免疫比浊法检测免疫球蛋白
透射免疫比浊终点法与速率法测定免疫球蛋白对比分析
/L、聚乙二醇 ４０g/L,试 剂 ２ 为 羊 抗 人 I
１００ mmo
l
gG
抗体适量、叠 氮 钠 ０．
９５g/L)及 定 标 校 准 品 (浓 度 为
６、
１２、
２０、
３０g/L),批 号 为 １９０９０４. 校 准 品 量 值 可 溯
源至IRMM ERM DA４７０ 参考物质.
１．
３ 方法
１．
３．
速率法,副波长无,加入试剂 R２ 混匀后立即测定初始
吸光度,连续 监 测 ２ mi
n 测 定 吸 光 度 变 化 率 ΔA/mi
n
计算出 浓 度. 其 余 参 数、反 应 过 程 和 校 准 方 法 同 终
检验医学与临床 ２０２１ 年第 １８ 卷增刊 Ⅰ Lab MedC
l
i
n,
２０２１,
Vo
l．
种方法测定结果比较 差 异 无 统 计 学 意 义 (
P ＞０．
０５),
有良好的相关性,见表 １.
结果(
x±s,
g/L)
方法
终点法
速率法
t
不同浓度 I
gG(
g/L)
６
１２
２０
３０
６．
１２±０．
１８ １１．
９６±０．
４８２２．
０４±３．
１７３２．
１３±６．
１２
０．
０８
＞０．
０５
P
＞０．
０５
２．
抗体相似的 球 蛋 白,能 与 相 应 抗 原 特 异 性 结 合,介 导
体 液 免 疫 作 用 [１]. 同 时,其 本 身 也 是 抗 原,具 有 免 疫
免疫透射和免疫散射比浊法测定血清免疫球蛋白及补体的比较
ｓ ｒ ｍ ａ ｌ ｓ ｅ ｕ ｓ ｍｐ ｅ ｗｅ ｅ ｒ ｍｅ ｓ ｒ ｄ ａ ｕ ｅ ｗｉ ｉ ｔ ｍｍ ｕ ｅ ｒ ｎ ｍｉ ｓｏ ａ ｄ ｍ ｍｕ ｅ ｃ ｔ ｅ ｔ ｒ ｉ ｉｙ ｙ ｅ ｋ ｎ ｈ ｎ ｔ ａ ｓ ｓ ｉ ｎ ｎ ｉ ｎ ｓ ａ ｔ ｒ ｕ ｂ ｄ ｔ ｂ Ｂ ｃ ｍａ Ｃｏ ｈｅ Ｓ ｎ ｈｒ ｎ ｕ ｒ ｙ ｃ ｏ ＩＸ ２ ０
摘要
目的： 比较免疫透射和免疫散射 比浊法测定免疫球蛋 白和补体时 的准确性、 精密度 、 偏离度及测定范 围。方法 ： 采
用 克曼 Ｉ ２ 与 ＤＥ Ａ特定蛋 白分析仪 ， ｘ一 Ｏ Ｉ Ｔ 分别以免疫透射和免疫散射 比浊法 ， 同一临床标本测定血清 中免疫球 对
蛋 白 （ Ｇ、 Ａ、 Ｍ ） 补 体 （ ３ Ｃ ） Ｉ Ｉ Ｉ 和 ｇ ｇ ｇ Ｃ 、４ 的含 量 。结 果 ： 种 仪 器 测 定 ＩＧ、ｇ ＩＭ 、 ３ 准 确 性 、 密 度 均 良好 。两 法 两 ｇ ＩＡ、ｇ Ｃ 、 精 各浓 度 值 测 定结 果 的 预 期偏 差 均 在 可接 受范 围 。结 论 ： 克曼 Ｉ 一 Ｏ 用免 疫 透 射 比浊 法 与 Ｄ Ｉ 贝 ２应 Ｘ Ｅ ＴＡ特 定 蛋 白分 析仪
应用免疫散射比浊法测定免疫球蛋 白和补体准确性 、 精密度均 比较好 ， 且散射 比浊法优于透射 比浊法。
关键 词 免疫 球 蛋 白 ； 体 ； 射 比浊 ； 射 比浊 补 透 散 Ｒ４ ６ ６ ４． ２ 文 献 标 识码 Ａ 文章 编 号 １ ０ ０ ８ （０８ ０ —０ ５ ０ ０ ４— １８ ２ ０ ）５ ６ ９— ３ 中 图分 类 号
两种免疫比浊法测定血清免疫球蛋白的结果差异探讨及解决方法
１ 试剂及校准 品 ｆ Ｉ ｍａｅ ． ２ １ ｍ ｇ 测定 ＩＧ ＩＡ、 Ｍ全 部配套 ） ｇ 、ｇ Ｉ ｇ 试剂ｆ 批号 ＩＧ Ｍ６ １０ 、 Ａ Ｍ １３ ０ ＩＭ Ｍ６ １ ２） ｇ １ ３ １ Ｉ ６ １０ 、ｇ ０ ２ ４与校准 ｇ 品ｆ 批号 Ｍ ０ ３ ８（ ６４５） 简称 Ｂ ｃ ｍ ｎ试剂１（） Ｉ ｅｋ ａ ： Ｉ Ｉ ２ Ｎ） 迈克试剂公 司 ＩＧ、 Ａ、 Ｍ定 量测定试剂盒（ ｇ Ｉ Ｉ ｇ ｇ 批号均为 ２ ０ ０ ０ ） ０ ５ ３ １， 试剂盒 自
２ 结 果
２１ 方 法 ｆ１ 射 比 浊 法 采 用 迈 克 试 剂 公 司 试 剂 ． 日立 ． １透 用
７０ ６ ０全 自动 生 化 分 析 仪 进 行 测 定 ｆ１速 率 散 射 比 浊 法 采 用 ２ Ｉ ａｅ免疫 化学 系统 进 行 ｆ１ 器 精 密 度 评 价 试 验 用 一 份 正 ｍｍ ｇ ３ 仪 常 浓 度 混 合 血 清 样 本 分 别 用 两 种 方 法 完 成 ＩＧ、ｇ ＩＭ 的 ｇ Ｉ Ａ、ｇ
１１ 仪 器 Ｂ ｃｍａ — ｏｌ ｒ 司 生 产 的 Ｉ ａｅ免 疫 化 学 ． ｅｋ ｎ Ｃ ｕ ｅ 公 ｔ ｍｍ ｇ 系统 ． 日立 ７ ０ ６ ０全 自动 生化 分析 仪
双 份 平 行 测 定 ．各 自重 复 ２ ０次 ．计 算 出两 种 测 定 方 法 的均 值 、 准 差 批 内１ 标 和变 异 系 数 （ ｖ批 内１此 即批 内 精 密 度 。 ｃ ．
带 校 准 品
钟 混 匀 分 别 测 定 ２次 求 均 值 ． 共 ２ 总 ０天 得 ２ ０个 数 据 ． 同样 计 算 均 值 、 准 差 批 间１ 变 异 系 数 （ ｖ批 问１此 为 批 间精 标 和 ｃ ，
放射免疫法与免疫比浊法检测脑脊液免疫球蛋白含量比较
格林 巴利 综 合征 患 者 脑 脊 液 中 的免 疫 球 蛋 白浓 度 是确 诊格 林 巴利综 合 征 的一 项 重 要指 标 ， 效 性 高 、 确 性 强 的 有 准
临床 检验 方 法对 于临 床诊 治具 有指 导 意义 。 者通 过 两种 方 笔 法进 行检 测 ， 将本 院检 测结 果 和经 验报道 如下 ： 现 １ 资 料 与 方 法
淀物 的放射性 ， 根据 结果 制作 标 准 曲线 图。 免疫 比浊 法 ： 齐 备 ｌＧ、 Ａ、 Ｍ 试剂 盒 、 准 品 等 必 备 品 后 ， 用 Ａｒ ｙ ６ ｇ Ｉ Ｉ ｇ ｇ 校 应 ｒ ３ ０特 ａ 种 蛋 白分 析 仪 和美 国雅 培 Ａ Ｂ Ｔ ｅｏｅ 全 自动 生化 仪 ， Ｂ Ｏ ＦＡ ｒｓｔ 严格 按 照操 作说 明进 行 。
比 浊 法 线 性 范 围 高 于 放 射 免 疫 法 （。４１ ，＝ ．１ ） ｘ＝ ．６ Ｐ ００ ６ 。
２２测 量 灵 敏 度 ．
比浊法灵敏 度较放 射免 疫法 低 ， 性 范围较放 射免 疫法 宽 ， 线 根 据 两组 数据 显示 其灵 敏度 及线 性 范围 均能 满足 临床应 用 。 本
的 时 问不少 于 ２ｈ 每批 对 样 本 做双 份 测定 ， 均 值 ， ， 取 计算 批
内 、 间 、 间和总 精 密度 ， 一批 测定 均做 一次 质控日 得 出 批 天 每 。 标本 批 内变异 系 数 （ Ｖ） ２３ ， 问 Ｃ Ｃ 为 ．％ 批 Ｖ为 ３１ 天 间 Ｃ ．％， Ｖ
一
射性 标 记 的抗 原 的量 ， 而 计算 出相应 的结 果 。放 射免 疫法 从 存 在放 射 性 核 素污 染 ． 试剂 保存 期 短 ， 作 繁杂 ， 性 小 ， 操 线 要 批量 做 ， 果报 告不 及 时 ， 结 对高 浓 度标 本需 稀 释重 做 ， 但费 不 时 费力 ． 而且手 工稀 释 ， 以满 足实 验室 和 临床 的要求［ 难 ４ １ 。
免疫学实验 免疫比浊(免疫球蛋白的测定)
3 免疫胶乳比浊法
原理
选择一种大小适中，均匀一致的胶乳颗 粒，吸附抗体后，当遇到相应抗原时，则 发生凝集，单个胶乳颗粒在入射光波长之 内，光线可透过，当两个胶乳凝集时，则 使透过光减少。这种减少的程度与胶乳凝 集成正比，与抗原量成正比。
（a）带抗体的胶乳在波长之内可透过光线； （b）结合后，则形成光线衰减
2. 海德堡（heidelberger）曲线理 论
2 抗体的质量
（1）特异性高 （2）效价高 （3）亲和力高 （4）抗血清来源
3 抗原抗体反应的溶液
• pH 6.5~8.5
• 电解质 离子强度、种类（磷酸盐缓冲液）
4 增浊剂的使用
• PEG、tween-20等非离子型亲水 剂
• 作用：消除蛋白质分子周围的电子 云和水化层，促进抗原、抗体分子 靠近，结合形成大分子复合物。
（二）类型
1. 透射免疫比浊法 2. 散射免疫比浊法 3. 免疫胶乳比浊法
1 透射免疫比浊法
原理：
抗原抗体在一定缓冲液中形成免疫复合物 (IC)，当光线透过反应溶液时，由于溶液内复 合物粒子对光线的反射和吸收，引起透射光减 少，免疫复合物量越多，透射光越少，即光线 吸收越多，可用吸光度表示。吸光度和复合物 的量成正比，当抗体量固定时，与待检抗原量 成正比。用抗原标准品建立标准曲线，可测出 待检抗原含量。
•
样本管吸光度
• 浓度＝————————×校准液浓度（g/L）
•
校管吸光度
• 结果及讨论
– 检测报告 – 检测意义
实验二、免疫浊度测定 ——免疫球蛋白检测
实验步骤见说明书 IgG9.77g/L IgA1.72g/L IgM1.37g/L
沉淀反应
微生物与免疫教研室
免疫比浊法检测免疫球蛋白
材料
1.免疫球蛋白试剂A,M,G 2.免疫球蛋白试剂A,M,G校准品，蒸馏水 3.微量加样枪 4.分光光度仪
结果计算方法
样本管吸光度 Ig浓度（g/L）= 校准管浓度 × Ig校准浓度（g/L）
光通量是每单位时间到达、离开或通过曲面 的光能数量
散射比浊法
• 原理 在入射光的一定角度检测粒子发出的散 射光，散射光的强度与IC的含量呈正比。
散射比浊法测定原理
聚集形成
诱导剂
增 加 散 透 率 : 660nm 测 定 散 射 光
散射光测定
检测器 (LED) 样品
光电计 散射光强度
100 %
0%
在速率峰基础上完成的标准曲线
RATE
CONCENTRATION
方法评价：
敏感度高 快速(不必达平衡）
抗原抗体结合的动态测定，理论上测定不
受本底散射信号的影响
可检测微量样品
2.终点散射比浊法
• 原理
让抗原抗体作用一定时间，使其反应达到平衡后， 测定其IC形成的量。IC的浊度不再受时间的影响，但 反应IC聚合产生絮状沉淀之前，进行浊度测定。
免疫浊度法测定中应注意的问题 1、伪浊度的影响 伪浊度形成原因很复杂，主要是抗血清含有非特 异性的交叉反应性杂抗体成分；增浊剂浓度和反应时间 掌握不当；样品本身的浊度处理不当；试剂的污染和变 质；器材尤其是比色杯等不够清洁等因素。 2、非特异性散射光的影响 免疫浊度法经常受内源性光散射的干扰，为避免这 些非特异性光散射的影响，应用透射比浊法时需保证抗 体组分在3％以下，散射比浊法
光 源
诱 导 剂
透射比浊法测定原理
样品
光电计
滤光片 光源
透射比浊法的缺陷：
免疫比浊法
免疫比浊法的特点：
实验原理
优点
稳定性好，敏感性高(达ng/L)、精确度高，干扰因素少，结果判断更加客观、 准确。
快速、简便，结果回报时间短，便于及时将各种信息向临床反馈，又可节约 大量人力物力，利于大批量样品的处理。
能更好地避免标本之间的污染及标本对人的污染。
可利用多道计数器、测光仪，同一份样品同时测定几十种和临床有关的分析 项目，血清用量少，具有明显的应用优势。
实验 免疫比浊法检 测免疫球蛋白
免疫系
1
实验原理
2
材料和方法
3
实验结果
实验原理
免疫球蛋白（Ig）是指一类具有抗体样结构或具有抗体活性 的球蛋白，能与诱导其产生的抗原发生特异性结合，是体液免 疫应答的主要效应分子。免疫球蛋白水平增高常见于各种慢性 细菌感染，如慢性骨髓炎、慢性肺脓肿等。在多种自身免疫病、 肝脏疾病患者中可有IgG、IgA、IgM升高：在系统性红斑狼疮 患者中以IgG、IgA或IgG 、IgM升高较多见；在类风湿关节炎 中则以IgM升高为主。免疫球蛋白水平降低多见于先天性体液 免疫缺乏病、肾病综合症、吸收不良综合症、淋巴瘤、放射损 伤和免疫抑制剂治疗后等情况。
实验原理
聚乙二醇即PEG是中性、无毒且具有独特理化性质和良 好的生物相溶性的高分子聚合物，聚乙二醇具有高度的亲水 性，在水溶液中有较大的水动力学体积，并且没有免疫原性。
在免疫反应中，为增强抗原抗体反应常使用增聚剂，如34％的聚乙二醇等，利用其破坏抗原抗体的水化层，促进其靠 近反应，但如浓度不适合，高了会影响其它溶质或产生非特 异性聚集影响结果。
实验原理
血浆蛋白分析技术经历了： 试管沉淀反应、琼脂凝胶的扩散实验发展到现代免疫 分析技术，其中很重要得一类就是免疫比浊法。
免疫球蛋白MIgM测定免疫比浊法-检验科免疫室作业指导书
免疫球蛋白MIgM测定免疫比浊法1.原理分析原理是液相免疫沉淀散射比浊终点测定法。
抗血清用缓冲液稀释后加到一份病人血清中，经过孵育后可以测定抗原抗体复合物产生的散射光。
散射光结果和血清中的IgM浓度成正比。
标本采集：标本采集前病人准备：受检者空腹标本种类：血清或血浆标本要求：取被检者静脉血2ml，室温放置不超过4小时，分离血清备用。
标本储存：待测标本在2-8℃存放不超过24小时，-20℃不超过三个月，-70℃长期保存。
避免反复冻融。
标本运输：室温运输标本拒收标准：细菌污染、溶血、脂血不能作测定。
试剂6.1试剂名称：免疫球蛋白M检测试剂盒6.2试剂生产厂家：芬兰Orion诊断试剂公司6.3包装规格：60Test/kit6.4试剂盒组成：缓冲液30ml空白缓冲液30ml抗血清试剂0.5ml定标液0.5ml磁卡1张仪器设备：仪器名称：OrionTurboxRplus特定蛋白分析仪仪器厂家：芬兰Orion集团公司仪器型号：Turboxplus8.操作步骤：8.1试剂配制：8.1.1抗血清应用液准备：吸取500ul抗血清加到反应缓冲液中，轻轻混匀，应用液2-8℃可保存12个星期。
8.1.2空白缓冲液：液体待用。
8.1.3定标液：用0.9%NaCL进行1：51稀释。
定标液根据IFCC提供的材料CRM470进行标定。
8.2收集与处理样品：样品用0.9%Nacl进行1：51稀释。
8.3为每一份样本测定准备一份样品空白，同样，为定标液另外准备一份定标液空白。
8.4准备两份定标液测定（定标完成后，标准曲线数据存储在磁卡内。
下次检测如使用同批试剂，可以不必做定标而直接使用磁卡上的定标信息）。
8.6轻轻摇动混匀，室温18-25℃放置30±5分钟。
8.7仪器测试步骤：参见TurboxR特定蛋白分析仪作业指导书。
9.结果计算：仪器直接计算并打印结果。
临床意义：IgM是分子量最大的免疫球蛋白，是一种高效能抗体、能固定补体，具有溶菌、抑菌、中和病毒作用。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
免疫比浊法检测免疫球蛋白
一、实验目的
利用免疫比浊法绘制标准曲线，并检测样品中免疫球蛋白的浓度。
（本小组检测的为IgG样品）
二、实验原理
1.抗原抗体反应(Antigen-antibody reaction)：抗原与其刺激机体产生的相应抗体在体内或体外发生特异性结合的反应。
反应特点有：特异性、比例性、可逆性、敏感性。
影响因素有：电解质、温度、酸碱度。
2.免疫比浊法：合适比例的抗原抗体形成的免疫复合物，在PEG作用下形成微粒，使样品浊度发生变化。
当一束光线通过溶液受到光散射和光吸收两个因素的影响而使光的强度减弱，根据光的强度改变可测得微粒浓度。
分类：①透射比浊法（Transmission tubidimetry）当一定波长光线通过浊度发生变化的反应混合物时，由于被不溶性免疫复合物吸收而减弱，故在一定范围内吸光度与免疫复合物量呈正相关。
当抗体浓度固定（过量），样品的浊度与其中所含抗原量成正比。
（特点）透射比浊操作简便，适用于普通的自动生化分析仪和普通的分光光度计，几乎所有的实验室均能开展。
不足的是灵敏度和精密度均不够理想，所需的抗血清量大，检测的时间较长。
②散射比浊法（Nephelometry）光线通过检测溶液时，被其中所含的抗原抗体复合物折射而部分偏转，产生散射光，其强度与复合物的数量和散射夹角成正比，与光的波长成反比。
（特点）优点是灵敏度、精密度均较高，检测快速。
其缺点是需特定的分析仪器，试剂价格高。
本实验采用透射法。
3.聚乙二醇PEG的作用：在免疫反应中，为增强抗原抗体反应常使用增聚剂，3~4％的聚乙二醇，可破坏抗原抗体的水化层，促进抗原抗体靠近反应，但如浓度不适合，会影响其它溶质或产生非特异性聚集影响结果。
三、实验材料
免疫球蛋白A,G(IgA,IgG)测定试剂(试剂1[PEG]，试剂2[羊抗人IgA, IgG]）（1管/每组）免疫球蛋白A, G(IgA,IgG)校准品，蒸馏水，血清样本（1管）
微量加样枪、ep管（1.5mL离心管）
酶标仪、水浴箱
四、实验步骤
1.在7个EP管中各加250µL IgG试剂1（PEG）。
2.7管分别加入蒸馏水、校准品原液、1：2校准品、1：4校准品、1：8校准品、1：16校准品、样本各2μL。
3.混匀后37℃水浴5min。
4.7管各加入85μL IgG试剂2（羊抗人IgG）。
5.混匀后37℃水浴10min。
6.分别吸取200µL至96孔酶标板中，用酶标仪在700nm处读取OD值。
五、实验结果与数据处理
2.标准曲线
3.样本浓度：y=0.604代入x=26.648g/L
由此得稀释之前样本的浓度为79.945g/L
误差：（79.945-34.8）/34.8*100％=129.73%
误差分析：
①抗原抗体反应需要一定孵育时间和温度，而操作中由于加样的速度限制，无法严格控制各管的反应时间；本次制作标准液时量极小，很有可能出现未混匀、挂壁的情况；标准液吸取量小会导致移液枪的误差被放大。
②免疫比浊法的基本原理是基于抗原抗体结合，而这个结合反应有特殊性，只有在一定范围浓度中，两者比例合适时检测结果才准确，否则会产生带现象，已有文章表明，稀释前后检测结果偏差很大(朱爱萍, 郭书云, 赵锐. 免疫比浊法检测异常血清免疫球蛋白的方法学探讨[J]. 现代检验医学杂志, 1999(4):33-34.)，所以我认为此样本虽然是由原液稀释三倍所得，但在溶液中IgG抗体的浓度都相同的情况下，两管中抗原抗体比例相差很大，所以检测结果也有偏差是可以理解的。
同时再结合散点图拟合出的标准曲线，可以发现，浓度较高的两管标准液距离拟合曲线的偏差是最大的，由此推断，1：1原液和1：2原液并不适合本次实验中所给的羊抗人抗体浓度（未知）。
所以，误差来源除了以上所说原因之外，还有本次实验提供的抗体浓度，并不适合原液中IgG浓度的检测，而稀释三倍后的样品属比较适合的范围。
所以最大的误差来源是抗体浓度的选择，虽然抗体浓度是保证过量的，但是过量的程度相对每个管来说是不同的，1：1和1：2也许需要更大的浓度。
六、思考
1.本实验采用的免疫比浊法适用于人体内哪几种Ig？
人体血清中含有五类免疫球蛋白，分别为IgG、IgA、IgM、IgD、IgE。
其中前三种含量相对较高，而IgD和IgE含量极低，膜结合型IgD构成BCR，是Bcell成熟的标志，IgE在正常人血清中含量最少，与Ⅰ型超敏反应和寄生虫感染有关。
理论上此五种Ig均可以采用免疫比浊法检测含量，但临床上常只检测前三种含量较高、疾病相关性更强的Ig，在考虑寄生虫感染和变态反应性疾病时还可以检测血清中IgE的含量。
2.检测血清等体液标本中某种抗原分子的方法？
原理同本实验，采用抗原抗体结合的原理，凝集反应、沉淀反应、中和反应，以及免疫荧光法和酶联免疫吸附试验等，在使用抗原抗体结合原理时，将抗体加入荧光可以直接检测荧光强度来定量检测抗原含量，而酶联免疫吸附试验还可采用双抗体法以级联放大更易检测。
3.使用免疫比浊法时，抗原抗体的比例应采用哪个区域？
应采用抗体过量的前带，因为所检测的物质是抗原，希望所加样品中的抗原完全与抗体结合形成微粒，所有的微粒均可吸收酶标仪中透过的光线。
因为吸光度OD值与溶液中颗粒的浓度成正比，而计算时默认颗粒的浓度与样品中所含抗原的浓度相当，所以，只有在抗体含量过量时，才能保证所有抗原都能与抗体结合形成微粒，降低因抗原未完全结合抗体所带来的误差。
而且结合本次误差，不同管抗体过量的程度也应该大致相当。
4.为何波长选择700nm？
抗原抗体结合后的吸光度受抗原抗体种类的影响，本次采用的是羊抗人Ig抗体，应该由经验值可知700nm是IgG抗原抗体结合后最大的吸收波长，在最大吸收波长处通过测吸光度来测浓度所得结果的误差最小。