生物实验：大肠杆菌的分离与培养
实验一大肠杆菌的培养和分离
答：皿盖与皿底之间的培养基易滋生杂菌，因 此不宜用此皿继续培养。
连续划线法
2.为什么要研究微生物？
90%以上对人类有利的，少数能引起传染病。 1.利用微生物生产食品、药品，如酒类、抗生素等； 2.微生物治理环境污染； 3.利用微生物生产新能源。 4.用于基因工程
一、实验目的（教学要求）
1.进行大肠杆菌的扩增，利用液体培养基进行细菌 培养的操作； 2.进行大肠杆菌的分离，用固体培养基进行细菌的 划线培养。 3.说明大肠杆菌培养的条件和实验原理。
稀释→涂布→培养
玻璃 三角 刮刀
划线分离法：简单。涂布分离法：单菌落更易 分开，但操作复杂些。
4.扩大培养过程和分离过程
（1）制备５０ml的LB（液体和固体）培养基
①配制：： 蛋白胨：０.５g 酵母提取物：０.２５g 氯化钠：０.５g 溶于热水并加水至５０ml，并调pH（７.６）
固体培养基： 上述物质中再加１g琼脂。
答：利用标记基因所对应的性状（如抗青霉素） 保留转基因大肠杆菌，杀死普通大肠杆菌。
６.本实验的目的是什么？
答：尝试培养微生物的基本技术；学习培养、 分离提纯大肠杆菌的方法。
７.本实验的实验原理是什么？
答：微生物能够利用培养基中的各种营养物质 进行生长和繁殖。划线或涂布可以使单个细菌 繁殖成单个菌落，从而分离。
②灭菌: 将50ml培养基用玻棒转移至三角锥瓶中，
塞上棉花塞，包上牛皮纸，再放入高压蒸气灭
菌锅，在压力为1kg/cm2、温度为121℃，灭菌
15min。 ③倒平板:
待培养基冷却到６0 ℃左右时，在酒精灯附 近倒平板。（倒平板操作见课本）(试管斜面的 制作方法类似)
大肠培养实验报告
一、实验目的1. 了解大肠杆菌的生长特性。
2. 掌握大肠杆菌的分离、纯化和鉴定方法。
3. 学习使用显微镜观察大肠杆菌的形态。
4. 熟悉大肠杆菌的生理生化特性。
二、实验原理大肠杆菌（Escherichia coli）是一种革兰氏阴性、无芽孢、兼性厌氧的细菌，广泛存在于自然界和人体肠道中。
大肠杆菌的培养和鉴定是微生物学实验中的重要内容。
本实验通过分离、纯化和鉴定大肠杆菌，了解其生长特性，为后续研究提供基础。
三、实验材料与仪器1. 材料：普通琼脂、营养肉汤、乳糖、胆盐、伊红、美蓝、无菌水、无菌棉签、酒精灯、培养皿、显微镜等。
2. 仪器：恒温培养箱、高压蒸汽灭菌器、电子天平、无菌操作台、移液器、试管等。
四、实验步骤1. 分离大肠杆菌（1）取少量疑似大肠杆菌的样品，用无菌棉签涂抹于营养肉汤中。
（2）将营养肉汤置于恒温培养箱中培养24小时。
（3）取培养后的肉汤，用无菌移液器吸取少量，涂布于普通琼脂平板上。
（4）将平板置于恒温培养箱中培养24小时，观察菌落生长情况。
2. 纯化大肠杆菌（1）挑取单菌落，接种于新的营养肉汤中。
（2）将培养后的肉汤置于恒温培养箱中培养24小时。
（3）取培养后的肉汤，用无菌移液器吸取少量，涂布于新的普通琼脂平板上。
（4）重复上述步骤，直至获得纯化的大肠杆菌。
3. 鉴定大肠杆菌（1）革兰氏染色：取纯化的大肠杆菌，制作革兰氏染色片，观察细菌形态。
（2）生化试验：进行乳糖发酵试验、硫化氢试验、吲哚试验等，鉴定大肠杆菌的生理生化特性。
4. 观察大肠杆菌形态（1）将纯化的大肠杆菌接种于营养肉汤中。
（2）将培养后的肉汤置于恒温培养箱中培养24小时。
（3）取培养后的肉汤，制作涂片，置于显微镜下观察细菌形态。
五、实验结果与分析1. 分离大肠杆菌在涂布有疑似大肠杆菌样品的琼脂平板上，观察到典型的圆形、湿润、边缘整齐的菌落。
2. 纯化大肠杆菌经过多次纯化，获得纯化的大肠杆菌。
3. 鉴定大肠杆菌革兰氏染色结果显示，大肠杆菌为革兰氏阴性菌。
分离大肠杆菌的方法
分离大肠杆菌的方法大肠杆菌（Escherichia coli）是一种常见的肠道细菌，也是微生物学研究中的重要模式生物。
分离大肠杆菌是许多实验室中常见的操作，这里将介绍几种常用的分离方法。
1.无菌技术准备在进行分离大肠杆菌之前，必须保证实验环境的无菌。
操作前要用75%乙醇对操作台面进行消毒，使用无菌培养皿和试管，并佩戴无菌手套。
2.样品采集从目标样品中采集含有大肠杆菌的样品。
常见的样品类型包括食品、水样、粪便等。
采集样品时要注意避免污染，使用无菌容器收集样品。
3.预处理样品将采集到的样品进行预处理，以提高大肠杆菌的分离效率。
常用的预处理方法包括：(1) 粪便样品：将粪便样品稀释于无菌生理盐水中，通过离心操作去除大部分固体颗粒。
(2) 食品样品：将食品样品加入适量的无菌生理盐水中，进行均匀搅拌。
(3) 水样：直接使用无菌容器收集水样，避免污染。
4.选择培养基根据实验需要选择适合分离大肠杆菌的培养基。
常用的培养基包括营养琼脂糖平板（Nutrient Agar Plate）、MacConkey琼脂糖平板（MacConkey Agar Plate）等。
这些培养基含有适合大肠杆菌生长的营养物质，并可以通过某些特殊成分选择性地抑制其他细菌的生长。
5.涂布法涂布法是最常用的分离大肠杆菌的方法之一。
具体操作步骤如下：(1) 取一支无菌的鉴别环，将其蘸取预处理后的样品。
(2) 将鉴别环均匀地涂布在培养基平板的表面上。
(3) 使用无菌铁环或无菌玻璃杆均匀涂布，以保证样品的均匀分布。
(4) 将涂布好的培养基平板放置在恒温培养箱中，以适当的温度（通常为37摄氏度）进行培养。
6.滤膜法滤膜法是一种通过滤膜来分离大肠杆菌的方法。
具体操作步骤如下：(1) 准备无菌滤膜和滤膜培养基。
(2) 将预处理后的样品滤过滤膜，将滤膜放置在滤膜培养基平板上。
(3) 将滤膜培养基平板放置在恒温培养箱中进行培养。
7.生物化学试验分离大肠杆菌后，需要进行进一步的鉴别和确认。
实验一大肠杆菌的分离和培养
细菌
2.微生物涉及五类 放线菌
真菌
原生动物
(二)培养基
• 1.分类(按物理形态分) • (1)液体培养基 • (2)固体培养基
①常用旳固体培养基: 琼脂固体培养基.
②微生物在固体培养基 表面生长,能够形成 肉眼可见旳菌落.
2.培养基内所含旳基本物质
• (1)水 • (2)碳源 • (3)氮源 • (4)无机盐
a.灼烧灭菌
注意合用范围
微生物旳接种工具 (接 种环、接种针)或其 他金属用具直接在火 焰旳充分燃烧层灼烧
b. 干热灭菌 160－170℃ ；1－2h
能耐高温旳需要保持干 燥旳物品( 玻璃器皿)
c.高压蒸汽灭菌 100kPa 121℃ 15-30min
一般用于培养基旳灭菌
二、试验操作 • （一）制备牛肉膏蛋白胨固体培养基
• 计算－称量－溶化－灭菌－倒平板
• （二）分离纯化大肠杆菌
• 接种措施有：
• 划种未接 种旳培养基放入37℃恒温箱中培养12h 和24h后，观察并统计
三、课题延伸：菌种旳保藏
• 1、斜面保藏 • （临时保存） • 2、甘油保藏
（长久保 存）
试验1：大肠杆菌旳培养和分离
角烧瓶旳液体培养基中，三角烧瓶在37℃摇床振荡培养 12h。 • (4) 划线分离：将摇床上培养12h旳菌液在固体培养基旳 平板上连续划线，然后将盖好旳培养皿倒置，放在37℃ 恒温培养箱中进行培养。 • (5)单菌落接种培养：在无菌操作下将单菌落用接种环取 出，再用划线法接种在空白斜面上，在37℃下培养24h, 4℃冰箱保存。
设备及用具：
灭菌锅或高压锅、250ml旳三角瓶、封口膜和橡皮圈、 直径90mm旳培养皿、接种环和玻璃三角刮刀、恒温培 养箱、摇床、酒精灯和超净台、一次性塑料手套、装有 酒精棉球旳广口瓶、镊子、有棉塞旳试管 （15mm×120mm）5支
高中生物选修一 第一部分 实验1 大肠杆菌的培养和分离
业曾一度遭受毁灭性的打击。在生产过程中， 出现了葡萄酒变酸、变味的怪事。经过一番研 究，法国科学家巴斯德发现，导致生产失败的 根源在于发酵物中混入了杂菌。由此人们认识 到保持培养物纯净的重要性。
如何保持培养物纯净呢？
无菌技术：
1.消毒与杀菌 ①消毒：消除表面或内部的部分微生物 ②杀菌：杀死内外所有微生物，包括芽孢和孢子
配制培养基的过程：
计算 → 称量 → 溶化（溶解） →灭菌 →倒平板
注意：
1.培养基冷却至50℃左右倒平板 2.倒平板时应在酒精灯附近操作
培养基的分类：
1.物理性质 ①液体培养基：菌种培养或工业生产 ②半固体培养基：观察微生物运动 ③固体培养基：微生物的分离、鉴定、计数
2.组成成分 ①合成培养基：分离、鉴定微生物 ②天然培养基：生产
3.用途：★ ★ ★ ①选择培养基：缺某种物质或多加某种物质 ②鉴别培养基：加指示剂或化学药品
月桂基硫酸盐 胰蛋白胨肉汤
（LST）
配
倒平板：
接种：
接种针灼烧灭菌
平板划线
大肠杆菌的纯化方法：
稀释涂布平板法
平板划线法
大肠杆菌的分离纯化
——结晶紫中性红胆盐琼脂
2.常用方法 巴氏消毒法：牛奶 化学药剂：双手、水源 灼烧灭菌：接种环等（金属） 干热灭菌：160-170℃ 1-2h （玻璃器皿、金属） 高压蒸汽灭菌：121℃ 100KPa 15-30min（培养基） 紫外线消毒法：30min（空气中的微生物） 酒精灯火焰附近操作；超净工作台上操作。
回忆有关细胞的元素组成、分子 组成的知识，想一想微生物应该生活 在什么环境中呢？
1.平板划线法或稀释涂布平板法纯化大肠杆菌 要求：
实验一大肠杆菌的培养和分离
操作时右手无名指和小指 夹住封口膜，另外三指持 三角瓶，左手拿培养皿并 打开上盖的一边，在酒精 灯火焰旁操作。
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（三）大肠杆菌的接种
将斜面上培养的大肠杆菌菌种用接种环接种到灭菌后的LB液 体培养基中，将三角瓶的封口膜和斜面的棉塞复原。
注意事项: 1.在火焰旁从斜面上用接种环取菌; 2.取菌前接种环要用酒精灯灼烧 灭菌，冷却后方能取菌； 3.接种时右手拿着接种环，右手 无名指和小指夹住斜面的棉塞和 三角瓶封口膜； 4.取菌后封口膜和棉塞复原.
LB（Luria-Bertani）液体培养基：蛋白胨10g/L，酵母提取液5g/L，
氯化钠10g/L。
（可用于大肠杆菌的扩大培养）
配制50mL的LB培养基：蛋白胨0.5g，酵母提取物0.25g，氯化钠 0.5g，加50mL水溶解。
LB（Luria-Bertani）固体培养基：50ml LB（Luria-Bertani）液 体培养基中再加入1g琼脂制得。（可用于大肠杆菌的划线分离） 固体培养基可根据需求制成平面或斜面。
培养基：一般 121℃灭菌15min 有葡萄糖：500g/cm2（90℃以上）灭菌30min 有尿素等不能加热的物质：G6玻璃砂漏斗（玻璃砂漏斗用
后需用1mol/L的HCl浸泡，抽滤去酸）
进行操作时，注意瓶口、壁上等不能沾有培养基，否则易发生污染。
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大肠杆菌的培养和分离实验操作步骤
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• 实验器材
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（四）大肠杆菌的扩大培养
三角瓶在37℃，每分钟200转的摇床上振荡培养12h。
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（五）大肠杆菌的划线分离
1、操作步骤 （1）灼烧接种环； （2）接种环冷却后，从在摇床上培养了12h的菌液中蘸取菌液； （3）在近火焰处，用带菌液接种环在固体培养基上划线。
实验一大肠杆菌的培养与分离(最新)
恒温培养箱
实验设备和用品： 1、灭菌锅或高压锅 2、250ml的三角瓶、封口膜和橡皮圈P22 P26 3、直径90mm的培养皿 4、接种环和玻璃三角刮刀 5、恒温培养箱 6、摇床
摇床
实验设备和用品： 1、灭菌锅或高压锅 2、250ml的三角瓶、封口膜和橡皮圈 3、直径90mm的培养皿 4、接种环和玻璃三角刮刀 5、恒温培养箱 6、摇床 7、酒精灯和超净台
1-1什么是生物技术
• 生物技术=生物工程
应用自然科学及工程学原理，以微生 物体、动物体、植物体或其组成部分作为 生物反应器将物料进行加工，以提供产品 来为社会服务的技术。
1-2 传统生物技术
• 传统生物技术指主要通过微生物 的发酵来生产商品.如:酱、醋、 酒、面包、奶酪、酸奶等
1-3 现代生物技术
②保护细胞免受外力的损伤； ③阻拦大分子物质进人细胞； ④使细胞具有致病性及对 噬菌体的敏感性。
伤 寒 杆 菌 细 胞 壁 中 含 毒 素
有些细菌在一定的条件下，细胞里面形成一个椭圆形的休眠 体，叫做芽孢。芽孢的壁很厚，对干旱、低温、高温等恶劣的环 境有很强的抵抗力。例如，有的细菌的芽孢，煮沸3小时以后才 死亡。芽孢又小又轻，可以随风飘散。当环境适宜（如温度、水 分适宜）的时候，芽孢又可以萌发，形成一个细菌.
特点：结构简单，形体微小，通常要用光学显微镜或 电子显微镜才能看到，有的甚至没有细胞结构。 用途：90%以上的微生物是对人类有利的。如抗生素 多数来源放线菌和霉菌；酒由酵母菌发酵产生，腐乳 由红曲霉和毛霉发酵制成；微生物也能消除环境污染， 在新能源领域将发挥巨大作用。
1）放线菌
1、结构： 单细胞原核 分支状的菌丝（基内菌丝、气生菌丝）
分离后,一个菌体 便会形成一个菌 落,这是消除污染 杂菌的通用方法, 也是用于筛选高 表达量菌株的最 简便方法之一
实验1 大肠杆菌的培养和分离
（2）具有耐高糖和耐酸特性的酵母菌是理想的酒精发酵菌种，对野生酵母菌进行 诱变后通过筛选可以得到具有这些特性的突变菌，诱变及筛选过程如下：
步骤1：野生菌液体培养一段时间后接受紫外线照射诱变处理。 步骤2:制备选择培养基。在基本培养基的基础上，注意＿和 ＿，加琼脂后灭菌，制成
本图来自十一学校
二、实验流程 配制培养基
包器材
灭菌
倒平板(或斜面)
接种扩大培养 分离
单菌落培养
接种保存
细菌的分离方法
1.种类: 划线分离法和涂布分离法。 划线分离法:通过接种环在琼脂固体培养基表面连续画线的操 作,将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面. 划线时不能划破培养基
2.作用: 是消除污染杂菌的通用方法，也是用于筛选高表 达量菌株的最简便方法之一。
实验一
大肠杆菌的培养和分离
微生物
定义:结构简单、形体微小的单细胞、多细胞或没有 细胞结构的低等生物，包括病毒、原核生物、原生 生物和某些真菌。
曲霉
酵
母
菌
草履虫
细菌：是单细胞的原核生物。 结构组成：细胞壁（肽聚糖）、细胞膜、细胞质，拟核 分裂方式：二分裂
菌落：由单个细菌（或其他微生物）在适宜固体培养 基表面或内部生长繁殖到一定程度；形成肉眼可见有 一定形态结构等特征的子细胞的群落。
为什么要倒置培养？
培养基中的水分会以水蒸气的形式蒸发，正放培养 皿会使水蒸气凝结成水滴后，落入培养基的表面并 且扩散，菌落中的细菌也会随水扩散，菌落间相互 影响，很难再分成单菌落，达不到分离的目的。
1.下面两图是采用纯化微生物培养的两种接种方法接 种后培养的效果图解，请分析接种的具体方法。
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实验结果与分析
•加氨苄青霉素 •所加菌液：普通 •分离方法：划线 •现象：有菌，集中 分布，不均匀，相霉素 •所加菌液：混合 •分离方法：涂布 •现象：分布均匀， 数量较多，但有黄色 透明杂菌。
实验结果与分析
实验反思与总结
这次实验过程中，总的来说较上次在分工 方面有了显著的提高，故而实验做的比较有 序。 但美中不足的是实验结果依然与预期有不 同之处：①培养基被标记错误②杂菌较多， 无菌操作不够规范。 可能还是对实验的预习不够明确，所以在 实验时总是忘记要在酒精灯旁操作这一要求， 在下次试验中一定会多加注意。
Thank You
实验步骤及现象
2.大肠杆菌单克隆的分离与培养 ①设置对照组（6号培养皿）和实验 组（5号培养皿）。 ②向实验组培养皿中加入氨苄青霉素
实验步骤及现象
③用接种环划线 i.将接种环放在火焰上灼烧，直到其烧红。 ii.在火焰旁冷却接种环，同时打开离心管。 iii.在火焰旁将已冷却的接种环伸入普通大肠杆菌 菌液中，蘸取一环菌液，盖上试管。 iiii.左手将皿盖打开一条缝隙，右手将沾有菌种的 接种环迅速伸入平板内，划三至五条平行线，盖 上皿盖。 iiiii.灼烧接种环，待其冷却后，从第一区域划线 的末端开始往第二区域内划线，重复这一操作， 在三、四、五区域划线。
4号 混合 涂布
6号 普通 划线
实验步骤及现象
1.筛选分离含有重组DNA的受体细胞 ①设置对照组（2、4号）和实验组（1、3 号）； ②向实验组培养皿中加氨苄青霉素 ③向1、2号加含有重组DNA的大肠杆菌 向3、4号加混合大肠杆菌（既有普通的， 也有转基因的）
实验步骤及现象
④用涂布器涂布 i.用酒精灯灼烧涂布棒（靠近涂布端的手柄也 要灼烧）静置冷却（以防温度过杀死微生物）。 ii.用移液枪取50μl的大肠杆菌加至培养基上。 1000μl=1ml iii.用涂布棒将其均匀涂布于平板上。 iiii.静置5min，倒置培养于37°C的培养箱中。 ⑤在培养皿壁上写、姓名、实验名称，一天后 调查统计各个处理菌落数目。
实验结果与分析
•未加氨苄青霉素 •所加菌液：混合 •分离方法：涂布 •现象：分布均匀， 但有杂菌。
实验结果与分析
•未加氨苄青霉素 •所加菌液：普通 •分离方法：划线 •现象：无大肠杆菌， 但有几个黄色杂菌。
实验结果与分析
•加氨苄青霉素 •所加菌液：转基因 •分离方法：涂布 •现象：分布均匀， 相对较多。
实验二 大肠杆菌的分离与培养
实验时间：2011.5.23
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实验原理 实验器材与药品
实验步骤及现象
实验结果与分析 实验反思与总结
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实验原理
1.利用液体培养基可以扩大培养大肠 杆菌； 2.利用固体培养基对大肠杆菌进行划 线分离、培养，目的是获得单菌落； 3.利用附加抗生素的培养基筛选含有 重组DNA的受体细胞。
实验步骤及现象
⑤划完线在培养壁上写班级、性名、实验 名称，放在37°C培养箱中倒置培养，一天 后处理菌落数目。
3.配制LB固体培养基 ①1.28g固体培养基，40ml的水（一瓶加氨 苄青霉素，另一瓶不加） ②灭菌 ③倒平板
实验结果与分析
•未加氨苄青霉素 •所加菌液：转基因 •分离方法：涂布 •现象：分布均匀， 数量适中。
实验器材与药品
器材：高压灭菌锅，培养皿，恒温水浴锅， 恒温培养箱，摇床，酒精灯，涂布器，接 种环，移液枪，电子秤，锥形瓶；
药品：LB液体和固体培养基，去离子水， 70%酒精，氨苄青霉素，大肠杆菌，含有 重组DNA的大肠杆菌。
实验步骤及现象
1号 转基因 涂布
3号 混合 涂布
5号 普通 划线
2号 转基因 涂布