HPLC系统性能地测试
仪器分析实验 HPLC性能检查和参数测定
HPLC 性能检查和参数测定一、实验目的 二、实验原理1、性能检查：噪音、漂移、定性重复性、定量重复性、检测限；2、色谱参数：理论塔板数（n ）、理论塔板高度（H ）、有效塔板数（n eff ），有效塔板高度（H eff ），容量因子（k ），分配系数比（α），分离度（R ）。
三、色谱条件色谱仪由岛津10AT vp 泵、10AT vp 紫外检测器及岛津ODS 色谱柱（150×4.6mm ，5μm ）组成；流动相：甲醇-水（85:15，v/v ）；流速：0.8ml/min ；柱温：常温；检测波长：254nm ；进样量：定量环20μl 。
四、实验步骤1、打开计算机、工作站，确认参数；打开泵电源（power ），更换流动相，排气，设定流速，开泵（pump ）；打开检测器电源，自检完毕后设定检测波长；采集基线，观察噪音和漂移，记录。
2、进样一次，出峰完毕后手动停止，保存。
重复5~6次。
3、打开保存的色谱图，积分处理；打印一副色谱图和所有实验数据，老师审阅后签名。
4、关闭检测器，停泵，更换纯甲醇，排气，设定流速0.5ml/min ，开泵，关闭工作站、计算机，用纯甲醇分别在Inject 和Load 位置清洗进样口。
5、计算性能指标（灵敏度，检测限，定性、定量重复性）。
6、以苯和萘的数据计算色谱参数。
五、数据处理要求1、计算公式：21/25.54R t n W ⎛⎫= ⎪⎝⎭，H = L/n ，21/2'5.54R eff t n W ⎛⎫= ⎪⎝⎭，H eff = L/n eff ，W = 1.699W 1/2，2121(1)(2)121/21/22() 1.177()1.5R R R R t t t t R W W W W --==≥++， 222111''R R k t K k t K α===， 0's R m m t k m t ==，灵敏度：)(601000m in)/()()/(g m ml F S V A g ml mV S ⨯⋅=⋅μ，检测限（g/ml ）：D=2N/S ，N 为噪音（mV ），C 萘= g/ml 。
高效液相色谱仪仪器确认指导原则
高效液相色谱仪仪器确认指导原则高效液相色谱仪（HPLC）是一种用于分离、鉴定和定量化学混合物中成分的分析仪器。
在使用HPLC进行分析时，需要遵循一些仪器确认指导原则，以确保实验的准确性和可靠性。
以下是一些常见的HPLC仪器确认指导原则：●系统稳定性测试：在每次使用HPLC系统之前，应进行系统稳定性测试，包括流速、压力、温度和检测器灵敏度等参数的测试。
这有助于确保HPLC 系统处于良好的工作状态。
●柱效应测试：对于液相色谱柱，应定期进行柱效应测试，检查柱的性能是否正常。
这可以通过分析已知的标准溶液或参考物质来实现，以确保柱的分离效果和分辨率。
●检测器校准：对于UV/VIS检测器、荧光检测器、电化学检测器等，应定期进行校准，以确保检测器的灵敏度和响应性能。
●溶剂纯度检查：在使用HPLC进行分析之前，应检查使用的溶剂的纯度。
使用纯度较低的溶剂可能会影响实验结果，因此应选择高纯度的溶剂，并定期进行纯度检查。
●标准曲线校准：对于定量分析，应根据需要制备标准溶液，并利用标准曲线对样品进行定量分析。
标准曲线应当定期进行校准和更新，以确保准确性和可靠性。
●数据记录和审查：在进行HPLC分析时，应当及时记录实验数据，并进行数据审查。
这有助于发现潜在的问题或异常，并及时采取纠正措施。
质量控制和验证：对于关键参数和流程，应建立质量控制和验证程序，确保实验结果的准确性和可靠性。
这包括校准、验证、质量控制样品的使用和记录等。
通过遵循这些仪器确认指导原则，可以确保HPLC分析的准确性、可靠性和重复性，并为实验结果的正确解释和数据分析提供可靠的基础。
液相色谱系统性能测试方法
液相色谱系统分析系统性能测试方法本液相色谱系统分析系统性能测试方法以国家质监局液相色谱仪国标JJG-705-2002检定规程为基础，由上海伍丰科学仪器有限公司编写。
对液相色谱系统的系统指标包括：基线噪音、基线漂移、最小检测限、定性重复性、定量重复性等分析性能进行检定。
系统测试优先于部件的测试。
进行系统测试之前，按照所要测试的配置，需要将紫外Array检测器、输液单元、进样单元、色谱柱，如果配有柱温箱，需要将柱温箱等单元的流路部分，通讯部件连接电脑工作站软件或数据处理装置，通讯后方可进行。
测试必备的条件：检定规程：国家质监局JJG-705-2002检定规程。
流动相：甲醇（色谱纯级）500mL，流量：1.000mL/min，标准样品：萘/甲醇溶液，C萘=1×10-4g/mL，C萘=1×10-7g/mL，色谱柱：150mm C18色谱柱，温度：18~25℃，温度变化不可超过±1℃，电源电压：~220±22V，检定波长：254nm，检定项目：基线噪音、基线漂移、最小检测限、定性重复性、定量重复性，鉴定项目和要求（参考：伍丰公司企业测试标准）：基线噪音≤2×10-5AU，基线漂移≤2×10-4AU/h，最小检测浓度≤1×10-8g/mL，定性重复性误差RSD6Rt≤0.5%，定量重复性误差RSD6A≤1%，输液单元流量设定值误差S S≤1.0%输液单元流量稳定性误差S R≤1.0%测试具体内容和步骤：（等度系统）1系统基线噪声检定系统按正常工作连接，以100%色谱级甲醇为流动相，流量为1.0mL/min，连接C18色谱柱，紫外检测器波长设定254nm ，响应时间设定1s ，关闭波长扫描，关闭外部事件，开机预热，待仪器稳定后，记录基线4min ，停止采样后，设定峰宽5，斜率70，重分析谱图，查看谱图基线峰-峰高对应的吸光度值，计算系统的基线噪音。
HPLC方法验证
HPLC方法验证高效液相色谱（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）是一种广泛应用于药物、食品、环境、生物和化学分析等领域的分离和定性定量分析方法。
HPLC方法验证是确保所采用的分析方法能够稳定、准确地进行分析的过程。
下面将以1200字以上的篇幅介绍HPLC方法验证的步骤、参数和标准。
HPLC方法验证通常包括以下步骤：系统适应性、选择性、线性性、准确性、精密度和重复性。
首先是系统适应性验证，目的是确保所选的HPLC系统可以满足所需的分析要求。
这一步骤通常涉及校准和校准曲线的建立，通过检查稳定性、重复性和灵敏度等参数来评估系统的性能。
选择性验证是指检测方法对目标分析物的选择性，确保所选择的分析方法能够清楚地分离目标分析物，而不会受到其他干扰物的影响。
这通常涉及方法的优化和杂质检测。
线性性验证是评估方法在一定浓度范围内的线性关系，即样品浓度与峰面积的关系。
这一步骤涉及建立标准曲线，并通过回归分析来评估方法的线性性。
准确性验证是确定方法对目标分析物的准确性和恢复率。
这通常涉及测量已知浓度的标准样品，并与理论值进行比较，以确定方法的准确性。
精密度和重复性验证是评估方法在同一实验室内和不同实验室之间的可重复性和精密度。
这一步骤涉及对同一样品的重复测量，并计算相对标准偏差（RSD）。
在HPLC方法验证中，除了上述步骤外，还需要根据相关准则和标准来设计验证实验，并记录和分析实验结果。
例如，美国食品药品管理局（FDA）和国际药典（USP）提供了一些关于HPLC方法验证的指南和标准，如FDA的ICHQ2(R1)和USP1225章节。
根据这些准则和标准，HPLC方法验证需要满足一些特定的参数和标准。
例如，在线性性验证中，通常要求相关系数（r）大于等于0.99，而在准确性验证中，通常要求恢复率在80%至120%之间。
精密度和重复性验证通常要求相对标准偏差（RSD）不超过2%或2.5%。
HPLC仪器验证方案
HPLC仪器验证方案HPLC（高效液相色谱）仪器验证是确保仪器正常运行和产生可靠结果的重要步骤。
以下是一个1200字以上的HPLC仪器验证方案，包括设备验证、性能验证和方法验证。
一、设备验证设备验证是验证HPLC仪器的各个组成部分和设备参数是否符合规定要求的过程。
以下是设备验证的主要内容：1.仪器校准：校准仪器的参数（如流速、温度、压力）并与参考值进行比较，以确保精确度和准确性。
2.设备清洁和维护：定期清洁仪器的各个部件，如针尖、柱头和流动通道，以确保仪器正常运行和消除污染的风险。
3.电源和地线：检查电源接头和插头是否正常连接，并确保地线连接良好，以避免电气故障和触电风险。
4.仪器参数设置：根据标准和方法要求，设置仪器的参数，如波长、检测器灵敏度和积分时间等，以确保仪器能够正确执行分析过程。
5.故障检测和保护：测试仪器的自动诊断和保护功能，如温度过高、压力异常和泄漏等故障的检测和报警系统，以及自动停止流程和保护仪器。
二、性能验证性能验证是验证HPLC仪器的参数和性能是否符合规定要求的过程。
以下是性能验证的主要内容：1.流速准确性：使用标准物质，验证仪器的流速准确性，测量仪器的流速与参考值之间的偏差。
2.重复性和精密度：通过多次重复测量相同样品，并计算测量结果的变异系数以验证仪器的重复性和精密度。
3.检测限和线性范围：使用标准物质，测量仪器的检测限和线性范围，并与规定要求进行比较。
4.分离度：使用混合物标准物质，检验仪器的分离度和分辨率，并与规定要求进行比较。
5.峰对称性：使用对称性标准物质，检验仪器的峰对称性，并与规定要求进行比较。
三、方法验证方法验证是验证HPLC仪器的分析方法是否能够正确、准确和可靠地分析样品。
以下是方法验证的主要内容：1.选择合适的标准物质：选择能够准确、快速和可靠地分析样品的标准物质，并制定合适的样品前处理方法。
2.优化分析方法：通过调整仪器参数和条件，优化分析方法，使得样品能够在较短的时间内获得准确的结果。
高效液相色谱仪的性能检查
高效液相色谱仪的性能检查一、实训目标 1．了解HPLC仪器的基本构造和工作原理，把握高效液相色谱仪的基本操作； 2．认识高效液相色谱仪仪器性能检查的项目和办法； 3．把握液相色谱柱性能指标（如理论塔板数、峰不对称因子、柱的反压等）的测定办法，学会判别其性能优劣。
二、实训原理 1．高效液相色谱仪的性能指标 (1)流量精度仪器流量的精确性，以测量流量与指示流量的相对偏差表示。
(2)检测限本试验用法紫外检测器，其检测限为某组分产生的信号大小等于2倍噪声时，每毫升流淌相所含该组分的量。
(3)定性重复性在同一试验条件下，组分保留时光的重复性，通常以被分别组分的保留时光之差的相对标准偏差来表示（RSD≤1％认为合格）。
(4）定量重复性在同一试验条件下，组分色谱峰峰面积（或峰高）的重复性，通常以被分别组分的峰面积的相对标准偏差来表示（RSD≤2％认为合格）。
2．液相色谱柱的性能指标一支色谱柱的好坏要用一定的指标来举行评价。
通常评价色谱柱的主要指标包括：理论塔板数N；峰不对称因子；两种不同溶质的挑选性（(a)；色谱柱的反压；键合固定相的浓度；色谱柱的稳定性等。
一个合格的色谱柱评价报告起码应给精彩谱柱的基本性能参数，如柱效能（即理论塔板数N)、容量因子k、分别度R、柱压降等。
评价液相色谱柱的仪器系统应满足相当高的要求：一是液相色谱仪器系统的死体积应尽可能小；二是采纳的样品及操作条件应该合理，在此合理的条件下，评价色谱柱的样品可以彻低分别并有适当的保留时光。
不同类型色谱柱性能评价所需的样品与所采纳的操作条件是不同的，可查阅相关参考资料。
三、实训仪器与试剂 1．仪器 PE200型高效液相色谱仪或其他型号液相色谱仪（一般配置，带紫外检测器）；TC4色谱工作站或其他色谱工作站；色谱柱［PEBrownleeC18反相键合相色谱柱（5μm,4.6mmi.d.×150mm)];100μL平头微量注射器；超声波清洗器；流淌相过滤器；无油真空泵；容量瓶等玻璃仪器。
HPLC分析方法中系统适用性试验概念解析及评价参数
HPLC 分析方法中系统适用性试验概念解析及评价参数摘要：系统适用性试验是分析实验测定开始前，对分析系统（包括方法、操作和仪器）是否满足测定要求进行的验证操作，如果符合要求，则可继续进行测定且其结果可靠，如果不符合要求，则需对系统进行调整或改进以满足要求，保证后续实验结果可靠。
本文论述将从多维角度讲述HPLC分析方法中系统适用性试验概念解析，以及试验评价参数，及如何确定系统适用性实验内容，如何选择计算方法等研究部分。
关键词：系统适用性、评价参数、计算方法前言：《中国药典》2015年版四部0512中关于系统适用性试验的内容为：“色谱系统的适用性试验通常包括理论板数、分离度、拖尾因子和重复性等四个参数。
按各品种正文项下要求对色谱系统进行适用性试验，即用规定的对照品溶液或系统适用性试验溶液在规定的色谱系统进行试验，必要时，可对色谱系统进行适当调整，以符合要求。
”一、系统适用性试验概念解析系统适用性试验定义，即为用规定的对照溶液或测试溶液，对仪器进行试验和调整，以确认色谱系统能满足当前检测的要求。
主要适用于色谱系统如气相色谱（GC）、高效液相色谱（HPLC）。
整个验证试验是一个风险管理的过程，是对色谱系统的风险评估，对色谱系统是否符合检测要求进行的全面评估，不只是分离度的要求。
其评价的是检测中仪器、电信号、分析操作及样品等方面的综合特性。
1.系统适用性试验评价参数《中国药典》2015年版四部0512中关于系统适用性试验的内容为：色谱系统的适用性试验通常包括理论板数、分离度、拖尾因子和重复性等四个参数。
2.1理论板数N以被分析物主峰或规定的色谱峰计算柱效，以确定色谱峰的尖锐程度，尤其在痕量组分测定中尤为重要。
理论板数高，峰高窄，则理论板数低，峰矮宽；低理论板数表明色谱条件与待测物的适用性较差，存在其他风险，如定量误差大，分离度较差等。
但随着技术发展，理论板数都较大，新开发方法较少制定该要求。
N =5.54*（tR /W1/2）2其中（dp =10μ N=5万、dp=10μ N=5万、dp——柱填料的颗粒直径，tR——保留时间，W1/2——半峰宽）2.2分离度R分离度是评价相邻峰分离程度，或内标峰与主峰的分离程度，便于定量分析时确定测定结果的准确性。
HPLC测定有关物质和含量方法验证解析
HPLC测定有关物质和含量方法验证解析HPLC（高效液相色谱法）是一种常用的分析技术，在药品分析、环境监测、食品安全等领域有着广泛的应用。
在HPLC测定有关物质和含量方法验证解析中，可以从方法验证的目的、内容和步骤等方面展开。
方法验证的目的主要是验证所采用的分析方法是否可靠、精确、准确且具有可重复性，以保证在日常分析中的可靠性和可应用性。
方法验证的内容包括系统适用性、灵敏度、线性度、准确度、精密度、稳定性等，可以通过一系列实验和分析来进行验证。
方法验证的步骤一般包括以下几个方面：1.系统适用性验证：通过对样品的系统性能参数进行验证，包括压力、回峰时间、分离度和理论板数等。
通过调整仪器条件和操作参数，使得方法能够恰当地适用于所测定的物质。
2.灵敏度验证：通过测定不同浓度的标准品，确定方法的最小测定限和最小检测限。
灵敏度的验证可以通过信噪比、回归方程等指标进行评估。
3.线性度验证：通过测定一系列浓度已知的标准品，绘制浓度与峰面积或峰高的线性关系图，确认方法的线性范围和相关系数。
4.准确度验证：通过加标回收实验，比较样品中已知添加量与实际回收量的差异，评估方法的准确度。
5.精密度验证：通过同一样品的多次测定，计算相对标准偏差（RSD）来评估方法的精密度。
6.稳定性验证：通过不同储存条件下样品的测定，包括短期和长期稳定性试验，评估方法的稳定性。
在方法验证的解析中，需要对上述步骤进行详细的数据处理和结果分析。
对于系统适用性验证，需要报告各项系统性能参数的测试结果，并说明是否符合要求；对于灵敏度验证，需要计算最小测定限和最小检测限，并评价方法的灵敏度；对于线性度验证，需要绘制线性关系图，并计算回归方程的相关系数；对于准确度和精密度验证，需要计算回收率和相对标准偏差，并进行统计学分析；对于稳定性验证，需要比较不同条件下测定结果的差异。
此外，在HPLC测定有关物质和含量方法验证解析中还需要注意的是，要同步验证色谱柱的适用性、短柱、长柱分析的差异，以及可能的干扰和修正因子等因素。
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HPLC系统性能的测试
GLP （Good Laboratory Practice）
GMP （Good Manufacturing Practice）SOPs (Standard Operating Procedures)
测试项目
梯度阶梯 (Gradient step test)
梯度线性 (Gradient linearity)
系统的滞后体积 (System dwell volume)
自动进样的重现性 (Automatic sampler
reproducibility)
流量准确度 (Flow rate accuracy)
压力衰减 (Pressure decay)
梯度阶梯 (Gradient step test)
流动相A: HPLC纯水
流动相B: 0.1% 丙酮
色谱柱：由0.005 in. i.d. 不锈钢或PEEK管代替，压力 500 psi
检测器：UV 280 nm
记录器: 用100% A 和100% B调节，使检测器输出信号与记录器相匹配。
梯度程序：流量 2 ml/min, 阶式梯度，由0-100%B, 每4分钟增加10% B。
（50% 增量为5%）
梯度线性 (Gradient linearity)
流动相A: HPLC纯水
流动相B: 0.1% 丙酮
色谱柱：由0.005 in. i.d. 不锈钢或PEEK管代替，压力 500 psi
检测器：UV 280 nm
记录器: 用100% A 和100% B调节，使检测器输出信号与记录器相匹配。
梯度程序：流量 1 ml/min, 0-100% B线性梯度 15分钟, 100% B
恒组分10 分钟。
系统的滞后体积 (System dwell volume)
t D = t50% - 0.5 t G
t D: 滞后时间（分）
t50%: 线性梯度记录中达到初始信号和终止信号差值的50%所需的时间（分）
t G：线性梯度时间（分）
V D = t D F
V D: 滞后体积（毫升）
F: 流量（毫升/分）
自动进样的重现性 (Autosampler
reproducibility)
色谱柱：C8或C18柱
色谱条件：按照色谱柱厂家的建议设置
流量准确度 (Flow rate accuracy)
流动相: HPLC纯水
色谱柱：由0.005 in. i.d. 不锈钢或PEEK管代替，压力≥500 psi
流量：1 毫升/分,冲满10毫升容量瓶所需时间：10分±2% （12秒）
压力衰减 (Pressure decay)
在储液瓶中盛有经脱气处理的纯水；
在泵的出口处用螺塞堵严；
设置小流量增加泵压至3000 psi 附近，停流；记录初始压力和10分钟时的压力
10分钟内的压力降< 15%。