到阳性重组体Ad.GIP-hIns,经PCR检测表明已含有GIP-hIns基因.纯化所得腺病毒滴度约为1×1011pfu/ml.RT-PCR 证实在感染重组体腺病毒Ad.GIP-hIns的细胞中有相应mRNA的转录.结论:成功构建了携带GIP启动子控制下的人胰岛素基因的腺病毒载体,为进一步胰岛素基因治疗糖尿病的实验研究奠定了基础.【总页数】3页(P246-248)【作者】徐美东;张轶群;沈坤堂;姚礼庆;秦新裕【作者单位】复旦大学附属中山医院普外科,上海,200032;复旦大学附属中山医院普外科,上海,200032;复旦大学附属中山医院普外科,上海,200032;复旦大学附属中山医院普外科,上海,200032;复旦大学附属中山医院普外科,上海,200032【正文语种】中文【中图分类】Q782【相关文献】1.人端粒酶逆转录酶启动子调控的携带胞嘧啶脱氨酶基因腺病毒载体的构建 [J], 黄淑华;彭芝兰;王和2.携带人白细胞介素10和肝细胞生长因子双基因的重组腺病毒载体构建与鉴定[J], 邱红;朱月蓉;邢继成;江淑芳;苏长青;曹祥荣;方琳3.携带Egr-1基因调控序列的TK基因的腺病毒载体的构建 [J], 刘金龙;郭仕英;刘训良;李朝军;杜青;郭治源;夏建国4.携带人血管内皮生长因子165基因的复制缺陷型腺病毒载体的构建和鉴定 [J], 周炜;冯进波;王旭平;刘春喜;姜虹;王荣;丁士芳5.携带KGF基因重组腺病毒载体的构建与鉴定 [J], 贾庆华;哈小琴;吕同德;刘春杰因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

人3型腺病毒GZ13株的分离鉴定及六邻体蛋白的分子进化研究

ｑｅｃｄｆｒｃｎｉｔｏ．ＴｅｈｘｎｐｏｅｎｗｓａｓｏａｅｔｈｔｅｕｎｅｏｏｆｍａｉｎｒｈｅｏｒｔｉａｏｃｍｐｒｄｗｉｔｅｏｈｒＨＡｄ～３ｔｒｄｃｔｌｃｌｒｅｏｕｌｈＶｏｐｅｉｔｉｍｏｅｕａｖｌ — ｓ
进化趋势。方法
分离鉴定１引起儿童急性支气管肺炎的腺病毒及分析其主要中和抗原六邻体蛋白的分子株
采用荧光定量ＰＲ方法，１引起严重支气管肺炎的惠儿咽拭子进行检测，Ｃ对例并从中分离得到
ｌ株腺病毒（名为Ｇ１）命Ｚ３。利用型特异性引物ＰＲ进行初步亚型鉴定；Ｃ克隆该株腺病毒完整的六邻体蛋白基因，测序和序列比对，确定其型别；同时与Ｇｎａｋ上人３型腺病毒的六邻体蛋白进行同源性比对，ｅＢｎ分析预测六邻体蛋白的分子进化趋势。结果该临床标本经荧光定量ＰＲ鉴定为腺病毒强阳性，Ｃ型特异性引物ＰＲ初步鉴定Ｃ引起该例儿童急性支气管肺炎的病原体为人３型腺病毒，目为３型；完整六邻体基因比对最终确定为人３型腺病毒；Ｚ３株与我们先前分离的Ｇ０、Ｚ２株及台湾地区分Ｇ１ＺｌＧ０离株核苷酸及氨基酸的同源性均大于９％。结论９前在广州以及台湾地区流行的３型腺病毒仍属同一流行株，其主要中和性抗原六邻体蛋白未出现明显变异，这对今后开发研究人３型腺病毒疫苗及药物具有重要指导意义。

2004年广州地区流行的3型腺病毒六邻体基因序列分析

2004年广州地区流行的3型腺病毒六邻体基因序列分析朱冰;钟家禹;苏晓波;周荣;龚四堂;曾其毅【期刊名称】《中国儿童保健杂志》【年(卷),期】2006(14)3【摘要】[目的]分析2004年夏广州市某幼儿园流行的3型腺病毒(adenovirus type 3,Ad3)的六邻体基因序列,为 Ad3的基础及临床研究提供依据。

[方法]采集急性咽结膜炎患儿急性期的眼、咽拭子,提取腺病毒DNA,分两段进行 PCR,扩增腺病毒六邻体基因,将扩增的片断进行T-载体克隆及序列分析。

[结果]成功地测出了Ad3六邻体基因序列,并在Genebank登记注册,注册号AY878716,与Genebank 中Ad3六邻体基因序列进行同源性比较,同源性为99％。

[结论]腺病毒(Ad3)六邻体基因序列,并与(Genebank中Ad3六邻体基因序列变异是否与其毒力的改变和致病性、传染性相关,尚需作进一步的研究探索。

【总页数】2页(P278-279)【关键词】3型腺病毒;六邻体;基因【作者】朱冰;钟家禹;苏晓波;周荣;龚四堂;曾其毅【作者单位】广州市儿童医院中心实验室【正文语种】中文【中图分类】R175【相关文献】1.北京地区2006年流行的3、7和11型腺病毒部分六邻体基因序列分析 [J], 邓洁;钱渊;赵林清;朱汝南;王芳;孙宇2.7型腺病毒疫苗株序列测定及其六邻体特性分析 [J], 姜秀丽;王健伟;温乐英;石长信;洪涛3.腺病毒六邻体蛋白的基因测序在流行性角膜结膜炎病原检测中的应用 [J], 王旌;赵蓉;童晓维;朱剑锋4.腺病毒六邻体蛋白的基因测序在流行性角膜结膜炎病原检测中的应用 [J], 王旌;赵蓉;童晓维;朱剑锋;5.2013—2015年安庆地区腺病毒流行株型别鉴定及六邻体基因特征分析 [J], 曹孟婵;何军;李贤相;徐四清因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

人腺病毒及其分型方法研究进展

人腺病毒及其分型方法研究进展陈晓飞;刘琪琦;周伟;张五星;李颖【期刊名称】《生物技术通讯》【年(卷),期】2017(028)005【摘要】人腺病毒是引起婴幼儿急性呼吸道感染的主要病原体,还可引起其他系统感染.在临床表现方面与其他病原微生物的感染比较相似,仅根据临床表现诊断疾病比较困难,需要实验室的诊断证实.腺病毒的致病谱根据血清型的不同而不同,而其血清型是由分子结构中高变区的特异抗原决定的,特定血清型与疾病的严重程度、临床表现密切相关,所以腺病毒的检测分型尤为重要.本文就腺病毒的分子结构、流行特点及检测分型方法进行简要综述.%Human adenovirus is the main pathogen of the acute respiratory infection in infant,and it also can infect other systems.It is difficult to diagnose the disease according to the clinical maifestation,because it is similar with other pathogenic microorganism in clinical manifestations.Thus,we need laboratory diagnosis.The serotype is decided by hypervariable region specific antigen of molecular structure.Different serotype have different pathogenic spectrum,so the adenovirus serotyping detection is particularly important.In this paper,we summarized the molecular structure and detection of adenovirus serotyping methods.【总页数】4页(P700-703)【作者】陈晓飞;刘琪琦;周伟;张五星;李颖【作者单位】解放军第309医院,北京100091;军事医学科学院,北京100850;军事医学科学院,北京100850;解放军第309医院,北京100091;解放军第309医院,北京100091;解放军第309医院,北京100091【正文语种】中文【中图分类】R373【相关文献】1.人肠道病毒分型方法和鉴定技术的研究进展 [J], 张晓玲;胡芸文;周志统2.人乳头瘤病毒基因检测及分型方法研究进展 [J], 薛秀蕾;吴国球3.成人退变性脊柱侧凸分型方法的研究进展 [J], 李远强;朱勇;欧云生;赵增辉;罗伟;何彬4.成人退变性脊柱侧凸分型方法的研究进展 [J], 李远强; 朱勇; 欧云生; 赵增辉; 罗伟; 何彬5.人乳头瘤病毒新型检测及分型方法的研究进展 [J], 樊凌云;王欢;韩毅敏因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

肺结节动物模型的研究进展

肺结节动物模型的研究进展*赵亚昆1，2，邵栋1，郑瑜佳1，张珂煜1，田燕歌1，3，李建生1，2△（1河南中医药大学呼吸疾病中医药防治省部共建协同创新中心，河南省中医药防治呼吸病重点实验室，河南郑州 450046；2河南中医药大学第一附属医院，河南郑州 450046；3河南中医药大学中医药科学院，河南郑州 450046）Progress in animal models of pulmonary nodulesZHAO Yakun1，2，SHAO Dong1，ZHENG Yujia1，ZHANG Keyu1，TIAN Yange1，3，LI Jiansheng1，2△（1Collaborative lnnovation Center for Chinese Medicine and Respiratory Diseases Coconstructed by Henan Province & Ministry of Education， Henan Key Laboratory of Chinese Medicine for Respiratory Disease， Zhengzhou 450046， China；2The First Affiliated Hospital of Henan University of Chinese Medicine ， Zhengzhou 450046， China；3Henan University of Chinese Medicine Academy of Chinese Medical Sciences， Zhengzhou 450046， China. E-mail： li_js8@）［ABSTRACT］ A pulmonary nodule （PN） is characterized by a round or irregular lesion in the lung with a diame⁃ter ≤3 cm. PN is characterized by the following features upon imaging： heightened density， clear or unclear boundaries，without atelectasis，hilar lymph node enlargement，and pleural effusion.However，the pathogenesis of PN remains un⁃clear， and the current treatment measures have failed to meet the clinical demands. Therefore， animal models of PN are of great significance for investigating its pathogenesis and discovering or optimizing effective drugs and methods for its preven⁃tion and treatment. This paper summarizes the widely used animal models of PNs. Previous research has shown that the most common animal models were used for granulomas， lung adenomas， atypical adenomatous hyperplasia （AAH）， and adenocarcinomas. The experimental animals utilized were A/J mice， C57BL/6 mice， and mice with predominantly EGFR and Kras mutations.Moreover，the chief inducers included carcinogenic compounds，such as benzo（a）pyrene and 4-（methylnitrosamino）-1-（3-pyridyl）-1-butanone （NNK）. Furthermore， the preparation methods and model characteristics of PNs were systematically and comprehensively reviewed to provide a strong basis and a valuable reference for the rational selection of animal models for basic research and drug developent.［关键词］肺结节；动物模型；肉芽肿性结节；非典型腺瘤样增生；腺癌［KEY WORDS］pulmonary nodules； animal model； granulomatous nodules； atypical adenomatous hyperplasia；adenocarcinoma［中图分类号］R563； R363 ［文献标志码］ A doi：10.3969/j.issn.1000-4718.2023.09.018近年来，随着多层计算机断层扫描的普遍应用和肺癌筛查的广泛实施，肺结节在全球的检出率显著提高［1-2］。

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*国家自然科学青年基金资助项目（编号：31100133）△通信作者。

E －mail ：gzwcs@fimmu．com人3型腺病毒GZ13株的分离鉴定及六邻体蛋白的分子进化研究*张其威1，赵素慧1，王长兵2，朱冰2，朱利1，赵卫1，李凌1，万成松1△1南方医科大学公共卫生与热带医学学院微生物学系（广州510515）；2广东省广州市妇女儿童医疗中心中心实验室（510120）【摘要】目的分离鉴定1株引起儿童急性支气管肺炎的腺病毒及分析其主要中和抗原六邻体蛋白的分子进化趋势。

方法采用荧光定量PCR 方法，对1例引起严重支气管肺炎的患儿咽拭子进行检测，并从中分离得到1株腺病毒（命名为GZ13）。

利用型特异性引物PCR 进行初步亚型鉴定；克隆该株腺病毒完整的六邻体蛋白基因，测序和序列比对，确定其型别；同时与GenBank 上人3型腺病毒的六邻体蛋白进行同源性比对，分析预测六邻体蛋白的分子进化趋势。

结果该临床标本经荧光定量PCR 鉴定为腺病毒强阳性，型特异性引物PCR 初步鉴定为3型；完整六邻体基因比对最终确定为人3型腺病毒；GZ13株与我们先前分离的GZ01、GZ02株及台湾地区分离株核苷酸及氨基酸的同源性均大于99%。

结论引起该例儿童急性支气管肺炎的病原体为人3型腺病毒，目前在广州以及台湾地区流行的3型腺病毒仍属同一流行株，其主要中和性抗原六邻体蛋白未出现明显变异，这对今后开发研究人3型腺病毒疫苗及药物具有重要指导意义。

【关键词】人3型腺病毒；六邻体蛋白；分子进化Isolation and identification of human adenovirus type 3GZ 13strain and the molecular evolution of hexon pro-tein．ZHANG Qi －wei ☆，ZHAO Su －hui ，WANG Chang －bing ，ZHU Bing ，ZHU Li ，ZHAO Wei ，LI Ling ，WANCheng －song．☆Department of Microbiology ，School of Public Health and Tropical Medicine ，Southern Medical University ，Guangzhou 510515，ChinaCorresponding author ：WAN Cheng －song ，E －mail ：gzwcs @fimmu．com【Abstract 】ObjectiveTo isolate and identify the human adenovirus （HAdV ）from a child with an acute bron-chopneumonia ，and to analyze the molecular evolution of the neutralizing antigen hexon protein．MethodsThe adenovi-rus ，named GZ13，was isolated from the throat swab of a child with severe acute bronchopneumonia by FQ －PCR．Type －specific primers were used to primary identification of virus type by PCR．The complete hexon gene was cloned and se-quenced for confirmation．The hexon protein was also compared with the other HAdV －3to predict its molecular evolu-tion．ResultsThe adenovirus specimen was confirmed by FQ －PCR ，and classified as HAdV －3by primary PCR typ-ing ，which was further confirmed with hexon gene blast．There was 99%homogeneity of nucleotide and amino acid be-tween the GZ13strain and GZ01，GZ02or Taiwan strain according to alignment with all hexon proteins of adenovirus type 3．ConclusionHAdV －3is associated with this acute bronchopneumonia．The prevalent type 3adenoviruses ，GZ13，Taiwan Strains and other Guangzhou strains ，belong to circulating single strain．The stability and conservation of hexon is helpful in development of HAdV －3vaccine in future．【Key words 】human adenovirus type 3；hexon ；molecular evolution人腺病毒（human adenovirus ，HAdV ）属于哺乳动物腺病毒属，为无包膜双链DNA 病毒，呈二十面体结构［1］。

六邻体（hexon ，120kD ）是腺病毒衣壳二十面体的主要蛋白，每个六邻体由3个亚基组成，含有大量型特异性中和表位，能够刺激机体产生型特异性中和抗体。

腺病毒能引起人类广泛的疾病：急性上、下呼吸道感染，暴发性眼结膜炎，急性出血性膀胱炎以及婴幼儿胃肠炎等［2］。

目前已发现的HAdV 有56个型别，分为7个种（A G ）［3］。

其中B 种腺病毒与人类致病性密切相关，可分为2个亚种：B1（包含HAdV －3、－7、－16、－21、－50和SAdV －21）和B2（HAdV －11、－14、－34和－35）［4－6］。

人3型腺病毒（HAdV －3）具有更高的毒性并且与严重的临床症状相关［7］。

1982—1993年，日本的呼吸道感染疾病大部分由HAdV －3引起［8］。

2004年，中国江苏省9个城镇共709例呼吸道感染患者感染HAdV －3［9］，同年，我们发现并报道了一起广东省广州市某幼儿园258名儿童感染HAdV －3引起的急性咽结膜热的爆发［10－11］。

在台湾，HAdV －3更是近几年呼吸道感染疾病的主要血清型［12－13］。

本研究从广州1例引起严重支气管肺炎的患儿咽拭子标本中分离鉴定得到1株腺病毒，并进行PCR 分型、六邻体基因测序，最终确定该临床分离株的·8911·广东医学2012年5月第33卷第9期Guangdong Medical Journal May．2012，Vol．33，No．9DOI:10.13820/ki.gdyx.2012.09.002型别；同时分析了腺病毒主要中和性抗原六邻体蛋白的分子进化情况，为今后研究开发儿童HAdV －3疫苗及药物提供理论基础。

1材料与方法1．1病毒分离2011年1月，从广州市妇女儿童医疗中心内科住院部临床确诊为急性支气管肺炎的1例3岁患儿采集咽拭子标本，接种HeLa 细胞进行病毒分离，待出现典型致细胞病变效应（CPE ）后病毒于－80ħ冰箱中保存，并命名为GZ13。

1．2病毒鉴定抽提咽拭子标本中的核酸（通用型核酸快速提取试剂盒，华银公司），利用荧光定量PCR 方法对该标本中的各种呼吸道病毒进行鉴定。

提取培养病毒的DNA （OMEGA Viral DNA 提取试剂盒），利用我们设计的腺病毒分型引物进行PCR 扩增分型［11］，扩增引物由上海英骏生物技术有限公司合成。

1．3基因克隆及序列测定利用引物HexF ：5'－GC-CGCAGTGGTCTTACATGCACATC －3'和HexR ：AG-CACGCCGCGAATGTCAAAG ，PCR 扩增该腺病毒的六邻体基因，PCR 反应条件：94ħ1min ，94ħ30s ，55ħ30s ，72ħ3min ，72ħ7min ，扩增32个循环。

纯化回收PCR 产物（OMEGA 公司的DNA 凝胶回收试剂盒），克隆入pMD18－T 载体（Takara ），选取阳性重组质粒送上海英骏生物技术有限公司进行序列测定，并装配成一条完整序列。

1．4同源性分析及型别鉴定利用Bioedit 7软件分析该腺病毒六邻体的核苷酸与氨基酸序列，对该序列进行注释并提交到GenBank ；利用Blastn 、Blastp 软件对该株病毒六邻体基因的核苷酸及氨基酸序列在Gen-Bank 上进行比对，确定与该序列同源性最高的六邻体基因序列。

2结果2．1腺病毒GZ13的分离感染HeLa 细胞120h 后细胞病变情况如图1所示，细胞变圆、肿胀、成簇等典型腺病毒CPE 病变特征。

图1感染腺病毒GZ13株120h 后HeLa 细胞病变情况（ˑ100）2．2GZ13荧光定量PCR 检测结果通过对咽拭子标本中多种呼吸道病毒进行荧光定量PCR 检测，发现腺病毒检测呈强阳性（CT 值=19.03），证明该标本为腺病毒阳性。

2．3GZ13六邻体基因PCR 分析鉴定从病毒液中提取六邻体基因DNA ，利用HAdV －3型特异性引物进行扩增，可见样品在300bp 处出现目标条带，初步证明该分离株为HAdV －3（图2）。

利用HAdV －3六邻体扩增引物对GZ13株进行六邻体全基因PCR 扩增，在约3kb 处扩增出六邻体目的基因片段（图3）。

M ：100bp DNA Ladder ；1：无模板空白对照；2：GZ13病毒株DNA图2GZ13型特异性引物PCR扩增结果M ：1kb DNA Ladder ；1：无模板空白对照；2：GZ13病毒株DNA图3PCR 扩增GZ13六邻体全长基因的结果2．4GZ13株六邻体基因序列测定、亚型鉴定及分析将初步分型的六邻体基因片段克隆至pMD18－T 载体，进行菌落筛选培养，质粒进行PCR 鉴定，将序列送至上海英潍捷基有限公司测序，拼接注释后获得GZ13株六邻体基因序全长序列（2835bp ，944个氨基酸，GenBank 登录号：JQ764730）。

Blastn 和Blastp 分析表明，GZ13株属于HAdV －3，与型特异性PCR 扩增分型结果一致。