细胞的破碎分析
生物分离工程5(细胞破碎技术)
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03
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生物制药
用于提取和分离药物、蛋白质 、酶等生物制品。
食品工业
用于提取植物和动物细胞中的 营养成分，如植物油、动物蛋
白等。
环境科学
用于处理废水中的有害物质， 如重金属、有机污染物等。
农业领域
用于提取植物细胞中的有用成 分，如植物激素、天然色素等
。
02
细胞破碎技术的基本原理
物理法
01
表面活性剂法
利用表面活性剂改变细胞 壁的通透性，使细胞内容 物释放出来。
有机溶剂法
利用有机溶剂如丙酮、乙 醇等溶解细胞壁，使细胞 内容物释放出来。
生物法
酶解法
利用酶如溶菌酶、蛋白酶等将细胞壁分解，使细胞内容物释 放出来。
细菌分泌的蛋白酶
利用某些细菌分泌的蛋白酶将细胞壁分解，使细胞内容物释 放出来。
细胞破碎技术的历史与发展
最早的细胞破碎技术可以追溯到19世纪末，当时人们开始使用机械研磨法破碎细胞。
随着科技的发展，出现了多种新型的细胞破碎技术，如超声波破碎、高压均质破碎、 化学渗透压破碎等。
近年来，随着生物技术的快速发展，细胞破碎技术也在不断改进和完善，以满足更 高效、环保和低成本的需求。
细胞破碎技术的应用领域
细胞破碎过程需要消耗大量的能量，这可能导致生产成本的增
加。
可能引起样品污染
02
在破碎过程中，如果设备或条件控制不当，可能会引起样品的
交叉污染或样品中原有成分的降解。
对细胞的损伤
03
高强度的破碎条件可能会对细胞内部结构造成损伤，影响后续
的分离和提取过程。
04
细胞破碎技术的应用案例
在制药行业中的应用
第四章 细胞破碎和分离技术
（一）双水相分离技术 1、双水相体系简介
1896年，荷兰微生物学家Beijerinck发现
明胶
琼脂（或可溶性淀粉）
传统的双水相体系是指高聚物双水相体系
憎水程度有所差异
2、常用双水相体系 （1）聚乙二醇(PEG)/葡聚糖； （2）聚乙二醇(PEG)/盐相（硫酸盐或者磷酸盐）
聚乙二醇(PEG) 无毒、无刺激性，具有良好的水溶性
洋葱质壁分离
2、冷冻-融化法
（1）方法：将细胞放在低温下冷冻，然后在 室温中融化，反复多次而达到破壁作用。
（2）原理：一方面破坏细胞膜的通透性，另 一方面胞内水结晶，形成冰晶粒，细胞液浓度 增高引起细胞溶胀而破裂。
大肠杆菌：可用液氮/37℃反复冻融法破壁
适用于细胞壁较脆弱的菌体，需反复 多次，速率慢，产量低，在冻融过程 中可能引起某些蛋白质变性。
举例
珠磨法 固体剪切作用 便宜 大规模处理
高压匀浆法 液体剪切作用 适中 大规模处理 超声波法 液体剪切作用 昂贵 小规模处理
（二）物理法 1、渗透压冲击法 2、冷冻-融化法
1、渗透压冲击法（最温和）
将细胞放在高渗溶液中（如高浓度蔗糖溶液），由 于渗透压的作用，细胞内水分便向外渗出，细胞发 生收缩，当达到平衡后，将细胞转入水或低渗缓冲 液中，由于渗透压的突然变化，胞外的水迅速渗入 胞内，引起细胞快速膨胀而破裂。 仅适用 2、酸处理 3、化学试剂法
1、碱处理 pH值=11.5---12.5碱处理可导致细胞溶解。
优点：价格便宜，适于任何规模 的操作，易使蛋白使活。
2、酸热法
盐酸对细胞壁中的某些成分（主要是多糖和 蛋白质）的水解作用，使细胞壁结构变疏松， 同时经沸水浴处理，细胞吸水膨胀破裂。
缺点：破壁效果差，后续处理难除HCl。
细胞破碎的技巧
细胞破碎的技巧
细胞破碎是一种常用的实验技术，用于释放和提取细胞内的蛋白质、DNA、RNA 等物质。
下面是一些常用的细胞破碎技巧：
1. 震荡法：使用震荡器或振荡器将细胞在缓冲液中震荡破碎。
这种方法适合于破碎较小数量的细胞，效果较轻微。
2. 超声波破碎法：使用超声波振荡器将细胞暴露在超声波中，超声波的能量对细胞进行破碎。
这种方法可以快速高效地破碎大量的细胞。
3. 高压法：利用高压机或高压均质器将细胞通过高压作用破碎。
这种方法适用于比较坚硬的细胞或细胞壁较厚的细胞。
4. 冷冻破碎法：将液氮浸入细胞悬液中，使细胞迅速冷冻，然后用玻璃杵或超声波破碎器打碎冷冻的细胞。
这种方法适用于需要保留细胞内部结构的实验。
5. 酶解法：使用特定的酶来破坏细胞壁或细胞膜，使细胞释放出内部的物质。
这种方法适用于特定的细胞类型和实验目的。
不同的细胞类型和实验目的可能需要不同的破碎方法，因此选择合适的方法是十分重要的。
此外，为了最大限度地保留目标物质的完整性和活性，选择合适的缓
冲液和温度条件也是非常重要的。
微生物细胞的破碎及破碎率测定1
（1） 研磨法
研磨：将细胞悬液与玻璃珠、石英砂或氧化铝一起快速 搅拌或研磨，使细胞破碎。
实验室设备：Mickle高速组织捣碎机和Braun匀浆器， 利用玻璃小珠撞击微生物细胞而破碎。
主要缺点：温度迅速升高，需冷却。 另外，较大量的细胞可用胶质磨来处理。
4. 超声波在液体中起空穴作用，使液体温度会快速 升高，可采用短时间的多次破碎，同时可补加冰 浴冷却。
思考题
1. 细胞破碎的方法有哪些？ 2. 超声波破碎细胞时应注意的问题是什么？ 3. 计算本次实验细胞破碎的破碎率。
实验步骤
1、研磨法
• 细胞培养和收集：将活化菌种接入肉汤液体培养基中， 37℃振荡培养。当到达对数少长期后(约18h)，用离心 机收集细胞，3500rpm离心20min。
• 菌体悬液的制备；取湿细胞5-10g悬浮于30ml细胞破碎 缓冲液中。
• 研磨：在研钵中加入适量石英砂，与菌悬液混合，研 磨10min。
• 超声波破碎： 800W，工作6s，间歇6s，破碎75次。 • 破碎率的测定：革兰氏染色法（初染1’、媒染1’、
脱色20-30’’、复染4’）、镜检计数。
3、酶解法
• 细胞培养和收集：将活化的巨大芽孢杆菌种接入肉汤 液体培养基中，37℃振荡培养。当到达对数少长期后 (约18h)，用离心机收集细胞，3500rpm离心20min。
例如，破碎的革兰氏阳性菌常可染色成阴性菌的颜 色，利用革兰氏染色法未受损害的酵母细胞呈现紫色， 而受损害的酵母细胞呈现亮红色。
（2）测定释放的蛋白质量或酶的活力
测定悬浮液中细胞内含物的增量来估算破碎率。 通常将破碎后的细胞悬浮液离心，测定上清液中 蛋白质的含量或酶的活力，并与100％破碎所获得的 标准数值比较。
细胞破碎方法综述
细胞破碎方法综述细胞破碎是生物学研究中一个常用的实验步骤，通过破坏细胞的结构和膜以释放细胞内部的物质和分子。
细胞破碎方法的选择取决于目标细胞类型、破碎效果和需要分析的分子。
以下是一些常用的细胞破碎方法的综述：1.高渗溶液法：高渗溶液法利用高渗溶液破坏细胞膜，使细胞的内容物释放出来。
常用的高渗溶液包括高盐溶液（如盐溶液、磷酸盐缓冲液）、高糖溶液和高pH溶液。
该方法适用于真核细胞和原核细胞的破碎，但对于一些细胞结构较为完整的细胞类型，可能需要较高的渗透压才能有效破碎。
2.壁断法：壁断法主要适用于植物细胞的破碎。
该方法利用机械切割、研磨或破碎细胞壁，使细胞的内容物释放出来。
常用的壁断法包括搅拌法、研磨法和超声波破碎法。
搅拌法通过搅拌或磨碎细胞悬液来破坏细胞壁；研磨法利用研钵、研磨棒等器械来破碎细胞壁；超声波破碎法利用超声波的高能量和高频率来破坏细胞壁。
3.酶解法：酶解法利用特定的酶来破坏细胞膜或其他细胞组分。
常用的酶包括蛋白酶、核酸酶和脂肪酶。
例如，蛋白酶可以用来降解细胞膜上的蛋白质，使细胞内容物释放出来；核酸酶可以用来降解细胞内的核酸，以便进一步分析DNA或RNA。
4.冷冻破碎法：冷冻破碎法适用于研究细胞膜和细胞器的内部结构。
该方法通过快速冷冻样本，然后在低温下破裂细胞，使细胞结构得以保持。
常用的冷冻破碎方法有冷冻磨碎法和冷冻切片法。
冷冻磨碎法利用超低温物质（如液氮）将细胞样品研磨成粉末，然后将粉末进行分析；冷冻切片法则是将细胞样品冷冻后，使用特殊的切片机将样品切成薄片，以便在电子显微镜下观察。
需要注意的是，选择适当的细胞破碎方法不仅能够高效地破碎细胞并释放目标分子，还要尽量减少可能引起蛋白质、核酸等分子降解或损坏的因素。
因此，在选择细胞破碎方法时，还需要根据研究需求仔细考虑不同方法的优缺点，并在实验中进行优化。
浅谈常用细胞破碎方法
浅谈常用细胞破碎方法随着生物技术的逐渐发展，生物所产生的各种代谢产物也逐渐被人们发现其有用的一面，但是在获得目的产物过程中，往往因为不同产物所处的生物个体不同，造成了个体差异性，所以为了获得大量，不被破坏的产物，往往针对不同生物个体选用不同的细胞破碎技术来做预处理。
现将几年来一直常用的细胞破碎技术介绍一下：关键词：细胞破碎机械法酶法（一）细胞破碎的定义1.细胞破碎（cell rupture）技术:利用外力破坏细胞膜和细胞壁，使细胞内容物包括目的产物成分释放出来的技术。
2.破碎各种细胞的主要阻力：2.1破碎细菌细胞的主要阻力：肽聚糖网状结构的致密程度和强度，取决于聚糖链上所存在的肽键的数量和其交联的程度;2.2 破碎酵母细胞的阻力:葡聚糖交联的紧密程度和它的厚度;2.3 破碎霉菌细胞的阻力:葡聚糖网状结构的交联度,几丁质或纤维素的纤维状结构。
(二) 细胞破碎的方法1.机械法1.1高压匀浆破碎法（homogenization）高压匀浆器（High pressure homogenizer）操作原理：在高压下迫使细胞浆液在排出阀的小孔中高速冲出，并射向撞击环上，使细胞受到高的液相剪切力而破碎。
操作方式：单次或多次循环出口温度：20℃左右压力：55－70Mpa适用范围：酵母和大多数细菌细胞的破碎。
料液细胞浓度：20%左右。
☆团状和丝状菌，不宜使用。
注意事项：（1）操作温度：↑２－３℃/10MPa（2）对料液作冷却处理。
（3）多组破碎操作中需要在级间设置冷却装置可有效防止温度上升，保护产物活性。
（4）较易造成堵塞的团状或丝状真菌，较小的革兰氏阳性菌以及有些亚细胞器，质地坚硬，易损伤匀浆阀，也不适合该法处理【1】。
1.2珠磨机研磨珠磨机研磨：将细胞悬浮液与玻璃小珠、石英砂或氧化铝等研磨剂一起快速搅拌，使细胞获得破碎。
工作原理：细胞的破碎是由剪切力层之间的碰撞和磨料的滚动而引起，磨室配有冷却夹套。
注意事项：操作参数较多，一般凭经验估计并且珠子之间的液体损失30%左右。
第十六章_细胞的破碎
植物细胞细胞壁的化学组成 组分
纤维素
结构和分类
β－1，4－D－葡聚糖 木葡聚糖 甘露聚糖 木聚糖
半纤维素
果胶物质 蛋白质
半乳糖醛酸聚糖 、 鼠李半乳糖醛酸聚糖 半乳聚糖和阿拉伯半乳聚糖 结构蛋白 各种酶类 凝集素
组织捣碎匀浆机
3.3 细胞壁的破碎 3.3.1 破碎率的评价
N0 N Y (%) 100% N0
机械法的缺点：
需要高的能量并且产生高温和高的剪切 力，容易使不稳定产品变性失活。
产物非专一，产生微粒尺寸范围大，分 离困难。
二、非机械法
①酶溶破碎法（enzyme lysis） ②化学破碎法（chemical treatment） ③渗透压冲击破碎法（osmotic shock） ④冻融破碎法（freezing and thawing） ⑤干燥破碎法（drying ）
②高压匀浆破碎法
操作原理:
原理：利用高压使细胞悬浮液通过针形阀， 由于突然减压和高速冲击撞击环使细胞破碎， 细胞悬浮液自高压室针形阀喷出时，每秒速 度高达几百米，高速喷出的浆液又射到静止 的撞击环上，被迫改变方向从出口管流出。 细胞在这一系列高速运动过程中经历了剪切、 碰撞及由高压到常压的变化，从而造成细胞 破碎。
超声波破碎的机理
在相当高的输入声能下，液体各个成核部位会形
成许多小气泡。在声波膨胀相中，这些气泡会增
大，而在压缩相中气泡会被压缩，直至不能再压 缩时，气泡破裂，释放出猛烈的震波。震波通过
介质传播。在气泡发生空穴现象的破碎期间，大
量声能被转化成弹性波形式的机械能，引起局部
的剪切梯度使细胞破碎。
3.3.2 细胞破碎的方法
目前已发展了多种细胞破碎方法，以便适应不同 用途和不同类型的细胞壁破碎。 破碎方法可规纳为机械法和非机械法两大类。
生物分离工程 第4章-细胞的破碎-
细胞壁的组成与结构
微生物 壁厚/nm 层次 主要组成 革兰氏阳性 细菌 20~80 单层 肽聚糖（40 ％～90％）、 多糖、胞壁 酸、蛋白质、 脂多糖（1 ％～4％） 革兰氏阴性 细菌 10~13 多层 酵母菌 100~300 多层 霉菌 100~250 多层
肽聚糖（5 葡聚糖（30 多聚糖（80 ％～10％） ％～40％） ％～90％） 脂类、蛋白质 脂蛋白、脂 甘露聚糖 多糖（11 （30％）、 ％～22％） 蛋白质（6 磷脂、蛋白 ％～8％）、 质 脂类（8.5 ％～13.5）
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为了研究细胞的破碎，提高其破碎率，有必要了解各种微 生物细胞壁的组成和结构。
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第一节 细胞壁的组成与结构
微生物细胞和植物细胞外层均为细胞壁，细胞 壁里面是细胞膜，动物细胞没有细胞壁，仅有 细胞膜。 通常细胞壁较坚韧，细胞膜脆弱，易受渗透压 冲击而破碎，因此细胞破碎的阻力主要来自于 细胞壁。 不同细胞壁的结构和组成不完全相同，故细胞 壁的机械强度不同，细胞破碎的难易程度也就 不同。
在细胞内沉积。 脂类物质和一些抗生素包含在生物体中。
对于胞内产物需要收集菌体或细胞进行破碎。
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细胞破碎的必要性
表1 胞内酶举例
酶 L-天冬酰氨酶 过氧化氢酶 胆固醇氧化酶 β-半乳糖苷酶 葡萄糖氧化酶 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶 来源 Eruinia Caratovora Escherichia Coli Aspergillus niger Nocardia hodochrous Kluyveromyces fragilis Saccharomyces lactis Aspergillus niger Penicilluim notatum Yeast 应用范围 治疗急性淋巴癌 牛奶灭菌后H2O2的清除 胆固醇浆液分析 在牛奶/乳清中乳糖的水解 作用 葡萄糖浆液分析 食品中氧的清除 临床分析
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植物细胞壁的结构
对于已生长结束的植物细胞壁可分为初生壁和次生壁 两部分。 初生壁是细胞生长期形成的。初生壁一般较薄（1～ 3μm），富有弹性。 初生壁由多糖和蛋白质构成，多糖主要成分为纤维素、 半纤维素和果胶类物质。纤维素是长链D-葡聚糖，许 多这样的长链形成微纤丝。 微纤丝是构成植物细胞壁的骨架，细胞壁的机械强度 主要来自于微纤丝。
图1 革兰氏菌细胞壁结构图
（a）革兰氏阳性菌 （b）革兰氏阴性菌
酵母的细胞壁结构
最里层是由葡聚糖的细纤维组成，它构成了 细胞壁的刚性骨架，使细胞具有一定的形状； 上面的是一层糖蛋白； 最外层是甘露聚糖，由 1,6- 磷酸二酯键连接 成网状。在该层的内部，有甘露聚糖-酶的复 合物。 破碎酵母细胞壁的阻力主要决定于壁结构交 联的紧密程度和它的厚度。
细胞壁的组成与结构
微生物 壁厚/nm 层次 主要组成 革兰氏阳性 细菌 20~80 单层 肽聚糖（40 ％～90％）、 多糖、胞壁 酸、蛋白质、 脂多糖（1 ％～4％） 革兰氏阴性 细菌 10~13 多层 酵母菌 100~300 多层 霉菌 100~250 多层
肽聚糖（5 葡聚糖（30 多聚糖（80 ％～10％） ％～40％） ％～90％） 脂类、蛋白质 脂蛋白、脂 甘露聚糖 多糖（11 （30％）、 ％～22％） 蛋白质（6 磷脂、蛋白 ％～8％）、 质 脂类（8.5 ％～13.5）
本章的主要内容
常见的细胞壁结构
细胞破碎技术
概述
不同类型细胞生产目标产物的类型：
动物细胞多分泌到细胞外培养液 植物细胞多为胞内产物 微生物（细菌/酵母/霉菌等）胞内、胞外
概述
大多数情况下，抗生素，胞外酶，一些多糖，
及氨基酸等目标产物存在于发酵液中。
有些目标产物存在于细胞内的。 尤其是由基因工程菌产生的大多数蛋白质是
第三章 细胞的破碎
生物分离过程的一般流程
原料液 预处理和固液分离 细胞－胞内产物 路线一B 包含体 溶解(加盐酸胍、脲) 复性 细胞破碎 碎片分离 粗分离(盐析、萃取、超过滤等) 纯化(层析、电泳) 脱盐(凝胶过滤、超过滤) 浓缩(超过滤) 精制(结晶、干燥) 路线一 路线二 清液－胞外产物
路线一A
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细胞破碎（cell disruption）技术是指利用外力破坏细 胞膜和细胞壁，使细胞内容物包括目的产物成分释放出来 的技术。 细胞破碎技术是分离纯化细胞内合成的非分泌型生化物质 （产品）的基础。 随着重组DNA技术和组织培养技术上的重大进展，以前认 为很难获得的蛋白质现在可以大规模生产，但是很多产物 是在细胞内表达的。 为了提高细胞的破碎率，有必要了解各种微生物细胞壁的 组成和结构。
植物次生细胞壁
某些植物细胞，当生长停止后，在细胞质和 初生细胞壁之间形成了次生细胞壁。次生壁一般 较厚(4μ m以上)，常有三层组成。 在次生壁中，纤维素和半纤维素含量比初生 壁增加很多，纤维素的微纤丝排列得更紧密和有 规则，而且存在木质素的沉积。 次生壁的形成提高了细胞壁的坚硬性，使植 物细胞具有很高的机械强度。
红面包霉菌细胞壁具有同心圆层 状结构主要存在三种聚合物 最外层 (a) 是α- 和β- 葡聚糖的 混合物， 第2层(b)是糖蛋白的网状结构 第3层(c)主要是蛋白质， 最内层(d)主要是几丁质。
红面包霉菌细胞壁的结构示意图
微生物细胞壁的形状、强度取决于细胞壁的 组成以及它们之间相互关联的程度。 交联程度取决于连接细胞壁网状结构的共价 键。同时，也受到微生物的遗传信息、培养条件、 菌龄、外界环境等的影响。
图2 酵母细胞壁的结构示意图
M—甘露聚糖； P—磷酸二酯键； G—葡聚糖
霉菌的细胞壁
霉菌的细胞壁较厚，主要由多糖组成，其次还 含有较少量的蛋白质和脂类。 不同的霉菌，细胞壁的组成有很大的不同，其 中大多数霉菌的多糖壁是由几丁质和葡聚糖构 成，少数含纤维素。 与酵母和细菌的细胞壁一样，霉菌细胞壁的强 度和聚合物的网状结构有关，不仅如此，它还 含有几丁质或纤维素的纤维状结构，所以强度 有所提高。
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第一节 细胞壁的组成与结构
• 微生物细胞和植物细胞外层均为细胞壁，细胞 壁里面是细胞膜，动物细胞没有细胞壁，仅有 细胞膜。 通常细胞壁较坚韧，细胞膜脆弱，易受渗透压 冲击而破碎，因此细胞破碎的阻力主要来自于 细胞壁。
不同种类细胞的细胞壁结构和组成不完全相同， 故机械强度不同，细胞破碎的难易程度也就不 同。
Aspergillus niger
Nocardia hodochrous Kluyveromyces fragilis Saccharomyces lactis Aspergillus niger Penicilluim notatum Yeast
牛奶灭菌后H2O2的清除
胆固醇浆液分析 在牛奶/乳清中乳糖的水解 作用 葡萄糖浆液分析 食品中氧的清除 临床分析
在细胞内沉积。 脂类物质和一些抗生素存在于细胞内部。
对于胞内产物需要收集菌体或细胞进行破碎。
表1 胞内酶举例
酶 L-天冬酰氨酶 来源 Eruinia Caratovora Escherichia Coli 应用范围 治疗急性淋巴癌
过氧化氢酶
胆固醇氧化酶 β-半乳糖苷酶 葡萄糖氧化酶 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶
蔗糖酶
青霉素酰化酶
Saccharomyces Cerevisiae
Escherichia Coli
糖果、蜜饯
苄青霉素的脱酰作用
表2 几种由大肠杆菌表达的胞内重组药物
药物名 胰岛素 人生长激素（HGH） α-干扰素 宿主 大肠杆菌 大肠杆菌 大肠杆菌 用途 治疗糖尿病 治疗侏儒病 治疗毛状细胞白血 病和卡波济肉瘤
细菌细胞壁结构
几乎所有细菌的细胞壁都是 由肽聚糖组成，它是难溶性 的聚糖链； 相邻聚糖链上的短肽又交叉 相联，构成了细胞壁的三维 网状结构，包围在细胞周围；
使细胞具有一定的形状和强 度。
细菌细胞壁结构
破碎细菌的主要阻力是来自于肽聚糖的网状结构， 其网结构的致密程度和强度取决于聚糖链上所存 在的肽键的数量和其交联的程度。网状结构越致 密，破碎的难度越大。 革兰氏阴性菌的细胞壁结构与革兰氏阳性菌有很 大不同。革兰氏阴性细菌网状结构不及革兰氏阳 性细菌的坚固。 革兰氏阴性菌典型的生物是大肠杆菌，通过这种 细胞生产了很多细胞重组的产物。