多穗柯三叶苷的抑制糖尿病关键酶活性和抗氧化性_张毅

1.3 1.3.1
分析检测方法 色谱条件
式中：A j 为样品组吸光度；A 0 为空白对照组吸光度。 将最大抑制率一半所需样品的浓度定义为 IC 50 以评 价对胰 α- 淀粉酶的抑制水平。 1.3.6 清除 DPPH 自由基能力测定 参照参考文献[17] 的方法，略作修改。以甲醇为溶 剂，配制不同质量浓度的样品溶液，吸取 50μL 待测液 于 96 孔酶标板中，加入 150μL DPPH 溶液 (0.2mmol/L)， 摇匀，25 ℃避光静置 30min，置于 517nm 波长处测定吸 光度。按式(3) 计算对 D PPH 自由基的清除能力。 A0 － A t Q/%=————×100 A0 (3)
Inhibitory Potential of Trilobatin from Lithocarpus polystachyus Rehd against Key Enzymes Linked to Type Ⅱ Diabetes and Its Antioxidant Activity
ZHANG Yi1，NING Zheng-xiang 1, * ，DONG Huang-qiang 2 (1. College of Light Industry and Food Sciences, South China University of Technology, Guangzhou 2. Department of Food Science, Foshan University, Foshan 528231, China) 510641, China；
式中：Q 为 DPPH 自由基清除率；A0 为不加试样 DPPH 溶液的吸光度；At 为加试样反应后 DPPH 溶液吸光度。 以清除 DPPH 自由基达到稳定态 50% 清除率所需加入 抗氧化样品的质量浓度为 IC 50 ，用以表示其抗氧化能力。
14.00 18.00
AU
5.966
8.477
6.00
10.00 时间 /min
行沸水浴 5min，冷却至室温后加入 10mL 蒸馏水以稀释， 在 540nm 波长处测定吸光度。抑制率按式(2) 计算。 A0 － Aj 抑制率/%=————×100 A0 (2)
图 1 多 穗 柯 三 叶 苷 提 取 物 高 效 液 相 色 谱 图 Fig.1 HPLC chromatogram of trilobatin separated from Lithocarpus polystachyus Rehd
Abstract：The inhibitory effects of trilobatin separated from Lithocarpus polystachyus Rehd on the activities of α-glucosidase and α-amylase were determined and compared with those of the anti-diabetic drug acarbose as a positive control and the type of the enzymatic inhibition on α-amylase was investigated. Also, rutin was used as a positive control to measure the ability of the trilobatin from Lithocarpus polystachyus Rehd to scavenge DPPH free radicals. The results showed that α-glucosidase activity was inhibited remarkably by the trilobatin, and the inhibition was noncompetitive and did not exhibit a significant difference when compared to acarbose. Its inhibition rate against α-amylase, however, was lower than that of acarbose despite of having stronger DPPH free radical scavenging effect than rutin. From these experimental results, a conclusion could be drawn that the trilobatin from Lithocarpus polystachyus Rehd is a potential anti-diabetic compound. Key words： trilobatin ；Lithocarpus polystachyus Rehd ； α -glucosidase； α -amylase；diabetes 中图分类号：Q946.83 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2011)05-0032-04
Ⅱ型糖尿病又称非胰岛素依赖型糖尿病(NIDDM) ， 表现为患者血糖水平升高 。近年来的流行病学研究表 明，餐后血糖水平是糖耐量受损 ( i m p a i r e d g l u c o s e tolerance ，IGT) 患者发展为Ⅱ型糖尿病的重要因素，严
[ 1]
制剂，它也是 α- 淀粉酶的强抑制剂 [ 7 ] 。阿卡波糖虽然 有效，但却存在引起肠道不适等明显的副作用[ 8 ] 。研究 指出这是由于对胰脏α- 淀粉酶的过度抑制引起的[7]。因此， 有必要寻找有效而副作用小的α- 葡萄糖苷酶抑制剂[9-10] 。 多穗柯(Lithocarpus polystachyus Rehd) 主要分布于 我国长江以南各省区[1 1- 12 ] ，是我国传统民间草药和保健 饮料植物[13] 。Dong 等[14 ] 用多穗柯黄酮粗提物灌胃处理 四 氧 嘧 啶 糖 尿 病 模 型 小 鼠 ，证 明 有 明 显 的 抗 糖 尿 病 活性。本实验将对多穗柯三叶苷抑制α- 葡萄糖苷酶、 α- 淀粉酶活性及抗氧化活性进行研究和评价。
色谱柱：Diamonsil C 18 (150mm × 4.6mm，5μm)； 流动相：甲醇、水体积比 6:4 ；流速：1. 0mL/min ；进 样量：1 0 μL ；检测波长：2 8 3 n m 。 1.3.2 电喷雾 - 质谱(ESI-MS )检测 喷雾毛细管电压 2.89kV，离子源温度 100℃，脱溶 剂气温度 250 ℃，负离子扫描，扫描范围 50 ～800 m/z 。 1.3.3 核磁共振(NMR)波谱分析 待测样品用 DMSO-d6 溶解后，在室温，400MHz 抑制α- 葡萄糖苷酶活性测定
※基础研究
1 1.1 材料与方法 材料、试剂与仪器
食品科学
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10min，加入 50μL 5.0mmol/L PNPG 溶液振匀，在 37℃ 水浴中反应 20min，加入 160μL Na2CO3 溶液 (0.2mol/L)终止 酶促反应，置于 405nm 波长处测吸光度( A ) 。由于多穗 柯三叶苷本身有颜色，因此每个样品需要测定背景吸 收，并最终测定结果进行校正。每个样品重复 3 次取平 均值。抑制率按式 ( 1 ) 计算。 A0 － Aj 抑制率/%=—————×100 (1) A0 式中：A j 为样品组吸光度；A 0 为空白对照组吸光度。 将最大抑制率一半所需样品的浓度定义为 IC 50 ，以 评价对α- 葡萄糖苷酶的抑制水平。采用 Lineweaver-Burk 作图法，对多穗柯三叶苷抑制α- 葡萄糖苷酶的机理进 行分析。 1.3.5 抑制α- 淀粉酶活性测定 参照参考文献[17]的测定方法，略作修改。取 40μL 待测液(0.8mg/mL 样品溶液或 0.8mg/mL 阿卡波糖溶液，以 同量缓冲液作为空白对照)于 25mL 比色管中，加入 200μL 胰α- 淀粉酶溶液 (1.0U/mL) ，在 37 ℃水浴中使酶活化
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食品科学
※基础研究
多穗柯三叶苷的抑制糖尿病关键酶活性和 抗氧化性
张 毅 1 ，宁正祥 1 , * ，董华强 2
(1. 华南理工大学轻工与食品学院，广东 广州 510641 ；2. 佛山科学技术学院食品科学系，广东 佛山 528231)
摘 要：从多穗柯中提取分离得到三叶苷，以抗糖尿病药物阿卡波糖为阳性对照，检测多穗柯三叶苷对小肠α- 葡 萄糖苷酶和胰脏α- 淀粉酶活性的抑制作用和对α- 葡萄糖苷酶活性抑制类型，并以芦丁为阳性对照检测其清除 DPPH 自由基能力。结果显示：多穗柯三叶苷对α- 葡萄糖苷酶有明显抑制作用，为非竞争性抑制，抑制效果与阿卡波 糖无明显差别，对α- 淀粉酶活性的抑制率低于阿卡波糖；清除 DPPH 自由基能力强于芦丁。表明多穗柯三叶苷是 一种有应用潜力的抗糖尿病活性物质。 关键词：三叶苷；多穗柯； α- 葡萄糖苷酶； α- 淀粉酶；糖尿病
条件下进行 1 H 和 13 C 核磁共振波谱分析。 1.3.4 参照参考文献[17]的测定方法，略作修改。取 60μL 待测液(0.8mg/mL 样品液、0.8mg/mL 阿卡波糖溶液，同 量的缓冲液作为空白对照)于 96 孔酶标板中，加入 50μL α- 葡萄糖苷酶溶液 (0.2U/mL)，振匀后于 37℃水浴保温
格控制餐后血糖可减少大血管及微血管并发症的发生[2-5]。 餐后血糖水平的上升与胰脏α- 淀粉酶促进淀粉水解和小 肠黏膜上的α- 葡萄糖苷酶水解葡萄糖苷键生成葡萄糖分 子密切相关[ 6 ] 。因此对α- 葡萄糖苷酶和α- 淀粉酶的抑 制是防治Ⅱ型糖尿病的一个有效途径。 阿卡波糖(acarbose) 是临床常用的α- 葡萄糖苷酶抑
6.699
多穗柯(Lithocarpus polystachyus Rehd)嫩叶采自贵 州东部山区。 根皮苷(99.7%) 、DPPH( 分析纯) 、α- 葡萄糖苷酶 (EC 3.2.1.20)、对硝基苯 - β-D- 半乳糖吡喃糖苷(PNPG)、 猪胰腺α- 淀粉酶(EC 3.2.1.1，VI 型) 美国 Sigma 公司； 抗坏血酸、芦丁(99.6%)、3,5- 二硝基水杨酸、酒石酸钠钾 (四水) 上海晶纯试剂有限公司；阿卡波糖 德国拜耳公司。 UV-260 紫外 - 可见分光光度仪 日本岛津公司； 2690 高效液相色谱仪 美国 Waters 公司；M2 e microplate reader 仪 美国 Molecular device 公司；ZQ2000 质 谱仪 美国 Waters 公司；DRX400 核磁共振波谱仪 德 国 Bruk er 公司。 1.2 多穗柯三叶苷分离纯化 提取分离步骤见参考文献[15-16] 。取多穗柯嫩叶，