石蜡包埋技术要点总结
石蜡块包埋组织怎么用，一文就够了
石蜡块包埋组织怎么用，一文就够了目前，随着高通量基因和生物信息学发展，常见的高端文章要么是冷冻电镜解析一个结构（大爆发，华人学者一周内发表10篇CNS 主刊！），要么就是大批临床标本的大规模测序识别突变和表达信息（简讯：太牛了！测了2000多肿瘤样本的circRNA数据，怪不得发Cell！）。
实验技术越来越先进，实验思路越来越跨界，而做实验的学生们则越来越迷茫。
为此，本文尝试“温故而知新”，选取了一个最普通基础的主题：石蜡块，来做一次相关内容的汇总。
图源：网络一、组织石蜡块的准备与制作用于制作石蜡块的组织要新鲜，组织固定液为10%中性福尔马林，固定液体积最好为组织体积的10倍以上，如果低于5倍或者只是液体浸没组织，则会导致组织固定不充分，只是表面固定，内部组织随着时间会腐烂，影响结果。
经福尔马林固定的组织并不是能够长时间保存，需要在72小时内尽快完成石蜡块的包埋为最佳，以保证组织蛋白的表达结果不受实验偏倚影响。
如果不能在数天内完成下一步的石蜡块包埋，最好能在4度冰箱冷藏保存，而不宜常温保存。
石蜡块的包埋需要经过脱水和浸蜡。
脱水的质量好坏直径影响后期组织与蜡的相互融合。
此外，石蜡原材料的原则也是至关重要，面对不同的组织，需要动态调整石蜡成分，韧性高的实质组织，可以采用高熔点的石蜡块，而像肠壁和腺体等柔软的组织，可以选较低熔点的石蜡块。
此外，包埋石蜡块的底座平整与否直接影响了标本切片时的损耗。
所以，这里提醒一点：同样的石蜡块组织，可能由于石蜡块底部的坑洼，导致修片过程中大量的损耗了组织。
二、常用制作石蜡块途径（如果是大佬课题组，请直接跳过这段。
）1. 自制优点：几乎没有额外费用，即做即用。
缺点：国内大部分中小规模的实验室或者课题组并没有配套相应石蜡块制作设备。
2. 石蜡块制作外包的选择目前大部分的课题所需石蜡块均为外包途径。
而外包对象主要有两种：专门实验技术公司和大学基础医学病理相关的服务支持。
如何选择呢？专门公司制作石蜡块，第一速度快，毕竟以利益为驱动；第二服务好，一个电话，就可以像寄快递一样，足不出户，上门收货上门送货；第三具有服务行业的优点，除外可能威胁直接经济利益的，其他配套服务，比如提供咨询和配套材料均会免费，毕竟现在国内的专门实验技术公司尚处于市场开展阶段，没有浓重的官僚气或者垄断局面。
石蜡包埋技术
石蜡包埋技术制作石蜡切片，切片前须将石蜡渗透组织包埋于石蜡中，而水与石蜡又是不相混合的，所以在浸蜡，包埋前必须将组织内所含的水分脱去。
而大多数的组织固定剂是水溶液，随后的水冲洗也使其含有大量水分，因此必须先行脱水，一般是浸入逐级增加浓度的酒精来完成。
由于酒精和石蜡不能混合，须再用一种石蜡的溶剂来置换酒精，因大多数石蜡溶剂有使组织的折光率增高并表现为透明或半透明状，所以此步骤又称透明。
最后用石蜡浸渍组织并铸制成坚实的蜡块。
常规的石蜡包埋过程包括五个基本步骤，即固定，脱水，透明，浸蜡和包埋，前一章中已述过固定。
第一节脱水脱水就是用脱水剂完全除去组织内的水分，为下一步透明及浸蜡创造条件。
此外，脱水还可以使组织再次发生一定的硬化，脱水剂必须是与水在任何比例下均能混合的液体。
一．常用的脱水剂1．酒精：是制片最常用的试剂，可与水在任何比例下相混合，酒精的脱水能力比较强，又能硬化组织。
但是酒精的船头速度很快，对于组织会有明显的收缩作用。
因此在以酒精作为脱水剂时，应该先从浓度较低的酒精开始，然后递增其浓度，这样可以避免组织过度收缩。
第一瓶酒精浓度随固定剂，脱水组织的大小和种类而异，经水溶性固定剂固定的细柔组织需要慢慢脱水，从50％酒精开始。
如眼球，组胚组织等大多数组织标本则是从70％酒精开始，再经80％，95％以至无水酒精。
但是有时为了某种特殊要求，例如要做糖元的切片标本或是要做尿酸结晶染色切片标本，为了防止糖元和尿酸结晶在水中消失却要直接投入无水酒精中固定，而不需要经过水洗和低浓度酒精的脱水过程。
经无水酒精固定后的组织只需要再经过换一次无水酒精脱水即可。
用AAF固定液固定的组织可直接置于95％酒精开始脱水。
用醇性固定剂（如Carnoy）则可置于高浓度无水酒精内，但应多次换液以除酸。
一般情况下，组织经过70％，80％，90％，95％，以至无水酒精的脱水程序，即可达到脱水的要求。
但是为了能使大量的组织块同时进行脱水，则要求保持液体的浓度以保证脱水的作用，最好是以两次95％酒精，两次100％酒精重复进行脱水，以保证组织的水分脱净。
组织块石蜡包埋
组织块石蜡包埋的步骤：1.取材：尽量活杀，在处死30min内取材完毕，组织块的大小一般为（1.0-1.5cm）*1.0cm*(0.2-0.3cm)2.固定：常用甲醛液浓度为4%，是40%甲醛溶液和水按1:9比例配制而成。
固定时间以12-24h为宜。
（4℃冰箱可放置1-3个月）3.冲洗：将组织块放在固定的容器中用流水冲洗24h.4.脱水：一次70%酒精2h, 80%酒精2h, 90%酒精1h, 95%酒精40min,无水乙醇Ⅰ40min,无水乙醇Ⅱ30min。
可将组织放于70%酒精中过夜。
5.透明：将脱水后组织直接浸入二甲苯透明剂中（二甲苯Ⅰ, 二甲苯Ⅱ），每次透明为10min。
6.浸蜡：常规制片常用熔点高于56℃以上的石蜡，普通采用56℃-58℃石蜡。
先将组织浸入软蜡Ⅰ1h左右, 再浸入软蜡Ⅱ40min；硬蜡Ⅰ40min, 硬蜡Ⅱ1h。
（一般浸蜡时间为3-4h）软蜡熔点为45℃-50℃，硬蜡熔点为55℃-60℃。
7.包埋：将蜡液注入包埋硬具中，迅速将组织块平放入蜡液中，摆正并铺平，然后移至冷却台，使组织块同蜡液凝固在一起的过程。
（硬蜡凝固定型）石蜡切片法：在切片前应先切去标本周围过多的石蜡（此过程称为“修块”），但也不能留得太少，否则易造成组织破坏，连续切片时分片困难。
一般切片厚度为4-6μm。
贴片时先在干净的载玻片上涂一层蛋白甘油，然后于60℃恒温箱中烘烤1h，若未烤干可适当延长时间；若组织剥脱可涂一层蛋清加以固定。
做免疫组化时，玻片应涂多聚赖氨酸，亦可买防脱玻片。
HE染色的步骤：二甲苯Ⅰ5-10min→二甲苯Ⅱ5-10min→无水乙醇Ⅰ1-3min→无水乙醇Ⅱ1-3min→90%酒精1min→80%酒精1min→70%酒精1min→水洗→苏木精3-5min→水洗→盐酸酒精1-3s→水洗→饱和碳酸锂（氨水）10-30s→水洗→伊红3-5min→水洗（短）→70%酒精1-2s→80%酒精3-5min→90%酒精3-5min→95%酒精3-5min→无水乙醇5-10min→二甲苯Ⅰ3-5min→二甲苯Ⅱ3-5min→中性树胶封片染色液的配制：1.Harris苏木精的配制苏木精 1g硫酸铝钾 15g无水乙醇 10ml蒸馏水 200ml先用蒸馏水加热溶解硫酸铝钾，用无水乙醇溶解苏木精再倒入已溶解的硫酸铝钾蒸馏水中，煮沸1min后，稍冷却，慢慢加入红色氧化汞0.5g，继续加热至染液变为紫红色，用纱布盖瓶口，用滤纸过滤后每100ml加冰醋酸5ml。
常规的石蜡包埋过程包括五个基本步骤
常规的石蜡包埋过程包括五个基本步骤，即固定，脱水，透明，浸蜡和包埋制作石蜡切片，切片前须将石蜡渗透组织包埋于石蜡中，而水与石蜡又是不相混合的，所以在浸蜡，包埋前必须将组织内所含的水分脱去。
而大多数的组织固定剂是水溶液，随后的水冲洗也使其含有大量水分，因此必须先行脱水，一般是浸入逐级增加浓度的酒精来完成。
由于酒精和石蜡不能混合，须再用一种石蜡的溶剂来置换酒精，因大多数石蜡溶剂有使组织的折光率增高并表现为透明或半透明状，所以此步骤又称透明。
最后用石蜡浸渍组织并铸制成坚实的蜡块。
常规的石蜡包埋过程包括五个基本步骤，即固定，脱水，透明，浸蜡和包埋，前一章中已述过固定。
第一节脱水脱水就是用脱水剂完全除去组织内的水分，为下一步透明及浸蜡创造条件。
此外，脱水还可以使组织再次发生一定的硬化，脱水剂必须是与水在任何比例下均能混合的液体。
一．常用的脱水剂1．酒精：是制片最常用的试剂，可与水在任何比例下相混合，酒精的脱水能力比较强，又能硬化组织。
但是酒精的船头速度很快，对于组织会有明显的收缩作用。
因此在以酒精作为脱水剂时，应该先从浓度较低的酒精开始，然后递增其浓度，这样可以避免组织过度收缩。
第一瓶酒精浓度随固定剂，脱水组织的大小和种类而异，经水溶性固定剂固定的细柔组织需要慢慢脱水，从50％酒精开始。
如眼球，组胚组织等大多数组织标本则是从70％酒精开始，再经80％，95％以至无水酒精。
但是有时为了某种特殊要求，例如要做糖元的切片标本或是要做尿酸结晶染色切片标本，为了防止糖元和尿酸结晶在水中消失却要直接投入无水酒精中固定，而不需要经过水洗和低浓度酒精的脱水过程。
经无水酒精固定后的组织只需要再经过换一次无水酒精脱水即可。
用AAF固定液固定的组织可直接置于95％酒精开始脱水。
用醇性固定剂（如Carnoy）则可置于高浓度无水酒精内，但应多次换液以除酸。
一般情况下，组织经过70％，80％，90％，95％，以至无水酒精的脱水程序，即可达到脱水的要求。
石蜡包埋的基本步骤及注意事项
石蜡包埋的基本步骤和注意事项第一部分石蜡包埋的基本步骤一、脱水脱水就是用脱水剂完全除去组织内的水分，为下一步透明及浸蜡创造条件。
此外，脱水还可以使组织再次发生一定的硬化，脱水剂必须是与水在任何比例下均能混合的液体。
一．常用的脱水剂1．酒精：是制片最常用的试剂，可与水在任何比例下相混合，酒精的脱水能力比较强，又能硬化组织。
但是酒精的船头速度很快，对于组织会有明显的收缩作用。
因此在以酒精作为脱水剂时，应该先从浓度较低的酒精开始，然后递增其浓度，这样可以避免组织过度收缩。
第一瓶酒精浓度随固定剂，脱水组织的大小和种类而异，经水溶性固定剂固定的细柔组织需要慢慢脱水，从50％酒精开始。
如眼球，组胚组织等大多数组织标本则是从70％酒精开始，再经80％，95％以至无水酒精。
但是有时为了某种特殊要求，例如要做糖元的切片标本或是要做尿酸结晶染色切片标本，为了防止糖元和尿酸结晶在水中消失却要直接投入无水酒精中固定，而不需要经过水洗和低浓度酒精的脱水过程。
经无水酒精固定后的组织只需要再经过换一次无水酒精脱水即可。
用AAF固定液固定的组织可直接置于95％酒精开始脱水。
用醇性固定剂（如Carnoy）则可置于高浓度无水酒精内，但应多次换液以除酸。
一般情况下，组织经过70％，80％，90％，95％，以至无水酒精的脱水程序，即可达到脱水的要求。
但是为了能使大量的组织块同时进行脱水，则要求保持液体的浓度以保证脱水的作用，最好是以两次95％酒精，两次100％酒精重复进行脱水，以保证组织的水分脱净。
脱水时间应视组织种类，组织块大小，厚薄和固定剂的不同而异。
如脱钙的骨组织，实质性脏器等的脱水过程宜短，而疏松结缔组织，脂肪组织等，脱水过程则宜适当延长。
水分必须脱干净，脂肪必须溶去。
含有铬酸的固定剂固定的组织，脱水时间不宜过长，而镀银组织更应注意，脱水时间应比为镀银的同类组织要短。
脱水的基本原则：从低浓度酒精开始逐渐升到高浓度酒精，以保持组织中的水分完全脱净。
(完整word版)石蜡包埋的基本步骤及注意事项
石蜡包埋的基本步骤和注意事项第一部分石蜡包埋的基本步骤一、脱水脱水就是用脱水剂完全除去组织内的水分，为下一步透明及浸蜡创造条件。
此外，脱水还可以使组织再次发生一定的硬化，脱水剂必须是与水在任何比例下均能混合的液体。
一．常用的脱水剂1．酒精：是制片最常用的试剂，可与水在任何比例下相混合，酒精的脱水能力比较强，又能硬化组织。
但是酒精的船头速度很快，对于组织会有明显的收缩作用。
因此在以酒精作为脱水剂时，应该先从浓度较低的酒精开始，然后递增其浓度，这样可以避免组织过度收缩。
第一瓶酒精浓度随固定剂，脱水组织的大小和种类而异，经水溶性固定剂固定的细柔组织需要慢慢脱水，从50％酒精开始。
如眼球，组胚组织等大多数组织标本则是从70％酒精开始，再经80％，95％以至无水酒精。
但是有时为了某种特殊要求，例如要做糖元的切片标本或是要做尿酸结晶染色切片标本，为了防止糖元和尿酸结晶在水中消失却要直接投入无水酒精中固定，而不需要经过水洗和低浓度酒精的脱水过程。
经无水酒精固定后的组织只需要再经过换一次无水酒精脱水即可。
用AAF固定液固定的组织可直接置于95％酒精开始脱水。
用醇性固定剂（如Carnoy）则可置于高浓度无水酒精内，但应多次换液以除酸。
一般情况下，组织经过70％，80％，90％，95％，以至无水酒精的脱水程序，即可达到脱水的要求。
但是为了能使大量的组织块同时进行脱水，则要求保持液体的浓度以保证脱水的作用，最好是以两次95％酒精，两次100％酒精重复进行脱水，以保证组织的水分脱净。
脱水时间应视组织种类，组织块大小，厚薄和固定剂的不同而异。
如脱钙的骨组织，实质性脏器等的脱水过程宜短，而疏松结缔组织，脂肪组织等，脱水过程则宜适当延长。
水分必须脱干净，脂肪必须溶去。
含有铬酸的固定剂固定的组织，脱水时间不宜过长，而镀银组织更应注意，脱水时间应比为镀银的同类组织要短。
脱水的基本原则：从低浓度酒精开始逐渐升到高浓度酒精，以保持组织中的水分完全脱净。
组织石蜡包埋和塑料包埋技术
一、石蜡包埋技术石蜡包埋技术制作石蜡切片，切片前须将石蜡渗透组织包埋于石蜡中，而水与石蜡又是不相混合的，所以在浸蜡、包埋前必须将组织内所含的水分脱去。
常规的石蜡包埋过程包括5 个基本步骤、即固定、脱水、透明、浸蜡和包埋。
1.脱水用脱水剂完全除去固定好的组织内的水分，为下一步透明及浸蜡创造条件，还可使组织再次形成一定的硬化。
一般情况下组织需经过75％，85％，95％，100% 乙醇的脱水程序。
脱水时间视组织种类，组织块大小，厚薄和固定剂的不同确定。
脱水一定要充分、彻底。
2.透明纯乙醇不能与石蜡相溶，还需用能与乙醇和石蜡相溶的媒浸液，替换出组织内的乙醇。
组织在这类媒浸液中浸渍，出现透明状态，此液即称透明剂，透明剂浸渍过程称透明。
二甲苯和氯仿是常用的透明剂。
组织在氯仿和二甲苯中不宜放置过久，否则会造成组织脆硬，不利切片。
3.浸蜡组织经透明剂的透明作用之后，移入熔化的石蜡内浸渍，石蜡逐渐浸入组织间隙，取代透明剂，这一程序就叫浸蜡。
根据所用石蜡的熔点，浸蜡需要在60 ～62℃温箱内进行。
为了尽可能排除透明剂，浸蜡可以分两缸进行。
浸蜡时间应根据组织种类，组织块大小，厚薄确定，一般为1 ～4 h。
4.包埋是将已经经过固定、脱水、透明、浸蜡的组织块从最后的蜡浴取出，置入充满熔化石蜡的包埋框内，包埋成块，使组织和包埋剂相熔一体并迅速冷却，这个程序称为包埋。
包埋剂凝固后，进一步加强了组织的硬度和韧度而便于进行切片。
全自动石蜡包埋机包埋组织，采用金属包埋框盒。
通常石蜡采用熔点为60 ～62℃，包埋机设定温度64 ～65℃，先把组织材料放置于金属包埋框底，石蜡放满于金属包埋框内，组织用弯头镊子平整调整到底部，若镊子上的石蜡凝固，在乙醇灯上烤（温度不宜过高，以石蜡熔化为宜，否则将损坏组织）。
组织长径尽量与包埋框盒长径垂直，在石蜡表面发白时，放置塑料蜡块托（边上用铅笔标记病理号），按四角压紧。
待石蜡完全凝固后取出组织蜡块。
石蜡包埋技术
石蜡包埋技术制作石蜡切片，切片前须将石蜡渗透组织包埋于石蜡中，而水与石蜡又是不相混合的，所以在浸蜡，包埋前必须将组织内所含的水分脱去。
而大多数的组织固定剂是水溶液，随后的水冲洗也使其含有大量水分，因此必须先行脱水，一般是浸入逐级增加浓度的酒精来完成。
由于酒精和石蜡不能混合，须再用一种石蜡的溶剂来置换酒精，因大多数石蜡溶剂有使组织的折光率增高并表现为透明或半透明状，所以此步骤又称透明。
最后用石蜡浸渍组织并铸制成坚实的蜡块。
常规的石蜡包埋过程包括五个基本步骤，即固定，脱水，透明，浸蜡和包埋，前一章中已述过固定。
第一节脱水脱水就是用脱水剂完全除去组织内的水分，为下一步透明及浸蜡创造条件。
此外，脱水还可以使组织再次发生一定的硬化，脱水剂必须是与水在任何比例下均能混合的液体。
一．常用的脱水剂1．酒精：是制片最常用的试剂，可与水在任何比例下相混合，酒精的脱水能力比较强，又能硬化组织。
但是酒精的船头速度很快，对于组织会有明显的收缩作用。
因此在以酒精作为脱水剂时，应该先从浓度较低的酒精开始，然后递增其浓度，这样可以避免组织过度收缩。
第一瓶酒精浓度随固定剂，脱水组织的大小和种类而异，经水溶性固定剂固定的细柔组织需要慢慢脱水，从50％酒精开始。
如眼球，组胚组织等大多数组织标本则是从70％酒精开始，再经80％，95％以至无水酒精。
但是有时为了某种特殊要求，例如要做糖元的切片标本或是要做尿酸结晶染色切片标本，为了防止糖元和尿酸结晶在水中消失却要直接投入无水酒精中固定，而不需要经过水洗和低浓度酒精的脱水过程。
经无水酒精固定后的组织只需要再经过换一次无水酒精脱水即可。
用AAF固定液固定的组织可直接置于95％酒精开始脱水。
用醇性固定剂（如Carnoy）则可置于高浓度无水酒精内，但应多次换液以除酸。
一般情况下，组织经过70％，80％，90％，95％，以至无水酒精的脱水程序，即可达到脱水的要求。
但是为了能使大量的组织块同时进行脱水，则要求保持液体的浓度以保证脱水的作用，最好是以两次95％酒精，两次100％酒精重复进行脱水，以保证组织的水分脱净。
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• 在制作切片或超薄切片时，由于组织是柔 软的，或局部的软硬不均，这样制作厚薄 均匀的切片是困难的。所以有必要用一定 物质浸透组织内部，整个组织一样硬化， 以利于切成薄片，这种物质叫做包埋剂。 一股用光学显微镜观察的切片，用石蜡、 火棉胶、炭蜡、明胶等作包埋剂；电子显 微镜则用环氧树脂、聚苯乙烯树脂、异丁 烯树脂及水溶性树脂。
• （八）切片 用切片机（如旋转切片机）将蜡块切成连 续的蜡带。切片时先把切片刀夹在刀架上， 再把载蜡器夹在固定装置上（注意安装切 刀的角度，刀口运行方向与材料切面平 行），然后调整好所需厚度，一般可在 7~14微米，视材料和所需观察对象而定， 转动切片机切片。
具体流程
• 1 脱水： • 多聚甲醛中取出组织，流水冲洗数分钟→70% 乙醇 （2h,可延长过夜）→85%乙醇(2h) →95%乙醇Ⅰ (1h)→95%乙醇Ⅱ(1h) →无水乙醇Ⅰ (30min)→无水乙 醇Ⅱ (30min)。 • 注：1若组织数量过多时，应分开脱水（20个组织 左右） • 2脱水的体积至少为组织体积的5倍 • 3乙醇纯度越高时，脱水的时间减少，否则引起 组织过硬 • 4 最好能搅拌，使脱水充分。
• （二）杀死与固定 利用药剂迅速把细胞杀死，以保持材料本 来的状态和结构。 • （三）脱水 脱水的目的是除去组织中的水分，便于透 明、浸蜡、包埋等步骤的进行，因为这些 程序中所用的药品都不能与水混合，所以 必须脱水。常用的脱水剂为酒精。脱水过 程应缓慢进行，不能操之过急或时间过长， 以免组织变硬变脆或发生收缩现象。脱水 采用等级脱水（系列脱水），即从较低浓 度酒精开始，逐渐替换到高浓度酒精。
程序
• （一）材料的采集与分割 采集材料应根据制片的目的和要求而定，材料 要有代表性，无病虫害或其它损伤，如要观察 病理解剖，则要取病斑、病症部位。采下的材 料应立即放在标本箱或湿布包起来带回实验室 进行分割固定（如有条件也可在试验地采集后 进行分割固定）。为使固定液能迅速的渗透材 料，材料要进行分割。分割时动作要迅速，以 防材料萎蔫。分割块的大小，宜小不宜大，一 般不超过1、沉床） 材料浸蜡后再换两次已熔融的纯蜡，然后 将材料和石蜡一起倒入提前叠好的包埋模 具中，用加热的镊子迅速将材料按一定的 间隔和所需的切面摆放整齐，同时用加热 的镊子赶走材料周围的气泡，待模具表面 的石蜡凝固后将纸盒平放入冷水中，使石 蜡迅速凝固。最后从模具中取出蜡块，以 便保存。注意将样品编号封于蜡块上，以 免样品混淆。
• 注：包埋时，切忌用手按石蜡盒中间，因 为冷凝后，中间仍较软。何师兄放到— 40℃冰箱使其快速凝固。 •
• （四）透明 透明的目的是将脱水剂从材料中除去，使 材料透明，增记折光系数；同时便于下步 的浸蜡和包埋等程序（因为究竟不能溶解 石蜡）。透明剂是一种既能与脱水剂混合， 又能与包埋剂混合的药剂。常用的透明剂 为二甲苯。
• （五）浸蜡 浸蜡的目的是逐渐除去透明剂,并为包埋剂 所代替。常用的包埋剂是石蜡。浸蜡过程 是使石蜡慢慢溶于浸有材料的透明剂中， 溶解在透明剂中的石蜡渐渐深入到材料的 细胞中去，最后使透明剂完全被石蜡取代， 以便切片。
• 2 透明： • 二甲苯Ⅰ → 二甲苯Ⅱ ，每步15min. • 注：在二甲苯的时间不宜过短或过长。时 间过短引起透明不充分，影响后面渗透包 埋；时间过长则引起组织变脆。 • 3 渗透： • 石蜡Ⅰ (15-20min)→石蜡Ⅱ (20-30min)→石 蜡Ⅲ(包埋),62℃。
• 4 包埋：
• 将组织放入盛有石蜡的模具中，摆好位置， 于石蜡包埋机的冷台上冷却。