利福平和异烟肼耐药基因突变快速检测方法在结核病中的应用

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基因芯片检测结核分枝杆菌对利福平和异烟肼耐药性

ＴｈｓｆｇｎｈｐｉｅｅｔｇｍｙｏａｔｒｍｎｔｂｒｕｏｉｅｉａｃｏｒｆｍｐｎａｄｉｏｉｚｄＺＨＮＧＲｕ — ｉｅｕｅｏｅｅｃｉｎｄｔｃｉｃｂｃｅｉｕｅｃｌｓｒｓｓｎｅｔｉｎｓｔａｉｎｓｎａｉＡｉｍｅＩ
ｃｅｔｅｐｌｍｏｐｉｍｓａｄ１ｔｔｎｎ４ｇｎｓａｓｃａｅｔＰａｄＩＨｅｉａｃ．ｈｔｔｎｎｍｙｏａｔｒｍｌｏｉｏｙｒｈｓｎｍｕａｉｓｏｅｅｓｏｉｔｄｗｉＲＦｎＮｒｓｓｎｅＴｅｍｕａｉｓｉｅｂｅｅｉｄ１ｏｈｔｏｕ
【摘要】目的研究基因芯片在检测结核分枝杆菌对利福平和异烟肼耐药性中的应用。方法根据与利福平和
异烟肼耐药相关的４条基因上的１１个位点和３０种单核苷酸多态性设计制作芯片，用芯片检测结核分枝杆菌的基因
突变，而判断其耐药性。结果用基因芯片在ｌＯ株异烟肼耐药株中检测出８（３３）在３从１５侏７．％，Ｏ株异烟肼敏感株中检测出２２株（３３）在９７．％，４株利福平耐药株中检测出７７株（１９，４８．％）在６株利福平敏感株中检测出４Ｏ株
ｗｔｏｆｔｅｓｑｅｃｎｏｍａｉｎＣｏｃｕｉｎＴｅｇｎ — ｈｐｔｃｎｌｇ－ａｔｄｔｃｉｎｗｔｉｈａｃｒｃ，ｐｃｆｉｉｓｍｅｏｅｕｎｅｉｆｒｔ．ｎｌｓｏｈｅｅｃｉｅｈｏｏｙａｆｓｅｅｔｉｈｇｃｕａｙｓｅｉｃｔｈｈｏｏｈｉｙａｄｓｎｉｖｔ。ｓｓｏｎｏｒｓｕｙｉｐｏｓｎｎｔｅｃｉｉａｅｅｔｎｏｃｂｃｅｕｔｂｒｕｏｉｒｓｓａｃｏＩｎｅｓｔｉａｈｗｎｉｕｔｄ。ｓｒｍｉｉｇｉｈｌｃｌｄｔｃｉｆｍｙｏａｔｒｍｕｅｃｓｓｅｉｔｎｅｔＮＨｉｙｎｏｉｌ

快速方法检测耐利福平结核分枝杆菌基因突变的研究

ＤＡ聚合酶（／１各ｕｅ５，ｆ２探Ｎ１Ｕ）ｌｌ模板２ｌ双蒸水补足到２ｌ，，５。扩增条件：４９
５０株结核分枝杆菌均来自２００５
ｏｍｉ，４℃ ３，０ｏ０Ｓ７Ｃ３，４Ｃ４ｎ９０ｓ６３，２ｏ０ｓ共０个Ｃ
利福平（Ｆ）临床主要抗结核药物之一，ＲＰ是结
核分枝杆菌对ＲＰ耐药是结核化疗失败的主要原Ｆ因之一。当结核菌株对ＲＰ产生耐药时较易出现Ｆ
备：菌株培养物经０９氯化钠注射液３次离心洗．％
溶于ＴＥ缓冲液（羟甲基氨基甲烷盐酸和乙二胺三
杆菌对ＲＰ耐药与其ＤＡ依赖性ＲＡ聚合酶ＢＦＮＮ亚单位编码基因（ｐＢ突变有关Ｊｒ）ｏ。传统的检测药物敏感性的方法需要２—３个月时间，不利于疾病
的及时诊治。随着分子生物学的发展，ＮＤＡ测序、
多；ＮＤＡ芯片技术虽然可以一次对大量位点进行
特异性探针（见表１。引物及探针由上海生工有限）
公司合成。③实时ＰＲ检测：引物与探针用双蒸Ｃ将水溶解，终浓度为１ｍｏＬ使０Ｉｌ。按照每个反应管ｘ／检测１个标本１突变位点来配制ＰＲ反应液，个Ｃ即每个反应管里都有１结核杆菌特异性探针和１条条
１材料和方法

结核分支杆菌两种耐药基因的快速检测

结核分支杆菌两种耐药基因的快速检测近年来，全球结核病呈现死灰复燃的趋势，其主要原因是耐药(DR-TB)和耐多药(MDR-TB)结核病的广泛分布和迅速传播。

作为一线抗结核药物，INH和RFP 结核病的预防、治疗方面起着重要作用。

但由于单药化疗和不规则化疗，其耐药情况越来越严重。

有研究表明结核分杆菌耐异烟肼的产生与过氧化氢酶-过氧化物酶的编码基因KatG基因的缺失和突变有关；而利福平耐药则与RNA聚合酶的p亚基的编码基因rpoB突变有关。

我们在用PCR-SSCP方法单独检测KatG 和rpoB基因突变时，发现在非变性聚丙烯酰胺凝胶中，这两种基因的迁移率不同，且差异很大。

因此，我们在一个反应中同时扩增KatG和rpoB基因。

再根据其SSCP图谱进行分析，这样就可以同时检测异烟肼和利福平耐药性。

我们采用PCR-SSCP银染法直接检测临床分离株和临床痰标本中结核分支杆菌rpoB基因和KatG基因突变，现将结果报告如下。

1 资料与方法1.1 标本来源107株临床分离株和39例肺结核病患者涂阳痰标本均来自吉林市结核病防治研究所。

107株临床分离株按结核病诊断细菌学规程进行菌种鉴定及药敏实验证实为结核分支杆菌，其中63例耐RFP，55例耐INH，49例耐SM。

65例肺结核病患者涂阳痰标本根据临床症状、涂片结果、胸部X线和培养结果确诊，其中33例耐RFP，27例耐INH，28例耐SM。

1.2 引物序列为1.3 方法1.3.1 dNA的提取用传统酚／氯仿抽提法提取标本中DNA。

1.3.2 PCR扩增采用25 μl反应体系，4xdNTPs终浓度为0.2 mmol／L，引物终浓度为0.2 μmol／L，扩增程序为94℃变性1 min，61℃退火1 min，72℃延伸1 min，循环30次，最后72℃延伸10 min。

扩增产物经2％琼脂糖凝胶电泳。

紫外检测rPOB出现258bp条带、KatG出现282bp条带即为扩增阳性。

利福平和异烟肼抗结核分支杆菌耐药基因的研究

利福平和异烟肼抗结核分支杆菌耐药基因的研究【摘要】耐药结核病是全世界结核病疫情第三次回升的重要原因，结核病耐多药菌株的出现增加了结核病治疗的难度，目前，用于结核病治疗的一线要主要是利福平和异烟肼。

异烟肼耐药机制非常复杂，与之耐药相关的基因较多，如：katg，inha，aphc，kasa，ndh等。

其中最主要的耐药基因为katg 、inha 基因。

利福平相关耐药基因研究较为明确，目前认为rpob基因的突变是mdr-mtb菌株的标志。

迄今为止，对利福平和异烟肼抗结核分支杆菌耐药性的检测方法有多种，实际工作中需要将多种检测方法同时运用，以使检测结果真实可信，及时为临床治疗提供有效的依据。

【关键词】耐药结核病；利福平，异烟肼；耐药基因；检测方法肺结核是世界上主要的公共卫生问题，是严重危害人类身体健康的传染性疾病之一。

二十世纪五、六十年代人们便期望找到一种有效的方法来控制肺结核的传染，最后达到治愈结核病的目的，但目前肺结核仍是一个全球性的流行病，成为全球性的公共卫生问题，每年大概有2-3百万的人死于这种疾病。

近年来，肺结核在艾滋病患者中的广泛传播再一次引起了公众的关注1，耐药结核杆菌尤其是耐多药结核杆菌的出现和传播是导致结核病发病率升高的重要原因。

本文就结核杆菌对利福平和异烟肼产生耐药性的相关基因，以及耐药性检测的方法做一综述2。

1 异烟肼异烟肼（isoniazid，inh），是抗结核病的常用一线药物，在结核病的治疗中一直起着重要的作用。

但大多数结核病患者如果长期用药易产生耐药性，这主要是由于长期使用inh可诱导细菌产生基因突变，从而使细菌对inh的耐药性增强。

有研究表明。

1.1 katg 基因是过氧化氢酶‐过氧化物酶的编码基因，katg基因全长2223个核苷酸，上游与相隔44个碱基的fura基因（一种结核杆菌铁调控蛋白编码基因，可能为katg基因的启动子，并调控其表达）相连，下游与相隔2794个碱基的embc基因相连。

基因芯片法快速检测复治肺结核耐药性

以传统药敏检测为标准，芯片法检测异烟肼耐药、利福平耐药和多耐药的灵敏度分别为
例样本提取细菌基因组ＤＮＡ后进行异烟肼、利福平耐药基因的基因芯片法检测，同时对各样本进行结核分枝杆菌分离
培养和传统药敏试验。结果
８９．２％、９Ｏ．３％和９１．０％，特异度均为１００．０％，假阳性率均为０．０％，假阴性率分别为１０．８％、９．７％和９．Ｏ％，符合率分别为９２．Ｏ％、９１．Ｏ％和９４．０％。结论基因芯片法能快速筛查复治肺结核的耐药和耐多药情况，与传统罗氏培养药敏试验相比，具有简便、快速、灵敏度高、特异性强的优点，值得在临床中推广应用。
Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＯｂｊｅｃｉｔｖｅＴｏｒａｐｉｄｌｙｄｅｔｅｃｔｔｈｅｄｒｕｇｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｏｆＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓｗｉｔｈｔｈｅｇｅｎｅｃｈｉｐｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，ＳＯａｓｔｏ
ｐｒｏｖｉｄｅｓｃｉｅｎｔｉｉｃｆｒｅｆｅｒｅｎｃｅｆｏｒｍａｋｉｎｇｒａｔｉｏｎａｌｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙｓｃｈｅｍｅ．Ｍｅｔｈｏｄｓ１００ｓａｍｐｌｅｓｗｈｉｃｈｗｅｒｅａｃｉｄ—ｆａｓｔｐｏｓｉｔｉｖｅ

结核分枝杆菌(MTB)耐药突变基因检测在结核检测中的应用

结核分枝杆菌 (MTB)耐药突变基因检测在结核检测中的应用摘要：目的：研究在结核分枝杆菌（MTB）耐药突变基因检测在结核患者中的检测效果。

方法：选取2019年4月～2020年4月在我院治疗的肺结核患者562例，分别进行Xpert MTB/RIF系统结合利福平耐药性检测、液体培养法、直接涂片三种检测方法，将临床诊断作为金标准。

结果：MTB/RIF系统结合利福平耐药性检测的准确度、灵敏度、特异度均高于液体培养法与直接涂片法，P＜0.05。

结论：在结核病的检测中，采用MTB/RIF系统结合利福平耐药性检测具有较高的诊断价值。

关键词：结核分枝杆菌；耐药突变基因；结核病结核病是常见的感染病，是由结核分枝杆菌（MTB）引起的强烈的慢性疾病，最常见的为肺结核，是导致人类死亡的主要原因之一。

据有关统计学报道，我国每年新发的结核患者可多达上百万里，仅次于印度及印度尼西亚。

我国对结核病的防治规划是在2030年之前，争取将结核病的发病率降低80％，为了实现这个目标，对结核病患者的早期诊疗及耐药性检测就非常重要了[1]。

当前结核病的诊断依然依赖传统的涂片及培养法，培养周期长，生物安全性高，检出率较低。

近些年开始推荐Xpert MTB/RIF系统结合利福平耐药性检测，具有快速便捷的作用[2]。

本文就Xpert MTB/RIF系统结合利福平对可疑肺结核患者进行检测，评价此检测方式在耐药突变基因中的检测价值进行研究，现汇报如下。

1.资料及方法1.1一般资料选取我院收治的562例疑似肺结核患者，均于2019年4月～2020年4月期间收治，男369例，女193例，年龄：18-75岁，平均年龄（42.45±9.81）岁。

临床诊断结果显示562例疑似结合患者中，MTB阳性424例、阴性138例。

1.2方法所有患者均采用美国BD公司生产的BACTECMGIT960系统、MGIT管及利福平药粉；采用美国Cepheid公司生产的Xpert MTB/RIF设备及试剂盒以及贝索公司生产的抗酸染液。

基因芯片技术快速检测结核分枝杆菌异烟肼、利福平耐药性

ｓｔｎｅｏ２ｃｉｉａｓｌｔｓｏＢｕｉｇｔｅｇｎｈｐｔｃｎｌｇｆｏａｅｔｅｒｓｌｓｏｏｖｎｉｎｒｐｒｏｔｏ．ｉａｃｆ６ｌｎｃｉｏａｅｆＭＴｓｅｅｃｉｅｈｏｏｙｗｅｅｃｍｐｒｄｗｉｔｅｕｔｆｃｎｅｔｏａｐｏｔｎｍｅｈｄｓｌｎｈｈｈｌｏｉ
ｆｔｅｔｇｔＩｎａｉＩＨ）ａｄＲｆｉｎ（Ｆａｓｎｏｉｚｓｔｉｏｓｄ（ＮｎｉｍｐｃＲＰ）ｉｃｂｃｅｕｂｒｕｏｉＭＴ．ＭｅｈｄＴｅｄｔｆＮｄＲＰｒ— ａｉｎＭｙｏａｔｉｍｔｅｃｓｒｕｌｓ（Ｂ）ｔｏｓｈａｏＨａＦａＩｎｅ
ＲｅｕｔＴｈｅｕｔｆｅｓｔｉ，ｓｃｆｃｔ，ｐｓｔｖｒｄｃｉｅｖｕ，ｎｇｔｅｐｅｉｔｖａｕ，ａｄａｃｒｃｂｍｎｄｕｉｇｔｅｇｎｓｌｓｅｒｓｌｏｎｉｖｔｐｅｉｉｓｓｉｙｉｙｏｉｅｐｅｉｔａｅｅａｉｒｄｃｉｅｖｅｎｃｕａｙｏｔｅｓｎｅｅｉｖｌｖｌｈ
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噬菌体生物扩增法快速测定结核分枝杆菌对异烟肼和利福平的药物敏感性应用价值

ｔｔｌ１７ｔｉｓｗｅｅｕｔｒｄｏｏｗｎｔｉ—ｅｅｃｈｒｍｅｉｍｎｄｎｉｅＭｙｏａｔｒｕｅｃｌｓｏａ６ｓａｎｒｃｕｅｎＬ — ｅｅｎＪｎｎｕｕｅｄｕａｄｉｅｔｄａｒｌｓｓｆｓｃｂｃｅｕｔｂｒｕｏｉｉｍｓ
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ｂｏｏｉａｌｓａＰａｉｌｇｃｙａｓｙ（ｈＢ）ｉｅｄｔｃｉｎｏｏｉｚｄａｄｒａｉｅｉａｃｎＭｙｏａｔｒｍｕｅｃｌｓ．Ｍｅｈｄｌｎｔｅｅｔｆｉｎａｉｆｍｐｎｒｓｓｎｅｉｅｂｅｅｕｔｂｒｕｏｉｈｏｓｎｉｔｉｓｔｏｓ

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利福平和异烟肼耐药基因突变快速检测方法在结核病中的应用
作者：辛宝林于秀坤
来源：《中国实用医药》2016年第09期
【摘要】目的探讨利福平和异烟肼耐药基因突变采用PCR线性杂交酶显色法建立快速检测方法的应用价值。

方法 88份送检的结核病患者临床标本，得结核分枝杆菌分离株64株，采用PCR线性杂交酶显色法建立利福平和异烟肼耐药基因突变快速检测方法进行检测，同时采用比例法检测，并以比例法为标准评价快速检测方法的诊断价值。

结果快速检测方法中对利福平耐药24份，仅对异烟肼耐药24份，对利福平和异烟肼均耐药22份，不耐药18份。

以耐药不耐药作为分割点，比例法药敏试验结果为参考标准，快速检测方法的灵敏度
100.0%，特异度90.0%，准确度97.7%；两种检验方法一致性好（P>0.05）。

结论 PCR线性杂交酶显色法建立快速检测方法可在12 h内对利福平和异烟肼耐药基因突变的作出判断，与比例法药敏试验一致性好，可信度高，值得临床推广。

【关键词】利福平；异烟肼；耐药；基因突变；结核分枝杆菌；快速检测
DOI：10.14163/ki.11-5547/r.2016.09.115
利福平和异烟肼是结核病的最重要的一线抗结核药物[1]。

近年来结核分枝杆菌基因突变发生耐药的情况也时有发生，世界卫生组织报道每年有新增48.9万例耐多药结核病，其总量占结核病患者的4.8%，而在我国则更为严重。

耐多药结核病的早期确诊有利于患者的病情控制，比例法药敏试验虽然结果可靠，且被公认为判断结核分枝杆菌耐药的金标准，但该方法需要细菌培养，耗时2～4个月，易贻误病情。

随着分子生物学的飞速发展，为结核分枝杆菌耐药性快速检测提供可能。

本中心采用PCR线性杂交酶显色法建立利福平和异烟肼耐药基因突变快速检测方法对送检的疑似耐药结核病患者临床标本进行检测，并将结果与比例法药敏试验进行分析，现报告如下。

1 材料与方法
1. 1 材料取2013年10月～2015年5月送检的疑似耐药结核病患者临床标本88份，其中痰65份，肺泡灌洗23份。

1. 2 去污染处理将1～2倍于痰及肺泡灌洗液样本的4%NaOH放置于样本中，震荡混匀，静置20 min，再将pH=6.8的磷酸缓冲液加入样本中， 3000 r/min离心1 min，沉淀后去除上清液，将1 ml磷酸缓冲液加入其中，混匀，获得去污染样本。

1. 3 方法
1. 3. 1 比例法药敏试验取适量去污染样本在酸性固体罗氏培养基上接种，在37℃温度下培养7 d，菌群鉴定采用齐-尼氏染色法，共得结核分枝杆菌分离株64株。

制备10-2 g/L和10-4 g/L菌悬液，各取0.01 ml采用划线法接种在含药培养基及对照培养基表面， 37℃温度下培养4周，≤1%为敏感。

1. 3. 2 快速检测方法的建立采用PCR线性杂交酶显色法建立快速检测方法。

取去污染样本500 μl加入1.5 ml离心管，以5600 r/min的速度离心15 min后去上清液，加入去离子水500 μl，再次以5600 r/min的速度离心15 min，沸水浴20 min，超声裂解15 min，取上清液5 μl为DNA模板。

采用BLAST软件对katG、inhA和rpoB基因合适的扩增区域进行引物扩增，其中katG基因2个探针， inhA基因2个探针， rpoB基因11个探针。

PCR扩增体系（引物1 μl，
2.5 mmol/L三磷酸脱氧核糖核苷混合物4 μl， 10×PCR缓冲液5 μl，MgCl2 3 μl，DNA聚合酶5.0 U，去离子水3 μl，提取的DNA模板5 μl）进行PCR扩增。

扩增条件：第一阶段：95℃ 15 min， 95℃ 30 s， 58℃ 2 min， 10个循环；第二阶段：95℃ 25 s， 53℃ 40 s，70℃ 40 s， 30个循环；第三阶段：70℃ 8 min。

取20 μl PCR扩增产物加入杂交盘中，与20 μl 变性裂解液混匀，室温静置5 min后，加入1 ml杂交缓冲液，放入探针试条。

将杂交盘放入GTblot-20全自动杂交仪，杂交成功后取出试纸吸水纸干燥，判读。

1. 4 统计学方法采用SPSS19.0统计学软件处理数据。

计数资料以率（%）表示，采用χ2 检验。

P
2 结果
比例法药敏试验中仅对利福平耐药26份，仅对异烟肼耐药23份，对利福平和异烟肼均耐药19份，不耐药20份。

快速检测方法中对利福平耐药24份，仅对异烟肼耐药24份，对利福平和异烟肼均耐药22份，不耐药18份。

以耐药不耐药作为分割点，比例法药敏试验结果为参考标准，快速检测方法的灵敏度100.0%（68/68），特异度90.0%（18/20），准确度97.7%（86/88），两种检验方法一致性好（P=0.1573>0.05）。

3 讨论
目前，基于分子生物学研究的利福平和异烟肼耐药基因突变快速检测方法包括实时PCR 单链构象多态性分析、实时PCR熔解曲线法、噬菌体法、基因芯片法及PCR线性杂交酶显色法等，后两种方法应用最为广泛。

这些方法预测耐药表型均基于结核分枝杆菌的rpoB、katG 和inhA基因特定区域或位点突变[2]。

约96%的利福平耐药性与rpoB突变相关， 30%～60%的异烟肼耐药性与katG基因突变相关，故上述基因区域可基本覆盖耐药基因突变情况，为检测技术的灵敏度和准确性提供保障。

PCR线性杂交酶显色法也可见于慢性乙型肝炎病毒拉米夫定耐药研究[3]。

该技术应用于结核分枝杆菌的检测时，通过多重聚合酶链反应结合反向杂交技术，与固定在硝化纤维条带上的特异基因杂交[4]，显色判读。

在此过程中PCR扩增效果不受细菌存活量的影响、杂交后化学信号放大，是PCR线性杂交酶显色法的灵敏度高的主要原因。

本研究结果显示快速检测方法的灵敏度100.0%，特异度90.0%，准确度97.7%，结果与
李大登等[5]报道一致。

本研究纳入为疑似耐药结核病患者，故耐药阳性检出率为77.27%（68/88），远高于其他报道的总耐药率29.14%[6]，符合事实。

此外，与比例法药敏试验相比， PCR线性杂交酶显色法成本更低，更利于在地市级结核病医院实验室应用[7]。

另外本研究中PCR线性杂交酶显色法整个操作过程≤6 h，可做到当天送检当天出结果，符合快速检测的要求。

综上所述，采用PCR线性杂交酶显色法建立利福平和异烟肼耐药基因突变快速检测方法进行检测，与比例法药敏试验一致性好，可信度高，值得临床推广。

参考文献
[1] 欧维正，骆科文，王燕，等.基因芯片与比例法药敏性试验检测结核分支杆菌对利福平和异烟肼耐药性的比较研究.检验医学， 2013， 28（5）：404-407.
[2] 王峰，崔运勇，胡思玉，等.实时聚合酶链反应熔解曲线法快速检测耐多药结核分支杆菌.中华结核和呼吸杂志， 2011， 34（12）：888-893.
[3] 赖国旗，张文露，胡源，等.反向线性探针杂交技术检测慢性乙型肝炎病毒拉米夫定耐药研究.西南师范大学学报（自然科学版）， 2012， 37（3）：113-119.
[4] 范齐文，吴文娟.结核病实验诊断技术.微生物与感染， 2012， 7（3）：190-196.
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[6] 多丽娜，王婷婷，宋兴勃，等.分子线性探针技术分析四川地区结核分枝杆菌耐药情况.南方医科大学学报， 2011， 31（5）： 822-824.
[7] 李强，夏辉，欧喜超，等.应用线性探针技术与传统药敏试验检测耐药结核病的成本比较.中国防痨杂志， 2013， 35（3）：187-190.
[收稿日期：2015-11-09]。