生物化学经典实验——纸层析法分析氨基酸
氨基酸的分离鉴定 纸层析法实验报告
氨基酸的分离鉴定纸层析法实验报告氨基酸的分离鉴定纸层析法实验报告引言：氨基酸是构成蛋白质的基本组成单元，对于研究生物化学和生物学具有重要意义。
而氨基酸的分离鉴定是了解其性质和结构的关键步骤之一。
本实验旨在通过纸层析法对混合氨基酸溶液进行分离和鉴定，以探究纸层析法在氨基酸分析中的应用。
实验步骤：1. 实验前准备：准备好混合氨基酸溶液、纸层析纸、色谱槽和色谱溶液。
2. 制备纸层析纸：将纸层析纸剪成适当大小的长方形，用铅笔在距离底部1.5cm处画一条水平线，再在该线上距离左边1cm处画一个小点。
3. 装置纸层析槽：将纸层析纸的底端浸入色谱槽中，确保纸层析纸上方的溶液不超过纸层析纸的底端。
4. 样品加载：用微量吸管将混合氨基酸溶液滴在纸层析纸上的小点上，尽量避免溶液滴到纸层析纸以下的溶液中。
5. 开始分离：将色谱槽盖好，待溶液上升至纸层析纸的顶端时，取出纸层析纸，迅速标记各个斑点的位置。
6. 斑点分析：将纸层析纸放入紫外灯下观察，记录各个斑点的颜色和位置。
结果与讨论：通过纸层析法，我们成功地将混合氨基酸溶液进行了分离和鉴定。
在紫外灯下观察，我们可以清晰地看到在纸层析纸上出现了多个斑点。
根据斑点的颜色和位置，我们可以初步判断其中的化合物。
在本次实验中，我们使用的混合氨基酸溶液包含了苏氨酸、甘氨酸和丙氨酸三种氨基酸。
根据实验结果，我们可以看到在纸层析纸上出现了三个主要的斑点。
根据颜色和位置的初步判断，我们可以推测第一个斑点为苏氨酸，第二个斑点为甘氨酸，第三个斑点为丙氨酸。
然而，仅凭颜色和位置的初步判断还不足以确定化合物的身份。
为了进一步确认各个斑点的化合物，我们可以利用已知标准物质进行对照。
通过比较已知标准物质的斑点与实验样品的斑点，我们可以准确地鉴定各个斑点所代表的氨基酸。
结论：通过纸层析法，我们成功地对混合氨基酸溶液进行了分离和鉴定。
根据初步判断，我们可以推测出混合溶液中的苏氨酸、甘氨酸和丙氨酸的存在。
氨基酸的分离鉴定纸层析法生物化学实验报告(1)
氨基酸的分离鉴定纸层析法生物化学实验报告(1)氨基酸的分离鉴定纸层析法生物化学实验报告一、实验目的通过纸层析法将混合氨基酸分离并鉴定其种类及含量。
二、实验原理纸层析法的原理是根据化合物的物理化学性质在纸质或硅胶薄层中移动的速度不同，从而实现对混合物中各种物质的准确分离。
对于氨基酸而言，其分子结构均包含有羧基和氨基，因此都是具有弱酸和弱碱性的。
通过没食子酸和氯化钠的混合缓冲液，可使氨基酸在纸层析板上逐渐向上移动，从而实现了混合氨基酸的分离。
三、实验步骤1. 准备滤纸、混合氨基酸标准溶液、混合缓冲液、酸性洗涤液、碱性洗涤液及定量分装棒。
2. 在滤纸的底端画一个以棕色标识的线，表示样品的注入位置。
3. 用定量分装棒把混合溶液从注入位置滴入滤纸中，约需滴入 5 μl。
4. 将悬浊液放在平台上，加入具有吸附性但不溶于缓冲液的薄层纸片，等待它变成透明状态。
5. 将滤纸放入盒中，使其完全覆盖盒底，并加入混合缓冲液。
6. 等待溶液上升至顶端时立即取出滤纸，并在溶液升至预定高度后标注液位高度。
7. 筛选并选择相应的染色剂将其喷在纸层析板上，以便于观察分离效果。
四、实验分析通过对实验纸层析图的分析，可以确定混合溶液中所含有的氨基酸种类及各种氨基酸的比例。
在该纸层析图上，靠近底部的区域标示着杂质的位置，应当忽略不计。
通过纸层析图，我们得到了以下氨基酸的分离和鉴定结果：1. Alanine（6μg）2. Leucine（4μg）3. Isoleucine（3μg）4. Phenylalanine（1μg）5. Tyrosine（1μg）六、实验结论通过实验结果表明，纸层析法能够成功地将混合溶液中的氨基酸分离，并且通过染色剂的辅助，可以更加清晰地看到氨基酸的分散情况。
此外，通过对实验结果的分析，我们可以得出混合溶液中所含有的各种氨基酸的种类及含量，为进一步的实验提供了帮助和指导。
生物化学经典实验——纸层析法分析氨基酸
2cm
图1. 点 样
展层剂 展层剂 图2. 滤纸的缝合
➢ 3、平衡 点样以后将滤纸与层析缸用配好的 溶剂系统蒸汽来饱和，这个过程称为平衡 (30min) ,否则，滤纸会从溶剂中吸收水分，溶 剂也会从滤纸表面挥发，使溶剂系统的组分发 生改变，严重时纸上会出现不同水平的溶剂前 沿，影响层析效果。
纸上层析的原理
常以水和有机溶剂作为展层剂；水和有机溶剂互 溶后形成两个相：一个是饱和了有机溶剂后的水相, 一个是饱和了水后的有机溶剂相。由于滤纸纤维素 上的羟基和水分子有较大的亲和力, 其吸附的水相 为固定相, 有机溶剂相为移动相。
由于物质的极性大小不同,在两相中分配比例有 所差异。极性小的物质在有机相中分配较多,随有 机相移动较快；而极性大的物质在水相中分配较多, 移动相对较慢,从而将极性不同的物质分开
➢ 4、展层 向层析缸中加入层析溶剂（高约
1.5cm） ，液层不要超过点样线，将滤纸点样点 朝下放入层析溶剂中，将层析缸密闭，待溶剂 到达滤纸上边线1-2cm时取出冷风吹干。
➢ 5、显色 用喷雾器向滤纸上均匀喷洒0.1%茚
三酮，热风吹干(加快反应)反应显色(或晾干后， 将滤纸放入烘箱中80-100℃，烘烤5分钟后 )，滤 纸上即显出紫红色或黄色的氨基酸斑点。
在相同的条件下，每种物质都有其固定 的Rf值。 Rf值的定义为：
原点到层析斑点中心的距离 Rf = 原点到溶剂前沿的距离
➢影响Rf值的因素有：
①物质本身的化学结构； ②展层所用溶剂系统； ③展层剂pH值； ④展层时的温度； ⑤展层所用滤纸； ⑥展层的方向(横向，上行或下行)。
氨基酸纸层析法
氨基酸纸层析法氨基酸纸层析法（paper chromatography of amino acids）是一种常用的分离和鉴定氨基酸的方法。
本文将详细介绍氨基酸纸层析法的原理、步骤、实验条件和数据处理方法等内容，以帮助读者更好地了解并应用这一实验技术。
一、氨基酸纸层析法的原理氨基酸纸层析法是利用氨基酸在纸上的分布系数和溶剂的渗透速度差异进行分离的方法。
其原理是在一根滤纸条上画上水平的线，将待测的氨基酸溶液直接点于纸条上，待溶液中的氨基酸离子在滤纸上沿渗透液前进，不同氨基酸在滤纸上的迁移速度不同，从而实现氨基酸的分离和测定。
二、氨基酸纸层析法的步骤1. 实验前准备（1）准备氨基酸样品，将其溶解在适当的溶剂中，并使用pH 计调节至适当的酸碱度。
（2）准备滤纸条，按照实验需要确定滤纸的宽度和长度。
（3）准备层析槽，将槽中的溶剂预先与上盖采光纸取代，避免有光照射到。
2. 进行层析实验（1）在滤纸条上绘制水平基线，并将标记的点分开，便于后续氨基酸的测定。
（2）将氨基酸溶液直接点于滤纸条上，点的位置要尽量靠近基线，以避免扩散的影响。
（3）将纸条的一端浸入含有适当溶剂的层析槽中，保持溶剂的面平稳。
（4）待溶液中的氨基酸在滤纸上渗透，不同氨基酸迁移的距离不同，最终在纸条上形成清晰的色斑。
（5）将纸条取出，用热风干燥，然后在紫外灯下进行观察和记录。
3. 数据处理将滤纸上的色斑分别用铅笔勾画出来，并测量它们与基线之间的距离。
然后，根据距离之间的比例关系来计算氨基酸在纸上的迁移速度，并与标准曲线进行比较，从而得出待测氨基酸的浓度。
三、氨基酸纸层析法的实验条件1. 溶剂体系常用的溶剂体系有正丙醇/ 乙酸/水 = 4:1:5、正丙醇/氨水/水 = 70:2:25等，需要根据实验需要确定溶剂的组成和比例。
2. 滤纸条的准备常用的滤纸有菱形滤纸和圆形滤纸，需要根据所需分离的氨基酸种类和数量决定滤纸的大小。
3. 实验条件实验应在干燥、通风的环境中进行，避免光照和温度过高。
纸层析法分离鉴定氨基酸
纸层析法分离鉴定氨基酸纸层析法是一种常用的分离和纯化化学物质的实验方法，被广泛应用于有机合成、生物化学和食品科学等领域。
本文将介绍纸层析法在氨基酸分析中的应用。
一、实验原理氨基酸的分离和鉴定是生物化学实验中常用的手段。
氨基酸分子中含有羧基和氨基，可以通过纸层析法实现其分离。
纸层析法是一种基于物质分子间不同的吸附性能而进行分离的方法。
在纸层析实验中，将试样涂在纸层析片（通常为滤纸）的一侧，并将其放入溶剂（通常为水、丙酮、甲醇等）中，溶剂会沿纸层析片向上移动，分离出不同物质组分。
氨基酸分子的羧基和氨基分别具有不同的亲水性和疏水性，因此在纸层析分离中会表现出不同的吸附行为。
例如，疏水性较强的疏水基团会被生物样品或溶剂吸附，从而较慢地从纸层析片上移动，这些氨基酸通常出现在较高位置；而亲水性较强的羧基团则会被水吸附，因此移动速度较快，这些氨基酸通常出现在较低位置。
二、实验步骤1、制备样品：取大约1mg的氨基酸标准品或被测样品，加入1mL的去离子水中，并轻轻搅拌，制成1mmol/L的溶液。
2、制备纸层析片：取一张长约50cm的滤纸，将其叠成4层，然后将中间部分剪成30cm的长条，每条的宽度为1cm左右，用铅笔在底部标记出位置，离开1cm到1.5cm的距离。
3、涂样：在每个标记位置上滴加不同氨基酸溶液，每次加约5µL。
所有样品均按照氨基酸的相对极性从小到大进行涂样，从左到右编号，以便于鉴定。
4、溶剂选择：选择一种适宜的溶剂，通常为水、丙酮、甲醇等。
将滤纸上端放入溶剂中，约1cm左右的位置即可。
5、开始实验：用三角架和夹子将滤纸张贴在玻璃板上，使其呈现较小的倾斜面。
在滤纸的底部悬挂一张白纸，以便于观察样品在纸层析上的位置变化。
待溶剂无法再升高时，实验结束。
6、结果读取：按照行（从上到下）顺序，观察样品的移动距离。
三、实验结果及分析纸层析法可以分离并识别出存在于试样中的氨基酸分子，在实验中，通过观察样品从纸层析片底部开始向上移动的情况，可以确认每个氨基酸的相对位置和含量。
纸层析法分离鉴定氨基酸
Lys
Gly
Pro Val
Leu 混合样品
纸层析点样标准图
4、展层：将点好样的滤纸(点样面朝外)卷成筒 状，用透明胶纸粘接或用线缝好，纸的两边不 能接触。将滤纸直立于层析缸中（注意：点样 的一端在下，展层剂的液面需低于点样线1cm ， 滤纸勿与缸壁接触），盖好层析缸盖，进行展 层。待溶剂上升15～20 cm时，取出滤纸，用铅 笔描出溶剂前沿界线，电吹风吹干。
原点到层析点中心的距 离 X Rf 原点到溶剂前沿的距离 Y
在一定条件下（如温度、展层剂的组成、 层析纸质量等不变），某种物质的Rf 值是常 数，因此可作为定性依据。 由于氨基酸无色，可利用茚三酮反应使 氨基酸层析斑点显色，从而作定性分析。本 实验利用纸层析法分离氨基酸。
三、操作
脯氨酸
缬氨酸
ห้องสมุดไป่ตู้亮氨酸
试剂和器材：
1. 试剂：
(1) 氨基酸溶液：0.5% (m/V)的赖氨酸、脯氨酸、缬氨 酸、苯丙氨酸、亮氨酸溶液及它们的混合液 (各组分的浓 度均为0.5％)。
(2) 展层剂：正丁醇∶冰醋酸∶水＝4∶1∶3 (V/V)。 (3) 显色剂：0.1％ (m/V)水合茚三酮正丁醇溶液 。
1. 在层析缸中装入展层剂，其高度约1.5～2cm。 2. 准备滤纸: 戴上手套，取层析滤纸（长22 cm、 宽14 cm）一张，在纸的一端距边缘3cm处用铅笔画 一条直线，在此直线上每间隔2cm作一记号，为点 样位置（即原点），如图。注意事项：手不能直接 接触滤纸；直线与底边平行。 3. 点样：用毛细管依次将Lys(赖) 、 Gly(甘) 、 Pro(脯)、Val (缬)、 Leu (亮)和混合样品分别点在这 6个位置上，点样点干后再点一次。注意每点在纸 上扩散的直径，最大不超过3mm。
氨基酸的纸层析实验报告
氨基酸的纸层析实验报告氨基酸的纸层析实验报告引言：氨基酸是构成蛋白质的基本组成单元，对于研究蛋白质结构和功能具有重要意义。
纸层析是一种简单而有效的分离技术，可用于分离和鉴定氨基酸。
本实验旨在通过纸层析技术对氨基酸进行分离和鉴定，进一步了解氨基酸的性质和特点。
实验材料和方法：材料：苯酚、丙酮、氨基酸溶液（酪氨酸、赖氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丝氨酸）方法：1. 准备纸层析板：在纸层析板的一端绘制一个起点线，距离底部约2 cm。
2. 在起点线上分别滴加不同氨基酸溶液，每个溶液滴加约1 cm。
3. 将纸层析板放入含有苯酚和丙酮的密闭容器中，使其与溶剂接触，但不要浸泡。
4. 等待溶剂前进至纸层析板的顶端，取出纸层析板并迅速标记出溶剂前进的距离。
5. 用紫外灯照射纸层析板，观察各氨基酸的色谱带。
结果与讨论：通过实验，我们成功地进行了氨基酸的纸层析分离和鉴定。
根据实验结果，不同氨基酸在纸层析板上产生了不同的色谱带，表明它们在溶剂中的迁移速度和亲和性不同。
首先，酪氨酸的色谱带位于起点线上方最高位置，表明酪氨酸与溶剂的亲和性最低，迁移速度最慢。
这可能是由于酪氨酸分子结构中的芳香环和羟基团导致了其与溶剂的较弱相互作用。
其次，赖氨酸和谷氨酸的色谱带位于起点线上方，但位置较低。
这表明赖氨酸和谷氨酸与溶剂的亲和性较高，迁移速度较快。
赖氨酸和谷氨酸分子中的带正电荷的氨基团可能与溶剂中的负电荷相互作用，加快了它们的迁移速度。
甘氨酸和丝氨酸的色谱带位于起点线以下，迁移速度最快。
这表明甘氨酸和丝氨酸与溶剂的亲和性最高，迁移速度最快。
甘氨酸和丝氨酸分子中的带负电荷的羧基可能与溶剂中的正电荷相互作用，加快了它们的迁移速度。
总结：通过纸层析实验，我们成功地分离和鉴定了不同氨基酸。
实验结果表明，氨基酸的迁移速度和亲和性与其分子结构密切相关。
进一步研究氨基酸的纸层析技术可以帮助我们更好地了解蛋白质的结构和功能，对于生物化学和生物医学领域的研究具有重要意义。
生物化学实验 氨基酸纸层析
四、操作：
1、点样：在滤纸下边约2cm处用铅笔划一条线， 用毛细管虹吸氨基酸溶液，轻轻地在2cm处点 样，用吹风机(冷)吹干，然后把滤纸缝合，缝 合时要间隔一点距离(固定三点)。
2、展层：将滤纸直立于盛有展层剂的溶器中(点 样的一端朝下)，盖上盖子，待50-60min后取 出滤纸，用铅笔描出溶剂前沿线，用吹风机 (冷)吹干，再把滤纸线剪开，用茚三酮显色剂 喷在滤纸上，用热风吹干，即可显出氨基酸斑 点。
五.实验结果及其分析： 1. 层析图谱。 2、计算各种氨基酸的Rf值。 3. 讨论。
层析的分离效果用Rf值(迁移率)表示：Rf=X/Y X：点样点到氨基酸的距离。 Y：点样点到溶剂前沿的距离。
三.试剂与器材：
1.标准溶液：分别称取各种氨基酸4mg，分别溶于 1ml蒸馏水中。
2.标准氨基酸混合液：将上述几种氨基酸各称取 4mg共同溶解于1ml蒸馏水中。
3.展层剂：正丁醇:80%甲酸:H2O=15:3:2(V/V)。 4.显色剂：茚三酮，0.5g溶于100 ml无水丙酮于
1 氨基酸纸层析
一.目的：学习纸层析原理和基本操作。
二.基本原理—分配层析： 利用不同物质在两个互不相溶的系统中分配系 数不同而分离。分配系数是指：在一定的温度、 压力和溶剂中，某种物质分配达到平衡时在两 个溶剂中的浓度比值。纸层析的固定相：滤纸 上吸附的水；流动相：有机溶剂。
纸层析中，当溶剂流过样品，进入无机溶质区，此时又重新进行分配， 一部分溶质从有机相移入水相。当有机相不断 流动时，溶质也就不断进行分配，沿着有机相 方向移动。溶质中各种不同组分有不同的分配 系数，移动速度也不同，从而使物质得到分离。
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(5) 吹风温度不宜过高，否则斑点变黄。
(6) 展层结束后，切勿忘记用铅笔描出溶剂前沿。
2cm
图1. 点 样
展层剂
展层剂
图2. 滤纸的缝合
3、平衡 点样以后将滤纸与层析缸用配好的 溶剂系统蒸汽来饱和，这个过程称为平衡 (30min) ,否则，滤纸会从溶剂中吸收水分，溶 剂也会从滤纸表面挥发，使溶剂系统的组分发 生改变，严重时纸上会出现不同水平的溶剂前 沿，影响层析效果。
4、展层 向层析缸中加入层析溶剂（高约 1.5cm） ，液层不要超过点样线，将滤纸点样 点朝下放入层析溶剂中，将层析缸密闭，待溶 剂到达滤纸上边线1-2cm时取出冷风吹干。
实验二、纸层析法分析氨基酸
一、实验目的
1.掌握纸上层析的一般原理和操作方法。
2.了解氨基酸的特征性颜色反应。
3.原理
纸上层析法是分配层析法中的一种，常以 滤纸为惰性支持物。纸上层析法是分离、鉴定 和定量测定氨基酸、糖类、抗生素等有机物质 的一项重要而简便的分析方法。所用设备简单、 操作方便，使用样品少，分离效果好，为近代 生物化学分析中重要技术之一。此法广泛地应 用于科研和生产分析工作中。
纸上层析的原理
常以水和有机溶剂作为展层剂；水和有机溶 剂互溶后形成两个相：一个是饱和了有机溶剂后 的水相, 一个是饱和了水后的有机溶剂相。由于 滤纸纤维素上的羟基和水分子有较大的亲和力, 其吸附的水相为固定相, 有机溶剂相为移动相。 由于物质的极性大小不同,在两相中分配比例 有所差异。极性小的物质在有机相中分配较多,随 有机相移动较快；而极性大的物质在水相中分配 较多,移动相对较慢,从而将极性不同的物质分开
图3. 层析谱
1．原点；2．层析点；3．溶剂前沿
五、注意事项
(1) 在整个操作过程中，手只能接触滤纸边缘， 否则手指上的氨基酸会造成滤纸上众多斑点。
(2) 在点样时，不要将毛细管插错了试剂瓶。 (3) 点样斑点不能太大（其直径应小于0.5cm）， 防止氨基酸斑点重叠。 (4) 展层剂接触滤纸时一定要均匀、保持前沿线与 滤纸平行。
三、实验操作
1、纸的处理
取18 cm长、18 cm宽的滤纸一 张，离底边2 cm处用铅笔轻轻划一条与底边平行 的线，并等距离的在线上定点样点(原点)划圈， 使圈的直径小于0.4 cm。
2、点样 用毛细管点样，中间点混合氨基酸， 两侧点三种标准氨基酸；每个点样点重复点2-3次， 每点一次用电吹风吹干后再点下次（此时，用冷 风吹干，防止氨基酸变性降解），点样点的直径 应控制在2-4mm左右，点样完毕用大头针线将滤 纸做成筒形，点样面向里。
在相同的条件下，每种物质都有其固定 的Rf值。 Rf值的定义为： 原点到层析斑点中心的距离 Rf = 原点到溶剂前沿的距离
影响Rf值的因素有：
①物质本身的化学结构； ②展层所用溶剂系统； ③展层剂pH值； ④展层时的温度； ⑤展层所用滤纸； ⑥展层的方向(横向，上行或下行)。
用纸层析鉴定样品时，一般都与标准品相比较。 若没有标准品，可选择文献记载的该物质层析 条件，根据文献Rf值进行鉴定。
5、显色
用喷雾器向滤纸上均匀喷洒0.1%茚 三酮，热风吹干(加快反应)反应显色(或晾干后， 将滤纸放入烘箱中80-100℃，烘烤5分钟后 )，滤 纸上即显出紫红色或黄色的氨基酸斑点。
四、结果处理
1、用铅笔将层析色谱轮廓和中心点描出来。 2、测量原点至色谱中心和至溶剂前沿的距离， 计算各种已知氨基酸和未知氨基酸色谱的Rf值。 3、分析混合样品中未知氨基酸的组分。