pEGFP_C2_hTim_3真_省略_粒稳定转染16HBE细胞株的建立_刘嵘
稳定细胞株构建方法
稳定细胞株构建方法我折腾了好久稳定细胞株构建方法，总算找到点门道。
说实话，稳定细胞株构建这事，我一开始也是瞎摸索。
我先讲讲我最开始犯的错啊。
我就想着只要把目的基因转染进细胞不就成了嘛。
我就用了脂质体转染法，转染的时候，我就按照说明书大概弄了一下那个比例，结果转染效率超级低。
就像你想给一群人送信，结果只找到几个人能帮忙送，大部分信都送不出去一样，失败得很彻底。
后来我就研究转染效率低的原因。
发现那个脂质体和DNA的比例很关键。
我就开始一点一点试着调整比例，每次调整完就做一次转染，看看效果。
这就像做饭，盐放多放少得试出个合适的量。
经过好多次尝试，转染效率终于提高了一些。
转染成功只是第一步。
接下来要用抗生素筛选。
我一开始用的抗生素浓度不太对。
浓度低了吧，好多没转染成功的细胞也能存活，这样建出的细胞株就不纯。
浓度高了呢，连转染成功的细胞都被杀死了。
这就是我又一个失败的经历。
然后我就查各种资料，询问身边的同行，大概确定了不同细胞类型适合的抗生素浓度范围，再在这个范围内进行多次测试，才找到了合适的浓度。
我还试过病毒感染的方法构建稳定细胞株。
这个方法呢，病毒包装就很关键。
我自己包病毒的时候，一不小心就容易污染，前面的努力就白费了。
就像盖房子，基础都被破坏掉了。
我总结的经验就是，在包病毒的时候，所有的操作都要超级小心，从试剂的准备开始，每一步都要保证是无菌的，手消毒，台面消毒，试剂瓶消毒一个都不能少。
还有一点，无论是哪种转染或者感染的方法，细胞状态很重要。
我有一次没注意细胞的状态，拿了状态不太好的细胞做实验，转染后细胞死了一大片。
所以呢，养成提前查看细胞状态的习惯特别好。
一定要找那些看起来很健康的细胞来进行构建操作。
总的来说，稳定细胞株构建真的是个需要耐心，不断尝试并且细心对待每一个环节的工作啊。
人胚胎干细胞外源基因的瞬时表达效率
人胚胎干细胞外源基因的瞬时表达效率路君;陈宗峰;黄粱浒;谭建明【期刊名称】《中国组织工程研究》【年(卷),期】2011(015)010【摘要】背景:人类胚胎干细胞的修饰和操作技术多种多样,它们在效率、可靠性及安全性方面各有不同.目的:对比观察两种化学转染试剂转染含不同启动子的增强型绿色荧光蛋白表达载体在人胚胎干细胞中的表达效率.方法:采用Fugene HD和lipofectamine2000分别转染无滋养层培养的H9细胞,荧光显微镜下观察阳性克隆,流式细胞术分析不同载体pCAG-EGFP、pEGFP-N3在H9细胞中的表达效率.结果与结论:Fugene HD转染的pCAG-EGFP、pEGFP-N3两种载体在H9细胞中的表达效率分别为(42.45±3.32)%、(25.95±1.91)%,差异有显著性意义(P <0.05).lipofectamine2000转染的pCAG-EGFP、pEGFP-N3两种载体在H9细胞中的表达效率分别为(1.94±0.18)%、(1.49±0.33)%.采用Fugene HD转染的表达效率均高于lipofectamine2000转染的表达效率(P < 0.05).结果显示在人胚胎干细胞的H9细胞系中,Fugene HD的转染效率显著高于lipofectamine2000;CAG 启动子驱动的增强型绿色荧光蛋白表达效率显著高于CMV启动子.%BACKGROUND: Technologies designed to allow modification and manipulation of human embryonic stem cells (hESCs) is numerous and various in the complexity of their efficiency, reliability andsafety.OBJECTIVE: To compare effect of different enhanced green fluorescent protein (EGFP) expression vectors with different promoter on expression efficiency in human embryonic stem cells (hESCs).METHODS:The H9 cells cultured with non trophoblast were transfected with Fugene HD and lipofectamine 2000, positive colonies were detected under fluorescence microscope, and the expression efficiency were measured using flow cytometry analysis between different transfect vectors such as pCAG-EGFP and pEGFP-N3.RESULTS AND CONCLUSION: Expression efficiencies of pCAG-EGFP and pEGFP-N3 were (42.45±3.32)％ and (25.95±1.91)％ respectively in Fugene HD transfected hESCs, and they had statistically difference (P ＜0.05). It was (1.94±0.18)％and (1.49±0.33)％ in lipofectamine 2000. The expression efficiencies of pCAG-EGFP and pEGFP-N3 transfected with Fugene HD were higher than that transfected with lipofectamine 2000 (P ＜ 0.05).These results indicate that Fugene HD have the greater expression efficiency compared to lipofectamine 2000 in hESC line H9; expression efficiency of EGFP driven by CAG promoter is higher than that by CMV promoter.【总页数】4页(P1755-1758)【作者】路君;陈宗峰;黄粱浒;谭建明【作者单位】解放军南京军区福州总医院福建省移植生物学重点实验室,福建省福州市,350025;解放军南京军区福州总医院福建省移植生物学重点实验室,福建省福州市,350025;解放军南京军区福州总医院福建省移植生物学重点实验室,福建省福州市,350025;解放军南京军区福州总医院福建省移植生物学重点实验室,福建省福州市,350025【正文语种】中文【中图分类】R394.2【相关文献】1.农杆菌介导的外源基因在本氏烟中瞬时表达体系优化研究 [J], 陈思涵;钱靖;彭杰军;鲁宇文;郑红英;林林;燕飞;陈剑平2.拟南芥原生质体瞬时表达快速验证重组酶外源基因删除 [J], 池俊杰;戴绍军;魏建华;王宏芝3.植物中瞬时表达外源基因的新型侵染技术 [J], 杨丽萍;金太成;徐洪伟;李华;周晓馥4.农杆菌菌株及其侵染浓度和时间对基于菜豆黄矮病毒表达载体瞬时表达外源基因的影响 [J], 李颖;张悦婧;王馨;庞海龙;贾凌云;冯汉青5.农杆菌菌株及其侵染浓度和时间对基于菜豆黄矮病毒表达载体瞬时表达外源基因的影响 [J], 李颖;张悦婧;王馨;庞海龙;贾凌云;冯汉青因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
如何构建稳定转染的细胞系（株）？
如何构建稳定转染的细胞系（株）？稳定细胞株构建包含哪些关键步骤？A：如下♀一般稳定细胞株的构建包含以下几个部分：表达之类构建细胞转染pool细胞筛选单克隆筛选细胞库建立表达质粒构建A：如下♀将带有内切酶位点的抗体轻重链碱基序列通过聚合酶链反应(PCR) 方法合成，然后与载体连接构建表达质粒，抗体的轻重链可放在不同载体上。
为保证克隆到载体中的靶基因的准确性，在转染宿主细胞前需对表达质粒中的靶基因进行测序。
细胞转染A：如下♀将表达质粒通过四种不同的方法（化学法、物理法、脂质体转染、病毒转染）导入哺乳动物细胞内，最为常用的是电穿孔转染法、脂质体转染法和聚乙烯亚胺介导的转染方法。
转染的成功率取决于细胞的活性、质粒DNA 的纯度、转染试剂及转染方法。
Pool细胞筛选A：如下♀细胞池筛选与评估：转染后的细胞需要在选择性培养基中培养至活率完全恢复，用以产生稳定的细胞池。
选择试剂的使用取决于表达载体携带的选择基因及宿主细胞的类型。
过于CHO K1细胞，通常不含谷氨酰胺的培养基中添加MSX进行筛选；而DG44和DXB11细胞通过不含呈甘氨酸、次黄嘌呤和胸腺嘧啶，并对细胞池增加MTX的选择压力来提高抗体表达水平。
在细胞池筛选阶段，需要对细胞池表达抗体的产量和关键质量进行评估，根据评估结果选择3-4个细胞池进行克隆。
单克隆筛选A：如下♀单克隆筛选与评估：传统的单克隆筛选方法多采用有限稀释法，形成率呈泊松分布。
为保证单克隆的单一性，需要一轮以上的克隆筛选，通常低于1个细胞/孔的方法进行铺板，挑选300个克隆经过24孔板、6孔板、T方瓶的摇瓶逐级扩增，最后挑选出10-20个克隆进行摇瓶规模评估，根据细胞生长和产物质量特性，挑选出4-6克隆进一步在反应器中评估，并建立RCB。
三级细胞库的建立A：如下♀细胞库的建立为满足大规模抗体生产的需要。
根据生物反应器评估结果及细胞株稳定性研究数据，选择生产用工程细胞株及备选细胞株，并建立原始细胞库PCB，然后GMP条件下建立主细胞库和工作细胞库。
2021年真核细胞常见表达载体
真核细胞常见表达载体欧阳光明（2021.03.07）真核细胞, 表达载体1、pCMVp-NEO-BAN载体特点:该真核细胞表达载体分子量为6600碱基对，主要由CMVp启动子、兔β-球蛋白基因内含子、聚腺嘌呤、氨青霉素抗性基因和抗neo基因以及pBR322骨架构成，在大多数真核细胞内都能高水平稳定地表达外源目的基因。
更重要的是，由于该真核细胞表达载体中抗neo基因存在，转染细胞后，用G418筛选，可建立稳定的、高表达目的基因的细胞株。
插入外源基因的克隆位点包括Sal1、BamH1和EcoR1位点。
注意在此载体中有二个EcoR1位点存在。
2、pEGFP, 增强型绦色荧光蛋白表达载体(Enhanced Fluorecent Protein Vector)特点: pEGFP表达载体中含有绿色荧光蛋白，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。
载体骨架中的SV40origin使该载体在任何表达SV40 T抗原的真核细胞内进行复制。
Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV-TK基因的聚腺嘌呤信号组成，能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株。
此外，载体中的pUC origin 能保证该载体在大肠杆菌中的复制，而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在大肠杆菌中的表达。
用途: 该表达载体EGFP上游有Nde1、Eco47111和Age1克隆位点，将外源基因扦入这些位点，将合成外源基因和EGFP的融合基因。
借此可确定外源基因在细胞内的表达和/或组织中的定位。
亦可用于检测克隆的启动子活性(取代CMV启动子,Acet1-Nhe1)。
3、pEGFT-Actin, 增强型绿色荧光蛋白/人肌动蛋白表达载体特点:pEGFP-Actin表达载体中含有绿色荧光蛋白和人胞浆β-肌动蛋白基因，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。
载体骨架中的SV40origin使该载体在任何表达SV40 T抗原的真核细胞内进行复制。
人P2X7真核表达载体的构建及稳定转染细胞株的建立
人Ｐ２Ｘ７真核表达载体的构建及稳定转染细胞株的建立 魏林郁，卢娜，孟莉，李新娟，李璐，李超【基金项目】国家自然科学基金（８１２７１３７６）；河南省教育厅科学技术重点研究项目（１４Ａ３１００１９，１４Ａ３１０００９，１６Ａ３１００１１）；河南省基础与前沿技术研究计划资助项目（１１２３００４１０１６４）【收稿日期】２０１６ ０２ ２９【修回日期】２０１６ ０５ ３０△【通讯作者】Ｔｅｌ：０３７３ ３０２９１０４；Ｅ ｍａｉｌ：ｘｙｌｄｌ８＠１２６．ｃｏｍ共表达，并且不同Ｐ２Ｘ受体亚型彼此之间有着密切的拮抗或协同效应，又都以ＡＴＰ作为同一配体，因此难以在原代细胞中单独研究Ｐ２Ｘ７受体的结构、信号转导与调控机理。
因此本研究构建了ｐＥＧＦＰ Ｎ１／Ｐ２Ｘ７真核表达载体，转染人胚肾细胞（ＨＥＫ２９３），观察人Ｐ２Ｘ７的蛋白表达及在细胞内定位，建立稳定表达的ＨＥＫ２９３细胞株，旨在体外单独研究Ｐ２Ｘ７离子通道结构与功能，为进一步探讨Ｐ２Ｘ７受体相关疾病发病机理、治疗靶点及药物研发奠定基础。
１材料与方法１．１材料人脑组织Ｐ２Ｘ７全长ｃＤＮＡ（ＯｐｅｎＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，美国）；感受态细菌Ｅ．ｃｏｉｌＤＨ５ａ（北京天根生化科技有限公司）；质粒ｐＥＧＦＰ Ｎ１（上海吉凯基因化学技术有限公司）；ＨＥＫ２９３细胞由本实验室保存。
１．２仪器和试剂胎牛血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ，美国）；ＤＭＥＭ高糖培养基（杭州吉诺生物医药技术有限公司）；Ｘ ｆｅｃｔ转染试剂盒（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，美国）；限制性内切酶ＤｐｎＩ（ＴａＫａＲａ，日本）；质粒提取试剂盒（ＯＭＥＧＡ，美国）；Ｇ４１８（Ｓｉｇ ｍａ，美国）；兔源Ｐ２Ｘ７多克隆抗体（Ａｌｏｍｏｎｅ，以色列）；ＳＤＳ ＰＡＧＥ凝胶配制试剂盒、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ碱性磷酸酯酶显色试剂盒、Ｔｕｂｕｌｉｎ兔抗大鼠多克隆一抗、ＡＰ标记羊抗兔ＩｇＧ二抗（上海碧云天生物技术有限公司）；ＰＣＲ反应引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成；倒置荧光显微镜（ＺＥＩＳＳ，德国）；ＰＣＲ仪（Ｂｉｏ Ｒａｄ，美国）；激光共聚焦显微镜（Ｏｌｙｍｐｕｓ／ＦＶ１０００，日本）；流式细胞仪（ＢｅｃｋＭａｎ／ＦＣ５００，美国）。
pEGFP-HPV16E7重组融合蛋白质粒的构建及其表达
pEGFP-HPV16E7重组融合蛋白质粒的构建及其表达左泽华;李辉;伍欣星【期刊名称】《中国病毒学》【年(卷),期】2003(018)004【摘要】应用基因重组技术,构建增强绿色荧光蛋白(EGFP)与人乳头瘤病毒16型E7(HPV16E7)的重组融合表达质粒,经限制性内切酶酶切鉴定和PCR分析后,用基因转染技术将其导入小鼠肝癌细胞,荧光显微镜下观察融合蛋白的表达.酶切鉴定和PCR分析证实重组质粒中插入目的基因片段的大小、方向和插入位点均正确,在转染的小鼠肝癌细胞中观察到绿色荧光蛋白的表达.构建的pEGFP-HPV16E7融合表达质粒能直观地反映转染细胞中EGFP-HPV16E7融合蛋白的表达.由于转化率与表达率融为一体,故有利于对转染细胞的筛选,缩短转染细胞在体外的筛选的时间适用于对HPV16E7分子生物学特性、致瘤机理及APC提呈等的研究.为建立表达HPV16E7的实体瘤动物模型奠定了基础.【总页数】4页(P344-347)【作者】左泽华;李辉;伍欣星【作者单位】武汉大学医学院病毒学研究所分子生物学研究室,湖北武汉,430071;武汉大学医学院病毒学研究所分子生物学研究室,湖北武汉,430071;武汉大学医学院病毒学研究所分子生物学研究室,湖北武汉,430071【正文语种】中文【中图分类】R373【相关文献】1.重组融合蛋白Tumstatin-TNF-α分泌型真核表达载体的构建及其在中国仓鼠卵巢细胞中的表达 [J], 赵亮;姚丽娟;孔建新;濮跃晨;孙安源;罗以勤;张林杰2.人IL-6和TNF突变体重组融合蛋白表达质粒的构建及在大肠杆菌中的表达 [J], 刘丽;欧阳应斌;黄培堂;刘及3.组织蛋白酶B过表达质粒和特异性siRNA表达质粒的构建与转染及对血管平滑肌细胞作用初步探讨 [J], 张涛;羊镇宇;薄小萍;王强;陈茂华;李坚;郭素峡;冯健;尤华彦4.含弓形虫ROP1基因真核表达重组质粒DNA免疫小鼠的研究Ⅴ.IFN-γ基因真核表达重组质粒的构建及其在DNA免疫中基因佐剂的作用 [J], 郭虹;陈观今;郑焕钦5.弓形虫ROP1基因真核表达重组质粒DNA免疫小鼠的研究Ⅰ.pcDNA3-ROP1真核表达重组质粒的构建 [J], 郭虹;陈观今;周永安;郑焕钦;刘彦文因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
pEGFP-NTCP稳定转染HEK293细胞系的建立及鉴定
pEGFP-NTCP稳定转染HEK293细胞系的建立及鉴定陈雅;李静;张文政;罗敏;傅晓钟;刘亭【期刊名称】《中国药理学通报》【年(卷),期】2016(32)12【摘要】目的：高效快速地建立稳定高表达钠离子－牛磺胆酸共转运多肽（sodium taurocholate cotransporting polypeptide， NTCP）的HEK293细胞系。
方法构建可表达EGFP-NTCP融合蛋白的pEGFP-NTCP重组质粒，并利用FuGENE 6转染试剂将重组质粒转染至HEK293细胞中。
用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白表达情况，挑选转染细胞进行14 d G418筛选和单克隆培养，以获得稳定转染细胞株。
用RT-PCR法、qRT-PCR法和Western blot技术检测稳定转染细胞及正常细胞中NTCP mRNA和蛋白的表达情况，并进一步用超高效液相色谱－串联质谱法（UPLC-MS／MS）考察稳定转染细胞的牛磺胆酸摄取能力。
结果使用本文优化的方法，细胞转染率可达90％。
RT-PCR、qRT-PCR、Western blot和牛磺酸摄取实验结果显示：相对于正常组，在荧光显微镜下呈绿色荧光的转染细胞；其NTCP表达均显阳性（P＜0.01）；且稳定转染细胞的牛磺胆酸摄取能力明显升高（P＜0.05）。
结论高效快速地建立了稳定高表达NTCP的HEK293细胞系，为胆酸衍生物摄取机制研究奠定了基础。
%Abstrate:Aim To construct HEK293 cell line with stable and high expression of sodium taurocholate cotransporting polypeptide (NTCP ) efficiently and rapidly.Method Vector expressing EGFP-NTCP fusion protein was constructed and verified by DNA sequencing.The pEGFP-NTCP expression vector was transfected into HEK293 cells by FuGENE 6 transfection reagent. The transfected cells withhigh expression of green fluorescent protein were selected using fluorescence microscope for screening of G418 for 14 days to obtain cell lines stably and highly expressing NTCP.NTCP expression was detected by RT-PCR,qRT-PCR, Western-blot and the uptake experiment of taurocholic acid.Re-sult RT-PCR,qRT-PCR,Western-blot and the uptake experi-ment revealed that compared to the control cells,the expression of NTCP was significantly positive (P<0.01)in stable trans-fected cells showing green fluorescence (P<0.05 ).Conclusion The HEK293 cell line with stable and high expression of NTCP has been established efficiently and rapidly,which provides a cellular model for the study of the mechanism of the uptakeof bile acid derivatives.【总页数】6页(P1767-1771,1772)【作者】陈雅;李静;张文政;罗敏;傅晓钟;刘亭【作者单位】民族药与中药开发应用教育部工程研究中心，贵州贵阳 550004; 贵州医科大学药学院，贵州贵阳 550004; 国家苗药工程技术研究中心，贵州贵阳550004;民族药与中药开发应用教育部工程研究中心，贵州贵阳 550004; 贵州医科大学药学院，贵州贵阳 550004;民族药与中药开发应用教育部工程研究中心，贵州贵阳 550004; 贵州医科大学药学院，贵州贵阳 550004;民族药与中药开发应用教育部工程研究中心，贵州贵阳 550004; 贵州医科大学药学院，贵州贵阳550004;民族药与中药开发应用教育部工程研究中心，贵州贵阳 550004; 贵州医科大学药学院，贵州贵阳 550004;贵州省药物制剂重点实验室，贵州贵阳550004; 贵州医科大学药学院，贵州贵阳 550004【正文语种】中文【相关文献】1.稳定表达hOAT1的HEK293细胞系的建立及鉴定 [J], 李静;杨洋;肖涛;李韬;欧瑜;傅晓钟;刘亭2.甲状旁腺素受体真核表达载体的构建及稳定转染HEK293细胞系的建立 [J], 孟越;谢苗苗;林振;袁亮;李威;郝松;杨德鸿3.肝刺激因子稳定转染人肝癌细胞系的方法建立与表达鉴定 [J], 吴媛;张静;董凌月;安威4.人MCHR1真核表达载体构建及稳定转染HEK293细胞系的建立 [J], 袁成福5.稳定转染HSP72奶牛乳腺上皮细胞系建立与表达鉴定 [J],因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
pEGFP_N3_t_PA真核表达质粒的构建及其在成纤维细胞中的表达
3山东省优秀中青年科学家科研奖励基金资助项目(2004BS01012); 33通讯作者:E -mail :grli66bethesda @ 收稿日期:2008-06-20pEGFP -N3-t -PA 真核表达质粒的构建及其在成纤维细胞中的表达3王 栋 何成强 杨桂文 李国荣33(山东师范大学生命科学学院动物抗性生物学重点实验室,250014,济南∥第一作者24岁,男,硕士生)摘要 目的 利用基因工程技术克隆人组织纤溶酶原激活物(t -PA )基因并构建一种能高效、安全表达t -PA 的pEG FP -N3-t -PA 真核表达重组质粒,为进一步研制转基因动物奠定基础.方法 采用高效T riz ol 试剂快速从黑色素瘤细胞中提取总RNA ,RT -PCR 获得t -PA cDNA ,并将真核表达质粒pEG FP -N3和t -PA 基因片段分别双酶切,将回收的pEG FP -N3大片段(4.7kb )与t -PA 基因片段(1.1kb )重组.对pEG FP -N3-t -PA 质粒进行酶切鉴定和基因测序鉴定.脂质体介导pEG FP -N3-t -PA 转染成纤维细胞(NIH 3T 3),并用RT -PCR 法从mRNA 水平检测t -PA 的表达情况,用倒置荧光显微镜检测、分析其在NIH 3T 3细胞中的表达.结果 成功地从黑色素瘤细胞中克隆了t -PA 基因,并构建了以pEG FP -N3为载体的真核表达质粒载体,并能在真核细胞中表达、分泌t -PA.结论 含t -PA 基因真核表达质粒构建成功.关键词 组织纤溶酶原激活物; 真核表达质粒载体; 基因克隆; 成纤维细胞中图分类号 Q 344.13组织型纤溶酶原激活剂(tissue -type plasminogen activator ,t -PA )是一种丝氨酸蛋白酶,在体内广泛分布于血管内皮细胞、脑、成熟的卵母细胞、输卵管、胰腺等组织[1].它是由527个氨基酸组成的单链丝氨酸蛋白酶,具有选择性地在纤维蛋白表面活化纤溶酶原的性质,除参与机体凝血和纤溶的平衡调控外,还具有高效、特异的溶栓作用,是目前防治血栓性疾病最有效的药物之一[3,4].本研究用逆转录-聚合酶链式反应(Reverse T ranscriptase RT -PCR )技术,成功地从黑色素瘤细胞中克隆了人t -PA cDNA ,构建了含t -PA 基因的pEG FP -N3-t -PA 真核表达重组质粒载体,以期为探讨基因防治、以及转基因动物的研究奠定基础[1,2].1 材料与方法1.1 主要试剂 pEG FP -N3真核表达质粒由本实验室保存,总RNA 提取试剂盒,质粒提取试剂盒,RT -PCR 试剂盒,大肠杆菌菌株E .coli DH5α由天根生化公司提供,限制性内切酶,T 4DNA 连接酶,Ex T aq 酶、pM D18-T 载体由大连宝生生物公司提供;Lipofectamine 2000购于Invitrogen ;黑色素瘤细胞,成纤维细胞系(NIH 3T 3)由本实验室保存.其余试剂为电泳纯或分析纯.1.2 t -PA 基因引物设计 从G enBank 中查找下载人的t -PA 基因序列,由MEG A 4.0分析软件对t -PA 序列进行分析,阅读其框架,选取其具有功能的1060bp 的片段,根据引物设计原则设计一对引物,其5′端引物引入Hind Ⅲ酶切位点,3′端引物引入BamH I 酶切位点,并分别在上、下游引物的5′端引入4个保护碱基.上游引物是:5′-CG AT CG AAG CTT CG ATG T CTT AT C AGGG AAAC AG TG ACTG CT -3′(Hind Ⅲ);下游引物是:5′-C ATG ACGG AT CCCGG T CG C ATG TTG T C ACG-3′(BamH I ).1.3 t -PA 基因cDNA 克隆 依据T rizol 试剂盒说明,从人黑色素瘤细胞中提取总RNA ,按逆转录试剂盒使用说明进行RT -PCR 反应合成cDNA 第一链,然后以其为模板进行PCR 反应.取逆转录产物1μl ,加入5μl 10×Reaction Bu ffer ,4μl dNTP 混合物(2.5mm ol ΠL ),1μl Pyrobest DNA 聚合酶(2U Πμl ),t -PA 上游引物、下游引物各1μl ,加ddH 2O 至总体积50μl.将反应体系置于PCR 仪中,94℃预变性5min ,94℃30s ,56℃45s ,72℃1min ,31个循环后72℃延伸10min.1.0%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物,并按回收试剂盒说明对RT -PCR 产物快速纯化回收.1.4 PCR 扩增产物的克隆和鉴定 PCR 产物回收后,在T 4DNA 连接酶的作用下,与pM D18-T 载体连接,16℃水浴4h ,连接产物转化入E .coli DH5α感受态细胞.37℃培养过夜,挑取转化生长的阳性菌落,应用质粒提取试剂盒提取重组质粒,分别用PCR 和双酶切对重组质粒进行鉴定.并送菌种至华大基因科技公司对阳性克隆片段进行双向测序分析.9012008年12月第23卷 第4期山东师范大学学报(自然科学版)Journal of Shandong N ormal University (Natural Science )Dec.2008V ol.23N o.41.5 pEG FP -N3-t -PA 真核表达重组质粒的构建[5] 用Hind Ⅲ和BamH I 双酶切回收的t -PA 片段定向插入用同法酶切的pEG FP -N3载体启动子下游,得到重组质粒pEG FP -N3-t -PA.构建过程见图1.1.6 pEG FP -N3-t -PA 重组质粒的鉴定 用构建的pEG FP -N3-t -PA 重组质粒转化E .coli DH5α感受态细胞,筛选阳性克隆,扩增,提取并纯化重组质粒DNA ;将重组质粒用双酶切(Hind Ⅲ和BamH I )鉴定.1.7 pEG FP -N3-t -PA 真核表达重组质粒转染成纤维细胞 将NIH 3T 3细胞培养至对数生长期,接种于6孔板,待细胞密度为70%～80%时,用Lipofectamine 2000转染试剂盒进行转染,转染方法按说明书进行.重组质粒量为2μg Π孔.加入转染试剂和质粒后,细胞放置37℃5%C O 2孵育箱孵育4h ,去除转染复合物并加入含10%小牛血清的新鲜培养液,培养24～48h ,荧光显微镜下观察.1.8 RT -PCR 法检测质粒转染成纤维细胞后t -PA 基因的mRNA 表达 收集培养的成纤维细胞(1.5×106个Πm l ),按T rizol 试剂盒说明书提取总RNA ,并以它为模板进行RT -PCR ,扩增t -PA cDNA ,其程序同前.图1 pEG FP -N3-t -PA 构建图图2 人黑色素瘤细胞中t -PA 基因的RT -PCR 产物1.DNA M arker D L2000;2、3、4、5.t -PA 基因RT -PCR 扩增产物.图3 pM D18-T -t -PA 重组质粒的鉴定结果1.重组质粒pM D18-T -t -P A 经PCR 扩增t -P A 基因产物;2.质粒pM D18-T -t -PA ;3.重组pM D18-T -t -PA 经Hind Ⅲ和BamH I 双酶切;4.DNA M ark D L2000plus.2 结 果2.1 t -PA 基因片段的扩增 用所设计的引物,对人黑色素瘤细胞中的t -PA 进行RT -PCR 扩增,其扩增的基因片段大约为1.1kb ,其中含酶切位点、起始密码子和终止密码子,结果见图2.2.2 t -PA 基因片段与pM D18-T 质粒连接和重组质粒的鉴定 纯化的PCR 产物经T 4DNA 连接酶与pM D18-T 质粒连接后,转化DH5α,随机挑选出阳性重组子菌落进行扩增培养,用PCR 法扩增出约1.1kb 的t -PA 基因片段;同样用Hind Ⅲ和BamH I 双酶切重组质粒也可分离到1.1kb 的基因片段和开环质粒pM D18-T (2.6kb ).结果见图3.2.3 测序结果及比对分析 将华大公司测序结果与G ene Bank 中的t -PA cDNA 序列进行比对,结果完全一致,见图4.2.4 t -PA 基因片段与pEG FP -N3质粒连接和重组质粒的鉴定 纯化的PCR 产物经T 4DNA 连接酶与pEG FP -N3质粒连接后,转化DH5α,随机挑选出阳性重组子菌落进行扩增培养,用PCR 法扩增出约1.1kb 的t -PA 基因片段;同样用Hind Ⅲ和BamH I 双酶切重组质粒也可分离到1.1kb 的基因片段和开环质粒pEG FP -N3(4.7kb ),结果见图5.2.5 pEG FP -N3-t -PA 质粒转染NIH 3T 3细胞后融合蛋白的表达 采用脂质体法将pEG FP -N3-t -PA 质粒转染NIH 3T 3细胞24h 后,倒置荧光显微镜下观察,见转染后的NIH 3T 3细胞发出的绿色荧光,说明质粒转染NIH 3T 3细胞后有融合蛋白的表达,见图6.2.6 RT -PCR 法检测t -PA 基因转染成纤维细胞后t -PA mRNA 表达水平 经对pEG FP -N3-t -PA 转染的细胞总RNA 进行扩增,结果转染重组质粒组扩增出约1.1kb 左右的cDNA 片段,见图7.11第23卷山东师范大学学报(自然科学版)第4期 图4 DNAstar 将测得序列与G enBank中已知序列E01466比对结果图5 pEG FP -N3-t -PA 重组质粒的鉴定结果1.D N A M ark D L2000plus ;2.重组质粒pEG FP -N3-t -P A 经H indⅢ和BamH I 双酶切后产物;3.质粒pEG FP -N3-t -PA ;4.重组质粒pEG FP -N3-t -P A 经PCR 扩增t -P A 基因产物.图6 pEG FP -N3-t -PA 质粒转染 NIH 3T 3细胞后融合蛋白的表达图7 t -PA 转染NIH 3T 3RT -PCR 结果1.DNA M arker D L2000;2.重组质粒pEG FP -N3-t -PA 转染NIH 3T 3细胞后t -PA 基因RT -PCR 扩增产物;3.重组质粒pEG FP -N3-t -PA 经PCR 扩增t -PA 基因产物;4.未转染质粒的NIH 3T 3细胞t -PA 基因RT -PCR 扩增产物.3 讨 论人组织型纤溶酶原激活剂(t -PA )由于对血栓具有较好的特异性亲和作用,溶栓效果好,溶栓后再出血的发生率低,在心肌梗塞症状发作后的短时间内给药效果明显,安全性高已经成为治疗血栓性疾病的首选药[5].但是其半衰期短,需持续用药,费用极为昂贵又使其大规模应用于临床受到了限制,因此将外源性t -PA基因导入体细胞,使之在局部持续分泌出活性较高的基因产物,以防治血栓形成的方法,具有良好的应用前景[6,7].用质粒携带目的基因转染靶细胞可以获得良好的目的基因表达,并且质粒制备简单,成本低,较少产生抗原性,重复使用性好,安全性高,适合临床应用[8].我们选用的真核质粒pEG FP -N3是一种新型真核表达载体,能在大多数哺乳动物细胞内高效表达,该载体除保留有能在多种细胞中促进重组蛋白高表达的人巨细胞病毒(C M V )增强启动子及易于插入外源基因片段的多克隆位点外,还含有EG FP 报告分子,当其和目的基因一起融合表达时,无需加任何底物、荧光性质稳定、对细胞无毒性、使用方便.这为我们后期转基因动物的鉴定及基因表达位置的确定奠定了基础.本研究通过应用基因重组技术,成功构建了pEG FP -N3-t -PA 真核表达载体;将该载体转染NIH 3T 3细胞,荧光显微镜下观察证实该载体在真核细胞内可成功表达t -PA -EG FP 融合蛋白,这为今后血栓相关性疾病的t -PA 基因治疗研究奠定了坚实的基础,也进一步为利用显微注射法制备转基因动物铺平道路.111第4期王 栋,等:pEG FP -N3-t -PA 真核表达质粒的构建及其在成纤维细胞细胞中的表达第23卷 第23卷山东师范大学学报(自然科学版)第4期 4 参考文献[1] H oylaerts M,Rijken D C,Iijnen H R,et al.K inetics of the activation of plasm inogen by human tissue plasm inogen activator[J].J Biol Chem,1981,(257):2912[2] 张永忠.转基因动物的应用与展望[J].山东师范大学学报(自然科学版),2001,16(1):83～87[3] C ollen D.On the regulation and control of fibrionlysis[J].Thromb Haem ostasis,1980,43(1):77[4] Bell L D.Chem ical synthesis,cloning and expression in mammalian cells of a gene coding for human tissue-type plam inogen activator[J].G ene,1998,63(4):155[5] 萨姆布鲁克J,拉塞尔D W.分子克隆实验指南第三版[M].黄培堂等译.北京:科学出版社,2002.45～105[6] W augh J M,K attash M,Li J.et al.G ene therapy to prom ote thromboresistance:Local overexpression of tissue plasm inogen activator to prevent arterialthrombosis in an in viv o rabbit m odel[J].Proc Natc Acad Sci US A.1999,96(3):1065～1070[7] 张会亮,王建英,等.tPA特性及其利用转基因乳腺生物反应器生产研究进展[J].山东医药,2008,48(1):143～144[8] 庄文忠.动植物生物技术的交叉渗透及展望[J].山东师范大学学报(自然科学版),2002,17(1):79～80CLONING OF THE t-PA GENE AN D CONSTRUCTION OFpEGFP-N3-t-PA EXPRESSION VECTORWang D ong He Chengqiang Y ang G uiwen Li G uorong(C ollege of Life Science,K ey Laboratory for Animal Anti-S tress,Shangdong N ormal University,250014,Jinan,China)Abstract Objective T o construct a recombinant eukary otic expressing vector pEG FP-N3-t-PA including functional region of human tissue-type plasminogen activator(t-PA)gene to provide a basis for further study on the research of transgenic animals.Methods The t-PA cDNA was obtained from melanoma cell with RT-PCR and inserted into the Hind III and BamH I site of the plasmid pEG FP-N3,then,pEG FP-N3-t-PA was trans fected into NIH 3T3mediated by Lipfectin2000T M.The recombinant plasmid was proved success ful by restriction enzyme digestion and DNA sequencing.The expression of the chimeric protein was con firmed by fluorescent microscope and the t-PA expression level was tested by RT-PCR.The t-PA gene was cloned and the pEG FP-N3-t-PA vector was constructed.The t-PA expression in the eukary otic cell could be detected in the group with trans fected t-PA gene.The recombinant eukary otic expression plasmid is success fully constructed.K ey w ords T issue-type plasminogen activator; Eukary otic expression plasmid; gene cloning; NIH3T3 211。
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ＤＯＩ：１０．１３３５０／ｊ．ｃｊｐｂ．１４１００７·论著·ｐＥＧＦＰ－Ｃ２－ｈＴｉｍ－３真核表达载体的构建和ｈＴｉｍ－３质粒稳定转染１６ＨＢＥ细胞株的建立刘嵘１，李一荣２，胡丽华２＊（１．长江大学医学院病原生物学部，湖北荆州４３４０００；２．华中科技大学同济医学院附属协和医院检验科，湖北武汉４３００２２）【摘要】 目的 筛选表达Ｔｉｍ－３的人呼吸道相关细胞株，为进一步阐明Ｔｉｍ－３可能与人呼吸道疾病相关奠定基础；构建ｐＥＧＦＰ－Ｃ２－ｈＴｉｍ－３真核表达载体，以期用于ｈＴｉｍ－３的功能研究。
将测序正确的重组质粒ｐＥＧＦＰ－Ｃ２－ｈＴｉｍ－３转染入人支气管上皮细胞株１６ＨＢＥ中，筛选出阳性细胞克隆，为后续实验提供理论基础。
方法 用含１０％胎牛血清的高糖ＤＭＥＭ培养基于３７℃５％ＣＯ２饱和湿度培养箱中体外培养人呼吸道相关细胞株１６ＨＢＥ、Ａ５４９和ＧＬＣ－８２，调整细胞到最佳状态，对数生长期时收集细胞，抽提总ＲＮＡ，逆转录为ｃＤＮＡ。
参照人ＧｅｎＢａｎｋ中Ｔｉｍ－３基因的全长序列，使用Ｐｒｉｍｅｒ５．０设计并合成其引物，采用ＰＣＲ检测以上３种细胞Ｔｉｍ－３的ｍＲＮＡ。
将健康人外周血Ｔｉｍ－３基因全长ｃＤＮＡ片段克隆入真核表达载体ｐＥＧＦＰ－Ｃ２，经菌落ＰＣＲ、双酶切及测序鉴定，构建包含目的基因Ｔｉｍ－３的重组质粒ｐＥＧＦＰ－Ｃ２－ｈＴｉｍ－３。
利用脂质体介导ｐＥＧＦＰ－Ｃ２－ｈＴｉｍ－３质粒和ｐＥＧＦＰ－Ｃ２质粒分别转染１６ＨＢＥ细胞，荧光显微镜下观察１６ＨＢＥ细胞的瞬时转染效率，并采用含Ｇ４１８的培养基筛选以获得整合ｐＥＧＦＰ－Ｃ２－ｈＴｉｍ－３和ｐＥＧＦＰ－Ｃ２的阳性细胞克隆，用荧光显微镜观察ｐＥＧＦＰ－Ｃ２－ｈＴｉｍ－３和ｐＥＧＦＰ－Ｃ２在１６ＨＢＥ细胞上的定位表达。
结果 １）ＰＣＲ显示人呼吸道相关细胞株１６ＨＢＥ、Ａ５４９和ＧＬＣ－８２均表达Ｔｉｍ－３ｍＲＮＡ；２）构建了具有筛选特征和能够稳定表达的ｐＥＧＦＰ－Ｃ２－ｈＴｉｍ－３质粒载体，测序结果与预期设计完全一致；３）瞬时转染后经荧光显微镜检查可见表达ｐＥＧＦＰ－Ｃ２－ｈＴｉｍ－３绿色荧光蛋白的１６ＨＢＥ细胞不足８％，表达ｐＥＧＦＰ－Ｃ２绿色荧光蛋白的１６ＨＢＥ细胞不足１５％。
采用Ｇ４１８筛选后获得表达野生型ｈＴｉｍ－３和外源性ｐＥＧＦＰ－Ｃ２－ｈＴｉｍ－３的１６ＨＢＥ细胞及转染ｐＥＧＦＰ－Ｃ２空质粒的１６ＨＢＥ细胞，经荧光显微镜观察前者定位在胞膜上，后者定位于胞质中。
结论 人呼吸道相关细胞株１６ＨＢＥ、Ａ５４９和ＧＬＣ－８２均表达Ｔｉｍ－３ｍＲＮＡ，Ｔｉｍ－３可能与人类呼吸道疾病的发生和发展相关。
成功构建了真核表达载体ｐＥＧＦＰ－Ｃ２－ｈＴｉｍ－３并获得了高表达ｐＥＧ－ＦＰ－Ｃ２－ｈＴｉｍ－３的１６ＨＢＥ阳性克隆细胞，可供后续研究使用。
【关键词】 １６ＨＢＥ；ｈＴｉｍ－３；ＰＣＲ；克隆；转染；筛选【中图分类号】 Ｒ５８ 【文献标识码】 Ａ 【文章编号】 １６７３－５２３４（２０１４）１０－０８８６－０６［Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐａｔｈｏｇｅｎ Ｂｉｏｌｏｇｙ．２０１４Ｏｃｔ；９（１０）：８８８－８９３，９４５．］Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ，ｐＥＧＦＰ－Ｃ２－ｈＴｉｍ－３，ａｎｄ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ｏｆ ａ １６ＨＢＥ ｃｅｌｌｌｉｎｅ ｓｔａｂｌｙ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ａ ｐｌａｓｍｉｄ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｈｕｍａｎ Ｔｉｍ－３ＬＩＵ Ｒｏｎｇ１，ＬＩ Ｙｉ－ｒｏｎｇ２，ＨＵ Ｌｉ－ｈｕａ２ （１．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｐａｔｈｏｇｅｎ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｙａｎｇｔｚｅ Ｕｎｉ－ｖｅｒｓｉｔｙ，Ｊｉｎｇｚｈｏｕ４３４０２３，Ｈｕｂｅｉ，Ｃｈｉｎａ；２．Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｔｏｎｇｊｉ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ａｆｆｉｌｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｔｏｎｇｊｉ ＭｅｄｉｃａｌＣｏｌｌｅｇｅ，Ｈｕａｚｈｏｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＆Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｗｕｈａｎ ４３００２２，Ｃｈｉｎａ）＊【Ａｂｓｔｒａｃｔ】 Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅｓ Ｔｏ ｓｃｒｅｅｎ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｔｒａｃｔ ｆｏｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｔｉｍ－３ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏｌａｙ ｔｈｅ ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｅｌｕｃｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｔｉｍ－３ａｎｄ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｔｒａｃｔ ｄｉｓｅａｓｅｓ；ｔｏ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ ａｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ，ｐＥＧＦＰ－Ｃ２－ｈＴｉｍ－３，ｆｏｒ ｆｕｒｔｈｅｒ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｔｈｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ Ｔｉｍ－３（ｈＴｉｍ－３）；ａｎｄ ｔｏｔｒａｎｓｆｅｃｔ ｐＥＧＦＰ－Ｃ２－ｈＴｉｍ－３ａｎｄ ｐＥＧＦＰ－Ｃ２ｉｎｔｏ １６ＨＢＥ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｓｃｒｅｅｎ ｆｏｒ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｌｏｎｅｓ ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ｆａｃｉｌｉｔａｔｅ ｆｕｒｔｈｅｒｓｔｕｄｙ． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｂｒｏｎｃｈｉａｌ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ １６ＨＢＥ，Ａ５４９，ａｎｄ ＧＬＣ－８２ｗｅｒｅ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｉｎ ＤＭＥＭ ｗｉｔｈ ａｈｉｇｈ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｌｕｃｏｓｅ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄ ｗｉｔｈ １０％ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ．Ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ｗｅｒｅ ｍａｉｎｔａｉｎｅｄ ａｔ ３７℃ｉｎ ａ ５％ＣＯ２ａｔｍｏｓｐｈｅｒｅ ｗｉｔｈ ｓａｔｕｒａｔｅｄ ｈｕｍｉｄｉｔｙ．Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｗａｓ ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ ｆｒｏｍ ｈｅａｌｔｈｙ ａｄｕｌｔｓ ａｎｄ ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ ＥＤＴＡ－Ｋ２ａｓ ａｎ ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔ．Ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ ｗｅｒｅ ｓｅｐａｒａｔｅｄ ｕｓｉｎｇ Ｆｉｃｏｌｌ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ．ＲＮＡ ｗａｓ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅａｆｏｒｅｍｅｎｔｉｏｎｅｄ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ｕｓｉｎｇ ＴＲＩｚｏｌ ａｎｄ ｔｈｅｎ ｒｅｖｅｒｓｅ－ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ ｉｎｔｏ ｃＤＮＡ．ＰＣＲ ｗａｓ ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ Ｔｉｍ－３ｍＲ－ＮＡ ｉｎ ｔｈｅ ３ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ．Ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ ｗｅｒｅ ｈａｒｖｅｓｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｏｆ ｈｅａｌｔｈｙ ａｄｕｌｔｓ，ａｎｄ ｔｈｅ ｆｕｌｌ－ｌｅｎｇｔｈ ｃＤＮＡ ｏｆｔｈｅ ｈＴｉｍ－３ｇｅｎｅ ｗａｓ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ．Ｔｈｅ ｆｕｌｌ－ｌｅｎｇｔｈ ｃＤＮＡ ｏｆ ｔｈｅ ｈＴｉｍ－３ｇｅｎｅ ｗａｓ ｃｌｏｎｅｄ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｐｌａｓｍｉｄ ｐＥＧＦＰ－Ｃ２．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｉｎｇ ｐｌａｓｍｉｄ ｗａｓ ｖｅｒｉｆｉｅｄ ｕｓｉｎｇ ＰＣＲ，ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅ ａｎａｌｙｓｉｓ，ａｎｄ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．Ｔｈｅ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒ ｐＥＧＦＰ－Ｃ２－ｈＴｉｍ－３ｗａｓ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ．Ｔｈｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｌａｓｍｉｄ ｐＥＧＦＰ－Ｃ２－ｈＴｉｍ－３ａｎｄ ｔｈｅ ｐｌａｓｍｉｄ·８８８·中国病原生物学杂志Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐａｔｈｏｇｅｎ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２０１４年１０月 第９卷第１０期Ｏｃｔｏｂｅｒ ２０１４，Ｖｏｌ．９，Ｎｏ．１０＊ 【通讯作者】 胡丽华，Ｅ－ｍａｉｌ：ｘｈｈｌｈ＠１２６．ｃｏｍ 【作者简介】 刘 嵘（１９７９－），女，湖北人，博士，讲师。
主要从事分子免疫学及细胞遗传学的教学与研究。
Ｅ－ｍａｉｌ：ｒｏｎｇｌｉｕ９９＠１６３．ｃｏｍｐＥＧＦＰ－Ｃ２ｗｅｒｅ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ ｉｎｔｏ １６ＨＢＥ ｃｅｌｌｓ ｕｓｉｎｇ Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｗｅｒｅ ｏｂ－ｓｅｒｖｅｄ ｕｓｉｎｇ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ．Ｔｈｅ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ １６ＨＢＥ ｃｅｌｌｓ ｗｅｒｅ ｓｃｒｅｅｎｅｄ ｗｉｔｈ ０．６ｍｇ／ｍｌ ｏｆ Ｇ４１８ａｎｄ ｗｅｒｅｍａｉｎｔａｉｎｅｄ ｗｉｔｈ ０．４ｍｇ／ｍＬ ｏｆ Ｇ４１８ｆｏｒ ｔｗｏ ｗｅｅｋｓ．Ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ １６ＨＢＥ ｃｅｌｌｓ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄｗｉｔｈ ｐＥＧＦＰ－Ｃ２－ｈＴｉｍ－３ａｎｄ ｐＥＧＦＰ－Ｃ２ｗａｓ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｕｓｉｎｇ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ． Ｒｅｓｕｌｔｓ １．ＰＣＲ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎｄｉｃａ－ｔｅｄ ｔｈａｔ ｈＴｉｍ－３ｗａｓ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ａｎｄ ｉｎ １６ＨＢＥ，ＧＬＣ－８２，ａｎｄ Ａ５４９ｃｅｌｌｓ．２．ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ｐｌａｓｍｉｄ（ｐＥＧＦＰ－Ｃ２－ｈＴｉｍ－３）ｗａｓ ｉｎ ａｃｃｏｒｄａｎｃｅ ｗｉｔｈ ｔｈａｔｏｆ ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏｓ．ＢＣ０６３４３１ａｎｄ ＡＦ４５０２４２．３．Ａｆｔｅｒ ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ，ｆｅｗｅｒ ｔｈａｎ ８％ｏｆ １６ＨＢＥ ｃｅｌｌｓｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｐｌａｓｍｉｄ ｐＥＧＦＰ－Ｃ２－ｈＴｉｍ３ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｆｅｗｅｒ ｔｈａｎ １５％ｏｆ ｔｈｅ １６ＨＢＥ ｃｅｌｌｓｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｐｌａｓｍｉｄ ｐＥＧＦＰ－Ｃ２ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ．Ａｆｔｅｒ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｗｉｔｈ Ｇ４１８，ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｍｉ－ｃｒｏｓｃｏｐｙ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｔｈａｔ ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎ １６ＨＢＥ ｃｅｌｌｓ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｐｌａｓｍｉｄ ｐＥＧＦＰ－Ｃ２－ｈＴｉｍ３ｗａｓ ｌｏｃａｔｅｄ ｏｎｔｈｅ ｃｅｌｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ，ｓｕｇｇｅｓｔｉｎｇ ｔｈａｔ ｈｕｍａｎ ｆｌ－Ｔｉｍ３ｗａｓ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ．Ｔｈｅ ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｏｆ １６ＨＢＥｃｅｌｌｓ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｐｌａｓｍｉｄ ｐＥＧＦＰ－Ｃ２ｗａｓ ｍａｉｎｌｙ ｌｏｃａｔｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｃｅｌｌ ｃｙｔｏｐｌａｓｍ． Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ ＨＴｉｍ－３ｗａｓ ｅｘ－ｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ａｎｄ ｉｎ １６ＨＢＥ，ＧＬＣ－８２，ａｎｄ Ａ５４９ｃｅｌｌｓ，ｓｕｇｇｅｓｔｉｎｇ ｔｈａｔ Ｔｉｍ－３ｍａｙｂｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｔｒａｃｔ ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｔｈｅ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ｐＥＧＦＰ－Ｃ２－ｈＴｉｍ－３ｗａｓ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ｓｕｃ－ｃｅｓｓｆｕｌｌｙ．Ａ １６ＨＢＥ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ ｔｈａｔ ｗａｓ ｓｔａｂｌｙ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｖｅｃｔｏｒ ｐＥＧＦＰ－Ｃ２－ｈＴｉｍ－３ｗａｓ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ．【Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ】 １６ＨＢＥ；ｈＴｉｍ－３；ＰＣＲ；ｃｌｏｎｅ；ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ；ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ 支气管变应性哮喘是一种常见的多发疾病，其发病受自身免疫状态、遗传、环境等多种因素的共同影响。