组织块石蜡包埋
组织石蜡包埋和切片技术
组织石蜡包埋和切片技术包埋剂embedding agent在制作切片或超薄切片时，由于组织是柔软的，或局部的软硬不均，这样制作厚薄均匀的切片是困难的。
所以有必要用一定物质浸透组织内部，整个组织一样硬化，以利于切成薄片，这种物质叫做包埋剂。
一股用光学显微镜观察的切片，用石蜡、火棉胶、炭蜡、明胶等作包埋剂；电子显微镜则用环氧树脂、聚苯乙烯树脂、异丁烯树脂及水溶性树脂。
石蜡制片法是将材料经固定、脱水、透明、浸蜡后包埋在石蜡里面进行切片的方法。
此法适用范围，制片手段完备，能将材料切成极薄的片子（可切至2-8微米左右），并能制成连续的片子，这是其它制片法难以达到的，因此在光学显微镜的制片技术上它是最常用的一种方法。
除了一些经不住石蜡切片法中所应用的各种药剂处理的材料不能应用石蜡切片以外，一般的材料都可以用此法制片，但有制作时间较长，操作过程复杂以及材料易发硬或发脆等缺点。
该法多采用旋转式切片机进行切片。
石蜡制片操作程序如下：（一）材料的采集与分割采集材料应根据制片的目的和要求而定，材料要有代表性，无病虫害或其它损伤，如要观察病理解剖，则要取病斑、病症部位。
采下的材料应立即放在标本箱或湿布包起来带回实验室进行分割固定（如有条件也可在试验地采集后进行分割固定）。
为使固定液能迅速的渗透材料，材料要进行分割。
分割时动作要迅速，以防材料萎蔫。
分割块的大小，宜小不宜大，一般不超过1cm3，分割后立即杀死固定。
（二）杀死与固定利用药剂迅速把细胞杀死，以保持材料本来的状态和结构。
常用的固定有F.A.A固定液、卡诺固定液等。
将固定液放在具塞小瓶中，投入材料，盖好瓶盖。
用F.A.A 固定液固定，时间至少24小时。
F.A.A固定液既是良好的固定剂，也是保存剂，因此材料可长期保存在固定液中备用。
卡诺固定液穿透力强，固定较小材料一般1~6小时即可，最多不超过24小时。
因卡诺固定液不能做保存剂，所以固定后要用95%、85%酒精浸洗，每级约20min.，然后保存在70%的酒精中备用。
石蜡块包埋组织怎么用，一文就够了
石蜡块包埋组织怎么用，一文就够了目前，随着高通量基因和生物信息学发展，常见的高端文章要么是冷冻电镜解析一个结构（大爆发，华人学者一周内发表10篇CNS 主刊！），要么就是大批临床标本的大规模测序识别突变和表达信息（简讯：太牛了！测了2000多肿瘤样本的circRNA数据，怪不得发Cell！）。
实验技术越来越先进，实验思路越来越跨界，而做实验的学生们则越来越迷茫。
为此，本文尝试“温故而知新”，选取了一个最普通基础的主题：石蜡块，来做一次相关内容的汇总。
图源：网络一、组织石蜡块的准备与制作用于制作石蜡块的组织要新鲜，组织固定液为10%中性福尔马林，固定液体积最好为组织体积的10倍以上，如果低于5倍或者只是液体浸没组织，则会导致组织固定不充分，只是表面固定，内部组织随着时间会腐烂，影响结果。
经福尔马林固定的组织并不是能够长时间保存，需要在72小时内尽快完成石蜡块的包埋为最佳，以保证组织蛋白的表达结果不受实验偏倚影响。
如果不能在数天内完成下一步的石蜡块包埋，最好能在4度冰箱冷藏保存，而不宜常温保存。
石蜡块的包埋需要经过脱水和浸蜡。
脱水的质量好坏直径影响后期组织与蜡的相互融合。
此外，石蜡原材料的原则也是至关重要，面对不同的组织，需要动态调整石蜡成分，韧性高的实质组织，可以采用高熔点的石蜡块，而像肠壁和腺体等柔软的组织，可以选较低熔点的石蜡块。
此外，包埋石蜡块的底座平整与否直接影响了标本切片时的损耗。
所以，这里提醒一点：同样的石蜡块组织，可能由于石蜡块底部的坑洼，导致修片过程中大量的损耗了组织。
二、常用制作石蜡块途径（如果是大佬课题组，请直接跳过这段。
）1. 自制优点：几乎没有额外费用，即做即用。
缺点：国内大部分中小规模的实验室或者课题组并没有配套相应石蜡块制作设备。
2. 石蜡块制作外包的选择目前大部分的课题所需石蜡块均为外包途径。
而外包对象主要有两种：专门实验技术公司和大学基础医学病理相关的服务支持。
如何选择呢？专门公司制作石蜡块，第一速度快，毕竟以利益为驱动；第二服务好，一个电话，就可以像寄快递一样，足不出户，上门收货上门送货；第三具有服务行业的优点，除外可能威胁直接经济利益的，其他配套服务，比如提供咨询和配套材料均会免费，毕竟现在国内的专门实验技术公司尚处于市场开展阶段，没有浓重的官僚气或者垄断局面。
石蜡包埋技术实验报告
一、实验目的1. 掌握石蜡包埋技术的基本原理和操作步骤。
2. 熟悉石蜡包埋在组织切片制作过程中的重要作用。
3. 了解石蜡包埋技术在病理诊断、科研等领域的应用。
二、实验原理石蜡包埋技术是一种常用的组织切片制备方法，其基本原理是将组织固定、脱水、透明、浸蜡后，将其包埋在石蜡中，形成硬化的组织块，便于后续的切片和染色等操作。
石蜡具有较好的透明度和可塑性，且与组织切片易于分离，有利于显微镜观察。
三、实验材料1. 新鲜组织样本：如肿瘤组织、正常组织等。
2. 固定液：4%多聚甲醛溶液。
3. 脱水剂：75%酒精、85%酒精、90%酒精、95%酒精、无水乙醇I、无水乙醇II、醇苯、二甲苯I、二甲苯II、蜡I、蜡II、蜡III。
4. 包埋剂：石蜡。
5. 切片机：石蜡切片机。
6. 其他：手术刀、剪刀、镊子、载玻片、盖玻片、烘箱、显微镜等。
四、实验步骤1. 组织固定：将新鲜组织样本放入4%多聚甲醛溶液中固定24小时以上。
2. 取材：将固定好的组织从固定液中取出，用手术刀将目的部位组织修平整，并切取适当大小的组织块。
3. 脱水：将组织块依次放入75%酒精、85%酒精、90%酒精、95%酒精、无水乙醇I、无水乙醇II中，每个酒精浓度处理1小时。
4. 透明：将组织块放入醇苯中处理5-10分钟，再放入二甲苯I中处理5-10分钟，最后放入二甲苯II中处理5-10分钟。
5. 浸蜡：将组织块放入石蜡I中处理1小时，再放入石蜡II中处理1小时，最后放入石蜡III中处理1小时。
6. 包埋：将浸好蜡的组织块放入包埋模具中，待蜡凝固后取出，修整蜡块。
7. 切片：将修整好的蜡块置于石蜡切片机上，切片厚度约为4微米。
8. 摊片：将切片漂浮于摊片机40℃温水上，将组织展平，用载玻片将组织捞起，并放进60℃烘箱内烤片。
9. 脱蜡：将烤干的切片依次放入二甲苯30分钟、无水乙醇10分钟、95%酒精5分钟、90%酒精5分钟、80%酒精中处理。
10. 染色：将脱蜡后的切片进行HE染色或其他染色。
组织石蜡包埋切片和HE染色的基本流程
3.切片经酒精脱水后，入二甲苯时可出现白色不透明状态，此为脱水不彻底，应将切片退回无水酒精，更换酒精、二甲苯，以求彻底脱水与透明。
4.在染色过程中不要让切片干燥，以免切片收缩、变形，影响神经元形态。
5.切片从二甲苯取出或进入二甲苯前，切片周边均应擦干净或吸干多余水要选大于组织块的面积，如漏出一部分不久将会褪色，所用树脂浓度要适当，树脂封固时不能有气泡。
苏木精—伊红染色法简称HE染色法，它是最常用的普通染色方法。苏木精（hematoxylin）是阳离子染料，将细胞核内的嗜碱性物质染成蓝紫色。伊红（eosin）是阴离子染料，将细胞质和胶原纤维等染成粉红色。
12、80%乙醇5min
13、伊红液（95%乙醇溶液）3~30seconds
14、95%乙醇Ⅰ1min
Ⅱ5min
15、无水乙醇Ⅰ5min
Ⅱ5min
16、二甲苯+乙醇（1：1）5min
17、二甲苯Ⅰ5min
Ⅱ5min
Ⅲ5min
18、中性树胶封片。
HE染色注意事项：
1.染色时调节pH值很重要。如果组织块在福尔马林中固定时间长，组织酸化而影响细胞核着色。因此，要在自来水中冲洗时间长一些或在饱和碳酸锂水溶液中处理10-30min，这样可以使细胞核着色较深。染伊红时胞浆着色不佳，可在伊红溶液中滴加1-2滴冰醋酸。
Ⅱ5min
3、95%乙醇Ⅰ5min
Ⅱ5mn
4、80%乙醇5min
5、70%乙醇5min
6、D．W．3~5min
7、Harris苏木素液5min（冬天可适当延长，eg.20min）
石蜡包埋步骤
心肌组织石蜡包埋与切片
多聚甲醛配制：
1×PBS + 4%多聚甲醛（PH值7.2-7.4）
1×PBS：Na
2HPO
4
.12H
2
O 2.88g
NaH
2PO
4
.2H
2
O 0.296g
NaCl 8.5g
定容至1L。
熔蜡过程：
新蜡块最好提前放入烤箱，反复凝熔3次以上，再做浸蜡包埋。
1)大鼠心室经4%多聚甲醛固定24h以上，将组织放入包埋框内，用铅笔做
好标记；
2)将包埋框与组织一起放入0.01M PBS，震荡冲洗30min×2次；
3) 弃去PBS，心脏组织经乙醇梯度脱水：75%乙醇4h，80%乙醇4h，95%乙醇Ⅰ2h，95%乙醇Ⅱ2h，100%乙醇Ⅰ1h 20min，100%乙醇Ⅱ1h 40min；
4) 二甲苯透明：二甲苯：乙醇（1:1）10min，二甲苯Ⅰ20min，二甲苯Ⅱ20min；
5) 浸蜡：石蜡Ⅰ40min，石蜡Ⅱ2h；石蜡I、石蜡II与包埋蜡反复凝固融化3次，浸蜡时温度控制在56-60 ℃。
6) 石蜡包埋：将熔化的石蜡（注意保持石蜡密度的均一性）倒入包埋框，用加热的镊子将浸蜡后的组织块放入包埋框内，温度控制在56-60℃（整个操作过程尽可能快），待石蜡凝固后取下石蜡块准备切片；
7) 切片：每个标本取10张切片，切片厚度为5μm左右。
将切片铺于预先用多聚赖氨酸包被的载玻片上，60℃置于烤片机中烘烤60min。
染色前将切片置于37℃烤箱中过夜或60℃ 2h。
《病理检验技术》课件——石蜡包埋组织切片
石蜡包埋组织切片
7.若天气太冷，切片时组织蜡片容易碎裂，对着组织蜡块面 呵一口气后进行切片，可改善组织蜡片容易碎裂的情况，但 所切出的第一、二张组织蜡片厚度会比原来设定的切片厚度 稍厚一些，因此，前一、二张切出的组织蜡片不要。
石蜡包埋组织切片
6.调节切片刀的切片角度：切片机刀座上都有标 示切片刀切片角度的刻度，切片前需调节切片刀 至合适的切片角度，才能切好片。通常切片机上 刀座刻度范围为0°～10°，一般设定切片刀的 角度在8°左右为宜。但真正的切片角度是余隙 角。 所谓余隙角是指切片刀下刀锋倾斜面与组织蜡块 面的夹角。余隙角避免了切片时切片刀往返过程 中刀与组织蜡块面之间的摩擦。最理想的余隙角 是2°～4°，太大或太小都不能切好片。
3.如用金属框包埋组织蜡块，必须把四边修整平行，否 则在切片时会切出弯曲的组织蜡片带。
4.切片用毛笔应选用松软毛的水彩画笔，清扫切片刀上 的蜡屑时应顺着刀背往刀锋扫，避免刀锋切割笔毛，损 坏刀锋。
石蜡包埋组织切片
5.切片时转动切片手轮或推拉切片刀的动作要轻， 用力均匀。若用力太猛和速度太快，将会引起切片 压缩，也易导致轮转式切片机齿轮的磨损。
病理检验技术
石蜡包埋组织切片
石蜡包埋组织切片
组织石蜡切片 石蜡包埋组织切片
石蜡包埋组织切片
送检组织经过固定、 脱水、透明、浸蜡和 石蜡包埋制成组织蜡 块后即可马上进行切 片，称石蜡包埋组织 切片，简称石蜡切片。
石蜡包埋组织切片
一、石蜡切片操作过程
1.组织蜡块排序、冷冻：按病理号排序，先切在 前；蜡块组织面朝下放在一盘平整的冰块或冷冻 台上冷冻（-4～0℃）几分种后开始切片。
石蜡包埋和冰冻包埋实验步骤
1.取材固定:离体的组织不及时固定，组织就会自溶，抗原就会扩散。
固定就是加入一些可以让蛋白质变性的物质(比如说甲醛)，使得蛋白质的结构被固定住，不再发生变化，同时也不会再发生一些活性反应，这样才好做后续的染色步骤。
常见固定液是4%的多聚甲醛和饱和苦味酸。
根据不同目的、组织特征代表性取材。
取的材料应该小而薄。
便于固定剂迅速渗入内部，一般厚度不超过2mm，大小不超过5X 5mm"。
每个组织最好多切几块。
新鲜组织固定(组织块不宜太大太厚，这样固定液很难进入里面，可能会导致在较短的时间内脱水不完全，引起一系列的问题，比如浸蜡不彻底，切片不好完成，切不完整。
导致后来切片染色的脱落，造成染色的失败。
组织块也不能太小，否则不能保证切片数量，且透明时间和浸蜡时间不能很好的把握。
)固定时间因固定剂种类而异，大多6-12 小时，一般不超过12小时。
视组织固定的难易程度而定。
后续如果做免疫组化，不应超过12小时;后续如果做HE染色，不应超过24小时。
固定完之后用水洗(目的:洗去渗入组织的固定液，终止固定以免影响对组织的内结构的观察，分析。
换液两次，一次半小时。
) 之后可直接脱水包埋或放入75%的乙醇4度可长期保存。
2.脱水从75%的乙醇中取出，分别放到80%，90%，100%( I )的乙醇中30min，再放入100%乙醇中。
固定完直接水洗包埋的，应从70%乙醇开始，易碎组织从50%乙醇开始。
组织脱水时间不应过长，尤其是高浓度乙醇，要特别注意控制时间。
3.透明透明的目的是置换组织内的脱水剂，为下一步浸蜡起到桥梁作用，二甲苯可以去除脂肪。
乙醇+-二甲苯(1:1) 2h；二甲苯(I )，二甲苯(II)各10min(根据组织的大小和透明的难易程度不同，透明的时间可以根据具体情况调整。
颜色浅的组织表面油亮，可以透过光时效果较好，颜色较深的组织至少边缘可以透光。
)4.浸蜡浸蜡目的是置换组织中的透明剂，为包埋作准备。
二甲苯+石蜡(1:1)2h；石蜡(I)1h;石蜡(II)2h.(浸蜡的时间也可以长一些)5.包埋在冰盒上进行，将融好的纯蜡(最好提前4小时以上开始融蜡，新蜡更难融)，倒入蜡盒(可以浸没组织就行，大约蜡盒的三分之一)由于蜡盒底部与冰盒接触，底部的蜡会先凝固，这样就可以把组织用镊子夹住立在底部。
石蜡包埋原理
石蜡包埋原理
石蜡包埋是一种常用的组织学技术，它可以帮助保护组织结构，使细胞和组织得以保存，为后续的切片和染色提供了可靠的基础。
石蜡包埋的原理主要包括脱水、透明化、浸渍和包埋四个步骤。
首先，脱水是石蜡包埋的第一步，它的目的是去除样本中的水分，使细胞和组织的结构得以保持。
脱水通常采用乙醇逐渐浓度升
高的方法进行，乙醇能够逐渐取代细胞和组织中的水分，使其逐渐
脱水。
脱水的过程需要严格控制时间和温度，以免对细胞和组织结
构造成损伤。
接下来是透明化步骤，透明化是在脱水之后进行的，其目的是
使细胞和组织透明化，为后续的浸渍和包埋做准备。
透明化通常采
用二甲苯或氯仿等有机溶剂进行，这些溶剂能够逐渐取代细胞和组
织中的乙醇，使其逐渐透明化。
透明化的过程同样需要严格控制时
间和温度，以免对细胞和组织结构造成影响。
浸渍是石蜡包埋的第三步，它是将样本逐渐浸入熔化的石蜡中，使细胞和组织与石蜡充分接触，最终被包裹在石蜡中。
浸渍的过程
需要控制石蜡的温度和浸渍时间，以免石蜡温度过高或浸渍时间过
长导致样本变性或破坏。
最后是包埋步骤，包埋是将经过脱水、透明化和浸渍处理的样本，置于包埋模具中，加入熔化的石蜡，使其充分包裹样本，形成石蜡块。
包埋的石蜡块可以为后续的切片提供支撑，并保护细胞和组织结构不受切割时的损伤。
总的来说，石蜡包埋的原理是通过脱水、透明化、浸渍和包埋四个步骤，使细胞和组织得以保存，并为后续的切片和染色提供可靠的基础。
这一技术在组织学研究和临床诊断中具有重要意义，对于保护细胞和组织结构，保证样本质量具有不可替代的作用。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
组织块石蜡包埋的步骤：
1.取材：尽量活杀，在处死30min内取材完毕，组织块的大小一般为（1.0-1.5cm）
*1.0cm*(0.2-0.3cm)
2.固定：常用甲醛液浓度为4%，是40%甲醛溶液和水按1:9比例配制而成。
固定时间
以12-24h为宜。
（4℃冰箱可放置1-3个月）
3.冲洗：将组织块放在固定的容器中用流水冲洗24h.
4.脱水：一次70%酒精2h, 80%酒精2h, 90%酒精1h, 95%酒精40min,无水乙醇Ⅰ40min,
无水乙醇Ⅱ30min。
可将组织放于70%酒精中过夜。
5.透明：将脱水后组织直接浸入二甲苯透明剂中（二甲苯Ⅰ, 二甲苯Ⅱ），每次透明
为10min。
6.浸蜡：常规制片常用熔点高于56℃以上的石蜡，普通采用56℃-58℃石蜡。
先将组
织浸入软蜡Ⅰ1h左右, 再浸入软蜡Ⅱ40min；硬蜡Ⅰ40min, 硬蜡Ⅱ1h。
（一般浸蜡
时间为3-4h）软蜡熔点为45℃-50℃，硬蜡熔点为55℃-60℃。
7.包埋：将蜡液注入包埋硬具中，迅速将组织块平放入蜡液中，摆正并铺平，然后移
至冷却台，使组织块同蜡液凝固在一起的过程。
（硬蜡凝固定型）
石蜡切片法：
在切片前应先切去标本周围过多的石蜡（此过程称为“修块”），但也不能留得太少，否则易造成组织破坏，连续切片时分片困难。
一般切片厚度为4-6μm。
贴片时先在干净的载玻片上涂一层蛋白甘油，然后于60℃恒温箱中烘烤1h，若未烤干可适当延长时间；若组织剥脱可涂一层蛋清加以固定。
做免疫组化时，玻片应涂多聚赖氨酸，亦可买防脱玻片。
HE染色的步骤：
二甲苯Ⅰ5-10min→二甲苯Ⅱ5-10min→无水乙醇Ⅰ1-3min→无水乙醇Ⅱ1-3min→90%酒精1min→80%酒精1min→70%酒精1min→水洗→苏木精3-5min→水洗→盐酸酒精1-3s→水洗→饱和碳酸锂（氨水）10-30s→水洗→伊红3-5min→水洗（短）→70%酒精1-2s→80%酒精3-5min→90%酒精3-5min→95%酒精3-5min→无水乙醇5-10min→二甲苯Ⅰ3-5min→二甲苯Ⅱ3-5min→中性树胶封片
染色液的配制：
1.Harris苏木精的配制
苏木精 1g
硫酸铝钾 15g
无水乙醇 10ml
蒸馏水 200ml
先用蒸馏水加热溶解硫酸铝钾，用无水乙醇溶解苏木精再倒入已溶解的硫酸铝钾蒸馏水中，煮沸1min后，稍冷却，慢慢加入红色氧化汞0.5g，继续加热至染液变为紫红色，用纱布盖瓶口，用滤纸过滤后每100ml加冰醋酸5ml。
2.伊红的配制
伊红 1g
90%酒精 100ml
先将伊红溶于酒精中，用玻璃棒研碎溶解后，每100ml加冰醋酸1滴。
3.盐酸酒精分化液的配制：
浓盐酸 0.1-1ml
75%酒精 99ml
免疫组化实验步骤：
常规石蜡水化，将石蜡切片浸于二甲苯中5min,三次。
取出切片置于无水乙醇中2次，每次3min；90%酒精、80%酒精、70%酒精，各三次。
取出置于蒸馏水中。
1.取出蒸馏水中的切片，甩干并擦干切片上组织周围的液体，平放于湿盒中，滴加过氧化
物酶阻断剂（常用0.3%过氧化氢）于组织上避光孵育15min。
蒸馏水冲洗，再将切片置于TBS或PBS缓冲液中，浸泡5min，三次。
取出切片，甩干并擦干切片上组织周围的液体，平放于湿盒中。
2.滴加50-100μl一抗工作液于组织上，室温孵育2-3h，用PBS冲洗切片。
将切片置于
TBS或PBS缓冲液中，浸泡5min，三次。
取出切片，甩干并擦干切片上组织周围的液体，平放于湿盒中。
3.滴加50-100μlA液于组织上，室温孵育30min，用PBS冲洗切片。
将切片置于TBS或
PBS缓冲液中，浸泡5min，三次。
取出切片，甩干并擦干切片上组织周围的液体，平放于湿盒中。
4.滴加预备好的显色剂DAB工作液50-100μl，室温孵育5-10min，或光镜下控制显色。
显色完全后，用蒸馏水冲洗终止显色。
5.需要时，苏木精复染，盐酸酒精分化1-2s，水洗。
6.各级酒精（70%、80%、90%、无水乙醇Ⅰ、无水乙醇Ⅱ）脱水，每级3min,取出切片置
入二甲苯5min，三次。
7.用中性树胶封片。
SABC试剂盒组分：
A chemMate TM En Vision +/HRP,兔、小鼠 1×5ml
B DAB缓冲稀释液 2×6.25ml
C DAB原液 1×0.25ml
DAB工作液的配制：
实验前按每毫升B液（DAB稀释液）中加1滴（或20微升）C液(DAB原液)的浓度配制所需要的用量，混合后备用。
PBS缓冲液配制：
1×PBS（1000ml）
Nacl(137mM) 4g
Kcl(2.7mM) 0.1g
Na2HPO4(10mM) 0.72g
K2HPO4(2mM) 0.12g
5×PBS（500ml）
Nacl(137mM) 10g
Kcl(2.7mM) 0.25g
Na2HPO4(10mM) 1.8g
K2HPO4(2mM) 0.3g
TGF 1:50-1:200 1:100 孵育3h
MMP 1:50-1:200 1:100 孵育3h
二抗羊抗兔 1:400
组织RNA提取：
1.称取子宫肌瘤和瘤旁组织50-100mg，放入3.5mmRNase Free dish 中，先加入4℃预
冷的Trizol500μl，用眼科剪（RNase Free：用3%双氧水或氯仿浸泡30min，或用DEPC 水浸泡12h）将组织尽可能剪碎，再加入500μlTrizol，混匀后转入RNase Free EP 管中。
2.室温放置5min，加入4℃预冷的氯仿0.2ml/mlTrizol,颠倒混匀（可剧烈），要充分至
出现均匀乳糜状为止，然后静置5min，4℃，14000rpm×15min。
3.小心收集上层水相约600μl，置于另一个EP管（RNase Free）中，避免吸到中间层
和有机相。
4.加入500μl预冷的异丙醇（0.5ml异丙醇/mlTrizol）,颠倒混匀3-5次，-20℃放置
1h或室温静置10min。
5. 4℃，12000rpm×15min，离心后能看到少许沉淀附于EP管底部，弃上清，用滤纸吸
干管口的余液，倒置于滤纸上晾干1min。
6.加入1ml-20℃预冷的75%乙醇（含DEPC），洗涤RNA沉淀。
4℃，12000rpm×5min。
7.弃上清，加入1ml-20℃预冷的无水乙醇，不要冲起沉淀，立即离心，4℃，12000rpm
×5min。
8.弃上清，沉淀中即为总RNA，将EP管倒置于滤纸上，空气中干燥10min，不能干燥过
度。
加入20μlRNase Free H2O溶解沉淀，分装5μl/管，-70℃冰箱保存。
9.总RNA的鉴定：1%琼脂糖电泳鉴定总RNA，观察出现条带的完整性来判断RNA是否降
解。
核酸蛋白测定仪测定RNA的含量和纯度。
1%琼脂糖电泳制胶：
15ml 0.5×TBE+0.125g琼脂糖+2.4μl核酸染料
上样：2μl 5×loading buffer +3μl样本+5μl DEPC水
150V 30min
测RNA含量:2μl样本+98μlDEPC水
TBE电泳缓冲液配制：10× PH7.0
T Tris碱 27g
B 硼酸 13.75g
E EDTA 7.44g
三蒸水 500ml
RT-PCR步骤：
2.按以下条件进行反转录反应(一个循环)
（30℃ 10min） 42℃ 99℃ 5℃ 42℃-60℃ 15-30min 60min 5min 5min 95℃ 5min
5℃ 5min
2.反应条件（25-35个循环）
94℃ 30sec
55℃-65℃ 30sec
PCR凝胶电泳制胶：（1.5%）
15ml 0.5×TBE+0.225g琼脂糖+1.9μl核酸染料
上样：2μl 6×loading buffer +7μl样本+ 3μl灭菌蒸馏水
TGF- length 335 57.0℃
Sense 5′CAC AGT CCG CTA CTT CGT CC 3′20bp
Anti-Sense 5′CCC TAA TGG CTT CCA CCC TC 3′20bp MMP11 length 409 56.9℃
Sense 5′TTC TAC ACC TTC CGC TAC CC 3′20bp
Anti-Sense 5′GGA CTG GCT TCT CAC CAT CAT AT 3′23bp -actin length 592 56.0℃。