膜片钳之问题汇总

膜片钳网上问题收集汇总膜片钳之实验操作篇1、消化分离海马锥体细胞时，应该通氧气？不用通氧，直接放入CO2 孵箱里就行了。

电极内液应该过滤完分装入EPPENDORF 管，用时再拿出来。

尽量避免污染。

另外，环境中的灰尘也要考虑。

细胞外液要及时清洗。

2、全细胞破膜以后串联电阻总是在不断上升，膜渐渐的又融合起来了。

有没有什么办法解决串联电阻上升是由于破膜不完全，或者电极内液有污染堵塞电极所至。

解决方法：适当增大电极的口径，以利于破膜；电极内液使用前一定用0.22目滤器过滤；灌注电极液的器具也要保持洁净；电极现用现拉；电极下降入细胞外液时给予一定的正压防止此过程中灰尘堵塞电极。

3、破膜以后封接电阻有所降低的话，会不会影响记录到的动作电位？通常情况下offset调0，是在zero程序下，holding在0，给一个5-10mv，持续2ms的电压刺激，然后用offset补偿电极尖端电位。

axon 破膜后电阻当然会下降，根据我的经验瞬时电阻应在100M以上，之后会上升，以稳定在500M以上的为佳，越高越好。

4、第一军医大学高天明教授组分离大鼠海马神经元的方法：脑片的制备与神经元的急性分离成年Wistar大鼠(200~250 g)麻醉后(水合氯醛40 mg/100 g)迅速断头取脑, 置于0~4℃的高浓度蔗糖溶液中冷冻约2 min, 再用振动切片机(World Precision Instruments MA752-045)切成400 μm厚的脑片。

高浓度蔗糖溶液的成分为(mmol/L): 蔗糖 234、 KCl 2.5、 Na2HPO4 1、 MgSO4 4、 CaCl2 0.1、 HEPES 15、葡萄糖 11、用1 mol/L的NaOH调pH值至7.3。

将切好的脑片置于通以95% O2+5% CO2混合气的EBSS液中孵育1~6 h (室温), 然后将脑片移入低Ca2+的羟乙基磺酸钠缓冲液中, 并在解剖显微镜下用细解剖针按Paxinos图谱所示, 将海马CA1区含锥体细胞层的一小块组织从脑片上分割下来, 将组织块放入用100% O2饱和的HBSS液中(33℃)用链白蛋白酶(protease XIV, 1.1~1.4 mg/ml)消化30~45 min后取出, 置于低Ca2+的羟乙基磺酸钠缓冲液中清洗3次, 用尖端经火抛光处理的吸管(口径依次为500、 300和150 μm)将之吹打成细胞悬液, 并移数滴至盖玻片上。

待细胞贴壁后, 先将盖玻片用浴槽液清洗两遍, 再移至浴槽内进行实验。

实验仅选用形态为锥形或梭形、有顶树突和基树突特征的锥体细胞进行记录。

5、阻断Na通道的TTX浓度应该是多大？500nM6、细胞的质量是实验的关键,如果细胞的质量不好,你的实验技术再高,结果也不会好的,"巧妇妇难为无米之炊",活性不好可能存在以下几个方面的问题:a.仔细检查一下配置溶液的水是否干净,我一直用的是去离子水;b.重新标定一下酸度计,溶液的PH值对细胞的活性的影响是很大的,c.调整一下消化酶的剂量,消化酶需要根据气候温度等情况不同随时加减d.消化的时间也是根据具体情况适当的缩短或延长.e.有时候动物的状态也会影响平滑肌细胞的活性质量的,假如动物挨饿,受冻,受热等使动物处于应急状态,细胞的质量也会下降的.7、对于血管平滑肌细胞的急性分离，我的体会是：a.分离液体最好是新配的，超过一周就不要再用了b. pH应为7.4为宜，宁偏碱不要偏酸c. 酶量与消化时间、消化温度（一般37℃）要自己多摸摸，不同细胞的条件不同d. 木瓜蛋白酶的效果比胶原酶好（具体原因我也说不清）尽管都注意了，但运气还是很重要。

8、封接问题：电极内压是不能给太高的,你想:如果压力太高的话,细胞内液往电极内流的速度不就更快了吗,RUNDOWN不就会更快了吗?你也不能把细胞压的太狠了,那样对细胞也是一个刺激,并且那样更不容易封接了,最好是电极尖端贴到细胞膜后稍微压一点,具体也没有办法说,只能靠自己体会。

9、破膜难：我估计你使用的是国产机器吧,我这里那台国产的机器破膜也是不好,有时候需要用嘴吸,有一次还吸了我一嘴的酚红,恶心了好几天,但是AXON和HEKA公司的两台只要封接好之后,一"zap"却很容易就破了.10、下压电极是指什么呢？是一入水是的电阻吗？我们实验室的要求是：一入水时电极的电阻通常在2-5M之间，如果是太小，可能是电极尖折了；如果太大，可能是电极尖被杂质堵了，那就需要更换一个新的电极了。

还有一个就是最好使用进口的电极，国产的各种参数不是很好，有时候会影响实验的。

11、以我的经验而言，做血管平滑肌细胞主要有4点：a. 分离：活性好的血管平滑肌细胞的分离比较困难，上面的帖子大体上说了一些。

b. 封接：由于平滑肌细胞比较小（一般只有20pF左右），封接时，首先应该用灌流液多冲洗几遍，以去除BSA的影响（李慈珍，1994）；其二，电极尖端压细胞时不能太狠，以免刺破细胞，以在高倍镜下看到细胞表面有一小凹陷为宜（这要多练习）；其三，细胞浴液（灌流液）为高渗液体比较容易封接（康华光，2003）。

c. 破膜：分离得到的平滑肌细胞膜都比较脆，所以，1）电极内负压大时，可能还没达到GW封接时细胞已破膜，所以宁可升得慢些；2）zap功能对血管平滑肌而言，太大了细胞容易掉，小了不起作用，具体的参数我认为是没有确定值的，使用时要多次摸索，结合负压吸引，个人的手法，熟练程度和运气都很重要。

d. 电流记录：血管平滑肌细胞钙电流非常小，如脑动脉只有30pA左右，rundown 现象又普遍存在，所以我最绝望的就是废了大半天劲却记录不到电流，这一点我还没解决。

12、穿孔模式：我曾经试过，的确是挺难的，首先对细胞的要求是很高的，，从钳制开始经过破膜出现微分电流，到膜片充分穿孔大约需要20-30min，加上给药的10-20min，细胞钳制以后至少要坚持30-40min左右。

绝大部分文献是用全细胞模式记录的。

13、平滑肌钙的电流的确是很小的，比心肌的小多了，并且个体的差异是很大的（胃的是这样的），这可能与它的活动特性是有关的。

我查阅国内外的一些文献的过程中发现，有2种解决方法：a、先应用一些药物比如ISO等将钙电流放大，这样就便于观察；b、将钙离子换成钡离子，由于钙通道对钡离子的通透性要比对钙离子的大，钡离子所负载的电流也要比钙离子的大，这样就容易观察了。

这两种方法的共同原则就好比是通过一个“放大镜”，可以更清楚的看到钙电流。

这样还有一个好处就是减弱了RUNDOWN的现象，但是只要是全细胞就不可避免的存在RUNDOWN，只能将其影响降到最低点，而不能彻底消除。

穿孔模式的RUNDOWN影响是最小的，可以忽略。

14、操作：操纵电极进入液面后，在未形成封接之前，不要移出液面。

电极进入液面后，电极电流曲线可能超越刻度之外，此时，实验者应降低放大器的增益，直至电流曲线在屏幕上再现，随后要消除电极和浴池电极之间的液结电位。

为此，首先将保持电压设置为0mv，并调节“电极失调控制”使电极直流电流接近于零。

封接的成功率与电极尖端入液后的时间成反比。

吉欧封接成后，电流波形再次变得平坦，使电极超极化由-40mv到-90mv，有助于加速形成封接。

为证实吉欧封接的形成，可以增加放大器的增益，从而可以观察到除脉冲电压的首尾二端出现电容性脉冲尖端电流之外，电流波形仍呈平坦状。

形成高阻封接后，记录实验结果之前，要进行参数补偿，以期获得符合实际的结果。

数据记录：应恰当的设置放大器的带宽，例如10KHZ，这样，在电流监测端将观察不到超越此频带以外的无用信息。

浴池和电极溶液渗透压和PH值的差异将严重影响多类离子电流。

细胞的膨胀和收缩可出现某些容积-调整的离子通道电导（Cl-1，K+和其他阳离子通道的变化）。

浴液中二价离子具有屏蔽表面膜电荷的作用，因而影响离子通道的电压依赖性。

例如钙离子去除会引起Rundown。

氯离子在细胞外液和细胞内液中必须含有氯（至少10mM）。

以便Ag/Agcl丝实现电子导电和离子导电的接口作用。

若溶液和电极充灌液中完全没有氯离子，导电作用将无法实现，除非使用琼脂盐桥。

15、神经元whole-cell patch，主要是海马和脊髓的急性分离以及培养细胞的，海马锥体神经元的大小一般在15微米（直径），培养的细胞可能会更大一点。

电极的入水电阻一般要求在3-5MΩ之间，入水前一般要给一个正压以防电极有脏东西堵塞，电极一般压在细胞表面横轴1/3和纵轴1/2交界处（因为细胞表面是球形的，位置不好会影响封接），在接触到细胞后电极继续下压（或斜下压）直至电阻改变0.1-0.2个单位后（如果要做穿孔，个人认为电阻变化1-2个单位比较利于封接和穿孔），松开正压进行负压封接，当电极电阻改变至100MΩ上就可以给holding电压以利于封接。

当电极电阻上GΩ后，松开负压，让细胞稳定1-2min，就可以开始吸破了。

16、小细胞的封接应该加大电极电阻的，我们做果蝇细胞时（直径3-5μm)电极入水电阻在6-10MΩ的。

同时胞内液比胞外液的渗透压要低一点的，这样细胞洗破后就不会皱缩了。

17、各位中有哪位做过转染细胞，想请教一下转染后的细胞在什么时候做最合适，我查了文献，有的说２４－４８Ｈ，有的４８－７２Ｈ，各位有什么高见呢？另外感觉转染细胞的形态和正常细胞有很大差异，而且细胞膜显得很脆，很容易吸破。

我觉得在２４小时内做基因已经表达，而且细胞状态会好些，可能更容易做成功。

18、各位中有哪位做过转染细胞，想请教一下转染后的细胞在什么时候做最合适，我查了文献，有的说２４－４８Ｈ，有的４８－７２Ｈ，各位有什么高见呢？另外感觉转染细胞的形态和正常细胞有很大差异，而且细胞膜显得很脆，很容易吸破，请各位高手指点迷津，万分感谢！通常情况下我做过电转染的细胞系在48-72H的whole-cell记录,这个时间是根据资料来定的,其实是取决于转染的基因表达产物(蛋白质)的半衰期.Patch的感觉也是细胞很脆,高阻封接的维持的时间短一半以上.一般是细胞膜光滑些的较好做,可能是那些损伤小,愈合快的细胞吧? 我的办法是多多做些细胞,工作量成倍增加!!19、动物麻醉和制动下，体温会下降，故应保温调节，加温维持肛温36-38℃.记录脊髓背角或腹角神经元将脊柱前后拉直以减小呼吸运动造成的位移。

记录脑神经元应在表面用温热石蜡制成一油槽，防止血管博动和呼吸运动的影响。

20、1），为什么绝大多数用急性分离大鼠海马神经元的文献上都是在CA1区做的？是否CA1区好做还是该区意义大？CA3和DG呢？有无这方面的有关大鼠海马各区解剖，生理等神经生物学方面的详细资料？2），通常切取海马脑片是按照冠状面切取的吗（我一直就是这样切的，是照图谱那样用振动切片机切的）？还是需要先将海马组织块剥出再切（那样不好做）？海马CA1区神经元对缺血缺氧比较敏感，因此对实验条件的要求也就更严格，而CA3和DG则不太敏感，所以选CA1区的神经元做意义比较大。