紫外线与超声波复合诱变选育红曲色素高产菌株的研究
红曲霉高产菌株筛选及固态发酵研究
红曲霉高产菌株筛选及固态发酵研究
红曲霉（Monascus）是一种重要的微生物资源，具有很高的发酵能力和广泛的应用价值。
红曲霉可以产生丰富的红色素，被广泛用于食品、饮料和保健品等行业。
本研究旨在
筛选高产红色素的红曲霉菌株，并研究其在固态发酵过程中的生长和产色情况。
从市场上购买了几种红曲粉样品，并进行菌株筛选。
将样品接种到琼脂平板培养基中，培养一段时间后，观察和比较菌落数量和颜色深浅，筛选出产菌量高和颜色鲜艳的菌株。
然后，选取产色较高的红曲霉菌株进行固态发酵实验。
制备适合红曲霉生长和产色的
固态培养基。
将红曲菌株接种到培养基上，使用恒温器控制温度和湿度。
在发酵过程中，
定期对培养基进行观察和采样，分析红色素含量的变化和菌落的生长情况。
通过对筛选出的菌株进行固态发酵研究，我们可以获得以下几个方面的结果：
1. 菌株的生长情况：通过观察和比较不同菌株的菌落直径和菌丝密度，可以确定哪
些菌株在固态发酵过程中具有较好的生长能力。
2. 产色情况：通过测定固态培养基中红色素的含量和颜色的深浅，可以确定产色较
高的菌株。
可以通过比较不同菌株在不同发酵时间下的红色素含量的变化趋势，确定最佳
的发酵时间。
3. 培养条件的优化：通过调节培养基的成分、pH值、温度和湿度等条件，可以进一
步提高红曲霉的产色能力和生长速度。
可以通过单因素实验和响应面实验等方法，确定最
佳的培养条件。
本研究通过筛选高产红色素的红曲霉菌株，并在固态发酵过程中研究其生长和产色情况，可以为红曲霉的产业化生产和利用提供科学依据和技术支持。
运用紫外诱变获得并筛选植酸酶高产菌株
运用紫外诱变获得并筛选植酸酶高产菌株摘要本文介绍了运用紫外诱变技术获得植酸酶高产菌株的方法，并对其进行筛选、鉴定及酶活测定。
通过实验验证，成功选育出一株植酸酶高产菌株，其酶活达到了较高水平。
介绍植酸酶是一种具有解除植物中植酸盐抗营养因子作用的酶。
在动物、人类体内，它能够释放无机磷以提高对磷的利用效率。
因此，植酸酶在生物技术和农业生产中具有极高的价值。
目前，获得植酸酶高产菌株的方法有很多，例如基因工程、长期培养筛选等。
然而，这些方法对设备、时间、技术水平等要求比较高，成本也比较高。
相比之下，运用紫外诱变技术获得植酸酶高产菌株更具优势。
紫外诱变是一种传统的微生物术语。
它是指用紫外线辐射处理微生物，产生突变，从而改变微生物的某些性状的过程。
它有着速度快、操作简便、筛选效果显著等优点。
实验材料和方法实验菌株以原繁压菌作为研究对象。
原繁压菌是一种常见的生物菌株，可用于生物技术、医药、环保等领域。
实验中使用的原繁压菌来自于某生物技术公司。
实验设备和试剂实验设备包括无菌工作台、高压灭菌器、紫外线灯、恒温振荡培养箱、分光光度计等。
试剂包括琼脂、LB培养基、植酸盐、硝酸钠、Na2HPO4等。
实验步骤1.取10微升的原繁压菌液放置于琼脂平板上，待其全面涂布后将其放入无菌工作台上恒温培养。
2.取1平板用紫外线灯辐照1分钟，同时对照组以同样方式处理。
3.将受照试验组培养菌悬浮于LB液体培养基中，恒温振荡培养，选取菌株后进行次级发酵。
4.通过过筛试验及酶活测定鉴定所获得的高产菌株。
实验结果及分析经过实验验证，紫外诱变成功激发原繁压菌中某些菌株的植酸酶高产潜力。
在恒温振荡扩大培养的过程中，筛选和鉴定了一类植酸酶高产菌株。
经过次级发酵，该高产菌株平均比对照组酶活测定提高了50%左右，酶活达到了200u/g左右。
本实验成功地运用了紫外诱变技术获得植酸酶高产菌株。
该方法操作简便，快速，能够筛选出带有目的性的高产菌株。
本实验结果可以为利用微生物生产高附加值产品提供实验参考。
高产红曲色素菌株筛选
高产红曲色素菌株筛选李永波;宋丽莎;肖国学;邓功成;李静【摘要】本实验以民间收集的红曲米为材料,分别从三个方面对红曲霉进行了研究:(1)将红曲霉进行初步选育和紫外线诱变后,选育出高产红曲色素的菌株,其紫外线诱变的垂直距离为30cm时,最佳照射时间为15 min,选育后其色价为910 U/g,比原菌株色价高105 U/g.(2)对单因子KNO3、钙镁片、Vb&Vc对红曲霉生长速度和产色素的能力作了初步的研究,结果表明:Vb&Vc 可以促进红曲霉的生长和色素的产生,KNO3 也可以促进红曲霉的生长和色素的产生,但效果不显著.在三者当中,Vb&Vc对红曲霉生长和产色的影响最大.【期刊名称】《黔南民族师范学院学报》【年(卷),期】2010(030)006【总页数】5页(P43-47)【关键词】红曲霉;诱变;色素【作者】李永波;宋丽莎;肖国学;邓功成;李静【作者单位】黔南民族师范学院,生命科学系,贵州,都匀,558000;黔南民族师范学院,生命科学系,贵州,都匀,558000;黔南民族师范学院,生命科学系,贵州,都匀,558000;黔南民族师范学院,生命科学系,贵州,都匀,558000;黔南民族师范学院,生命科学系,贵州,都匀,558000【正文语种】中文【中图分类】TQ925红曲霉 (Mononscus)是小型丝状好气性腐生真菌,属真菌界 (Eumycophyta)、子囊菌门 (Ascomycetes)、真子囊菌纲 (Euasco mycetes)散子囊菌 (Eurotiales)、红曲菌科 (Monascaceae)、红曲霉属 (Monascus)。
[1〗其能产生大量天然色素,是目前世界上唯一工业化生产食用色素的微生物。
[2〗红曲米是红曲霉寄生在米饭上发酵繁殖,经干燥后一种具紫红色的干米粒,又称红曲、丹曲、赤曲等。
[2〗它不仅具有较好的营养价值和一定的防腐作用,[3〗还具有降低血脂、降血压、降血糖、抑瘤抗癌、提高人体免疫力等药用功效,[4][5]长期使用对人体有益无害。
复合诱变选育高产洛伐他汀红曲菌
复合诱变选育高产洛伐他汀红曲菌作者：陈秉梅孙丽娟陈巧如来源：《福建农业科技》2020年第06期摘要：为了提高紫色红曲霉菌M21发酵产洛伐他汀的含量，首先确定了紫外线、亚硝酸和氯化锂单诱变剂的最适诱变剂量，再采用紫外亚硝酸和紫外氯化锂复合诱变剂对出发菌株M21进行诱变选育。
结果表明：最适处理剂量为紫外线照射时间90 s，亚硝酸处理时间30 min，氯化锂处理浓度0.8‰。
紫外氯化锂复合诱变剂在最适处理剂量下对原始出发菌株M21的复合诱变效果更佳，得到了3株高产突变菌株ULi17、ULi19和ULi26，洛代他汀产量比出发菌株分别提高75.2%、60.4%和67.0%，遗传稳定结果显示ULi17产量最高、遗传性状较为稳定，因此将ULi17确定为后续研究的出发菌株。
关键词：洛伐他汀;紫色红曲霉菌;诱变选育中图分类号： Q939.97文献标志码： A文章编号： 0253-2301（2020）06-0007-05DOI：10.13651/ki.fjnykj.2020.06.002Breeding of High-yield Lovastatin from Monascus Strains by Complex MutagenesisCHEN Bing-mei， SUN Li-juan， CHEN Qiao-ru（Fujian Vocational College of Bioengineering， Fuzhou， Fujian 350002， China）Abstract：In order to improve the content of lovastatin produced by the fermentation of Monascus purpureus M21， the optimal mutagenesis dose of single mutagen such as ultraviolet ray，nitrous acid and lithium chloride was firstly determined， and then the complex mutagens ofultraviolet ray-nitrous acid and ultraviolet ray-lithium chloride were used to mutagenize the original strain M21. The results showed that the optimal treatment dose was the irradiation time ofultraviolet ray being 90 s， the treatment time of nitrous acid being 30 min， and the concentration of lithium chloride being0.8‰. The complex mutagen of ultraviolet ray and lithium chloride had better effect on the complex mutagenesis of the original strain M21 under the optimal treatment dose， and the three high-yield mutant strains ULi17， ULi19 and ULi26 were obtained. The production of lovastatin was 75.2%， 60.4% and 67.0% higher than that of the original strain， respectively. The results of geneticstability showed that ULi17 had the highest yield and stable genetic characters， so ULi17 was identified as the original strain for the subsequent studies.Key words：Lovastatin; Monascus purpureus ; Mutation breeding近年來，高胆固醇血症发生率正以惊人的速度增长，可引发多种心血管疾病并发症，因此严重威胁到公众健康。
红曲霉菌产红曲色素的紫外诱变及产素的工艺优化
１ 概 述 ２ ． ２方 法
红曲色素（ 红曲红 ） 是 由红曲菌经大米 、 大豆等为 主要原料发酵 培养方法 ： 将 已活化 的菌种按表 １中的接种量接 于相应培养基 而成 的优质 的天然食用色素 ， 对枯草芽孢杆菌 、 金黄色葡 萄球菌具 中， 并按表 １ 将实验号标记在锥形瓶上 。将接种完成 的培养基按 照 有较强的抑 制作用 ， 且对蛋白质有着极强的着色性能 ， 不易褪色。目 表 １ 中诱变时间所对应的试验号放置 于紫外灯下 。 按实验计划控制 前， 合成色素 的毒副作用引起 了人们的重视。 红曲菌着色不但安全 、 诱变时间 ， 待诱变结束 ， 于恒温摇床 中， 转数 为 １ ８ ０ ， 温度为 ３ ０ ￣ Ｃ， 发 有益健康且色泽亮丽 ， 因而在众多生物色素中吸引着无数 学者研究 酵时间为 ７天（ 即１ ６ ８ ｈ ） 。 人员的注意Ｉ Ｓ ］ 。然而红 曲色素色价偏低 已成 为制 约其工业化生产 的 红 曲色素测定［ ７ － ８ １ ： 将发酵液从摇床 中取 出， 将发酵液放置于 ０ ￣ Ｃ ５ ａ ｒ ｉ ｎ ， １ ５分钟后取 出处理号 为 １的 ３只锥形 瓶 ， 从 重要原 因之一目 ， 因此如何提高红 曲色素色价 ， 对工业 生产具有重要 的温度 下冷藏 １ 的现实意义 。 本次本次实验 以菌种的诱 变优化 ， 培养基基质 ， 装瓶量 每 只锥形瓶 中准确量 取 ５ ｍ ｌ 菌液 ， 加５ ｍｌ 乙腈 ， 超声波震碎 ３ 分钟 ， 为研究点 ， 测定 三者能否提高红曲霉菌产红 曲色素的色阶值 。 ８ ０ ０ ０ 转／ ｍ ｉ ｎ离心 ５分钟 。 取上层清液。 用移液枪取 ３ ｍｌ 放 于比色皿 ２ 实验 材 料 与 方 法 中， 以３ ｍｌ 乙腈 作为对照样 品， 在波长 ５ １ ０ ｎ ｍ处测定其 吸光度和透 ２ ． １ 实验材料 光率。 同理依次取 出处理号 为 ２ 、 ３ 、 ４ 、 ５ 、 ６ ， ７ 、 ８ 、 ９同方 法处理测定吸 ２ ． １ ． １ 菌种 。红 曲霉（ Ｓ Ｈ 一 １ １ 光度 ， 将测得的吸光度值乘以稀释倍数 即得该处理号的色价。 ２ ． １ ． ２培养基类别 。培养基 １ ： Ｎ ａ Ｎ Ｏ ３ ２ ｇ 、 Ｋ Ｃ １ ０ ． ５ ｇ 、 Ｋ ２ ＨＰ Ｏ ｌ ｇ 、 ３ 结 果 与 分 析 Ｍ ｇ Ｓ Ｏ ４ ０ ． ５ ｇ 、 Ｆ ｅ Ｓ Ｏ ０ ． ０ １ ｇ 、 麦芽糖 ３ ０ ｇ 、 蒸馏水 １ ０ ０ ０ ｍｌ 。培养基 ２ ： 马 ３ ． １ 红曲色素色 阶的测定数据分析 铃薯 ２ ０ ｇ 、 蒸馏水 １ ０ ０ ｍｌ 。 实验结果如表 １ 所示 ， 采用 ｍ ａ ｔ ｌ ａ ｂ软 件对 结果进行 回归 ， 回归 ２ ． １ ． ３主要仪器设备 。ａ ． 超声波细胞粉碎仪 ； ｂ ． 摇床 Ｑ Ｙ Ｃ － ２ １ ０ ２ Ｃ 模型如表 ２ 所示 。 而在表 ２的三因子综合 分析 中 ，培养 基因子 ｘ ， 的ｔ 为７ ． ５ １ ９ ８ ， 全温震荡培养箱 （ 宁波科技 园区新江南仪 器有限公 司） ； ｃ ． Ｕ Ｖ Ａ 一 ３ ４ ０ 紫外灯 ； ｄ ．紫外 ， 可见光分 光光度计 ｕ ｖ 一 ５ １ ０ ０型 Ｐ Ｈ Ｓ － ２ ５型雷磁 Ｐ为 ０ ． ０ ０ ０ ７ ≤Ｏ ． ０ １ ， 其影 响． 性远大于其它两因子 ， 更深层 次的从 数值 ｐ Ｈ计（ 上海仪 电科学仪器股份有 限公司 ） 。 里证明培养基对色 阶的影响最大。从表 ２看 ， 知 Ｆ检验差 （ 转下页 ）
紫外诱变结合化学诱变选育凝乳酶高产菌的研究
０４ ，Ｈ值 自然 。 ．％ ｐ 酪 蛋 白培养 基 ： 酪 素 １ ， 干 ％ 水解 酪蛋 白 ０１ ， ．％
琼 脂 ２ ｐ ．ｏ ％， Ｈ ７Ｏ ＇
复筛 ： 挑选的菌落进行摇瓶培养 ， 出凝乳 活 选 力 高的菌株 ， 连续转接 ５ ， 代 分别测定各代 菌株 的 凝 乳活力 、 白水解 活力 和蛋 白含量 。 蛋 筛选出凝 乳 活力较高 、蛋 白水解活力低 同时又具有遗传 稳定
２ ９
工 中 心 筛 选 保 藏 ， 号 为 Ｊ Ａ Ｂ）脱 脂 乳 粉 （ 西 编 Ａ Ｓ ； 新 兰 进 口 ）其 它 试 剂 为 分 析 纯 。 ；
１２ 仪 器 ．
２４ 硫 酸 二 Ｚ ｉ ＤＥ 诱 变 ． ； ￣（ Ｓ）
选取经紫外诱 变后酶活最高 的突变株 为 出发
菌 株 ，按 照 １２１ 取 单 细 胞 悬 浮 液 ，吸 取 ２ｍ ．． 制 Ｌ 菌 悬 液 到 ５ 三 角 瓶 内 ， 人 ８ｍＬ０１ ｏ Ｌｐ ０ｍＬ 加 ．ｍ ｌ Ｈ ／ ７０的 磷 酸 缓 冲 液 ， 加 人 Ｄ Ｓ５ Ｌ 加 入 少 量 ． 再 Ｅ ０ （ 酒 精 助溶 ， Ｅ Ｄ Ｓ处 理 浓 度 为 ０５ ，０ ，０ ／ｉ ．％）３ ℃ ２０ｒ ｎ ｍ 振 荡处 理 １ ０～６ ｎ后 加 入 ５ｍＬ２％的 Ｎ ２２， ０ｍｉ ５ ａＳ０；
ＵＶ ｎ ｅ ｉａｓ Ｍ ｕ ａ ｉｎ ａ ｄ Ｃｈ ｍ ｃ ｌ ｔｔ ｏ
ＧＡＯ ｎ ， ＡＮＧ ｉｇ ｈ ｉ ， ＩＹｕ ｑｕ ， Ｙａ Ｗ Ｊｎ — ｕ Ｌ — ｉ ＭＡ ｎ — ｕ ＹＡＮＧ Ｚ ｅ — ａ 一 Ｙｉｇ ｈ ｉ ， ｈｎ ｎｉ
（． ｏｌ ｅｏ ｏｄＳｉｎｅａｄＥ ｇｎｅｉｇＪｉ ｇｉｕｔｒｌ ｎ ｅｓｙ Ｃ ａｇｈ ｎ１０ ， ｈｎ ； １ Ｃ ｌｇ ｆＦ ｏ ｃｅｃ ｎ ｎｉｅｒ ｌ Ａ ｒ ｌ ａ ｉ ｒｉ ， ｈ ｃ ｕ ３ １８ Ｃ ｉａ ｅ ｎ ｉｎ ｃ ｕ Ｕ ｖ ｔ ｎ １
微波结合紫外诱变选育辅酶Q10高产菌株
ｆｒ ｎ ｅｍａｋ ｄ ｈｇ ｅ ａ ＮＵＢ ３ ｎｐｏ ｕ ｔ ｎｏ ｏ ｎ ｙ ０ ｔ１ ． １ｍｇ Ｌ，ｉｃｅ ｓｄｂ ８ ６ ％ ａ ｏ － ｏｍａ ｅ ｒｅ ｉｈ ｒｔ ｎＬ ｈ ３ ５ｏ ｒｄ ｃｉ ｆ ｅ ｚ ｍｅＱ１ａ ２ ０ ／ ｏ ｅ ｎ ｒａｅ ｙ６ ． ７ ｓｃｒ ｎ
Ａ ｓ ａ ｔ Ａ ａ ｏａ ｔ ｉ ｍｅ ｃ ｎ Ａ ）Ｌ Ｕ ３ ５ｗ ｓ ｓｄａ ｔ ｔ ｇ ｔ ｉ ， ｉ ｏ ｂ ｓ ｔ ｃ ｆ ｏ ｉｍ ｂ ｔ ｃ ｇ ｒ ｃ ｒ ｍ ｔ ｆ ｉ ｓ（ ｔ Ｎ Ｂ ３ ａ ｅ ｓａ ａ ｉ ｒ ｎ ｗ ｔ ｄ ｕ ｌ ｒ ｉ ａ ｅ ｄ ｒ ｂ ｅｕ ｕ ａ ｅ ｕ ｓｒｎ ｓａ ｈ ｅ ｅｓ ｎ ｏ ｓ ｕ
关键词
辅 酶 Ｑ 。诱 变育 种 ； 波 ； 微 Ｑ ３ ９３ 文献标识码 Ａ 文 章编 号 １０ ７ ２ （Ｏ Ｏ ０ ０ ５— ０ １ ２ Ｌ ）２—０５ Ｏ ０ ７一 ６
中 图分 类 号
Ｓ ｒ ｅ ｉｇ ａ ｄ Ｂ ｅ ｄｎ ｏ ｎ ｙ ０ ｇ — ｉｌｉ ｇ Ｓｒ ｉ ｃ ｅ ｎｎ ｎ ｒ ｅ ｉ ｇ Ｃ ｅ ｚ ｍｅＱｌ Ｈｉｈ Ｙ ｅｄｎ ｔａｎ
量 为 ｌ． １ｍｇＬ 较 出发 菌株 提 高 ６ ．７ ， 克 干 细 胞 含 Ｃ Ｑ。 ．６ｍｇ 较 出发 菌株 提 高 ３ ．０ 。 通 过 传 ２ ０ ／ ， ８６％ 每 ｏ 。２ ４ ， ８２％
代 实验 证 明该 突 变株 的遗 传 性 稳 定 ， 作 为进 一 步研 究的 实验 茵株 。 可
微 生物 学杂 志 ２１ 年３ 第３ 卷 第２ ＪＵ Ｎ Ｌ Ｆ Ｉ Ｏ ＩＬＧ ａ ２１ Ｖｌ ０ ｏ ００ 月 ０ 期 Ｏ Ｒ Ａ Ｃ Ｂ Ｏ ＹＭ ｒ ００ ｏ３ Ｎ・ ＯＭ Ｒ Ｏ ． ・ ２
高产酯化酶红曲霉菌株的筛选与诱变育种
高产酯化酶红曲霉菌株的筛选与诱变育种学生：陶清生物科学技术学院 08生物工程二班，学号 200842145213 摘要：为了获得具有高酯化能力的红曲霉菌株，通过从大曲中初筛选出9株红曲霉菌株，逐代处理后选出酯化酶产量高，特性好的菌株作为出发菌株，再对出发菌株进行紫外诱变，紫外与氯化锂复合诱变，硫酸二乙酯诱变等反复诱变，并进行筛选，结果得到酯化能力明显提高，遗传稳定，具有良好应用前景的菌株。
关键词：红曲霉；诱变育种；酯化能力；筛选前言：传统大曲浓香型白酒发酵周期长（40-50d)，出酒率低，是浓香型白酒生产的瓶颈，缩短发酵周期和提高浓香型白酒中的乙酸乙酯含量是提高浓香型白酒的产量与质量的关键。
一、红曲霉酿酒的研究背景浓香型白酒的主体香味物质是乙酸乙酯，窖香浓郁，绵甜甘洌，香味协调，尾净余长，是浓香型白酒的主要特征，深受广大消费者的喜爱，是我国生产量最大的白酒品种，传统的发酵方式具有多出不足导致白酒酿造的成本投入过大，而收益不高。
红曲霉在我国的应用历史悠久，红曲霉在发酵过程中能产生糖化酶，淀粉酶等一级代谢产物及色素，降胆固醇活性物质等次级代谢产物。
对其研究主要集中在食用色素，药用性次级代谢产物上[1]。
20世纪60年代初，中国科学院成都生物研究所吴衍庸教授从泸洒麦曲中分离到泸型酯化菌M101红曲霉菌株，为红曲在大曲白酒生产上的应用开拓了新途径，是我国白酒工业的一项重大创新[2]。
本研究志在在选育出具有高酯化能力，能够用于浓香型白酒生产的红曲霉菌株。
缩短浓香型白酒发酵周期，提高浓香型白酒质量和产量。
二、高产酯化酶的红曲霉的筛选（一）材料1、菌种大曲样品（采自四川某名酒厂）2、培养基糟浸液富集培养基：酒糟浸液10％；乙醇4％，麦芽汁调节糖度到10°Brix乳酸调节pH 到4．5。
糟浸液平板分离培养基：糟浸液10％；乙醇7％，麦芽汁调节糖度到10°Brix；琼脂2％，乳酸调节pH到4．5。
红曲霉高产水溶性色素菌株的筛选
红曲霉高产水溶性色素菌株的筛选摘要通过紫外诱变筛选出一株高产水溶性色素的红曲霉菌株，并对其生长特性进行研究，为开拓红曲色素的应用领域奠定了基础。
关键词红曲霉；紫外诱变；水溶性；色价食品的色泽是影响消费者购买欲望的一个重要因素，开发具有诱人外观的产品一直是食品工业的一个重要目标。
食品行业通过使用着色剂从而改善食品的外观、迎合消费者的需求。
目前使用的食品着色剂有2种类型：人工合成着色剂和天然着色剂。
天然着色剂包括天然物质提取物和微生物代谢产物，有着悠久的应用历史。
近100年来，人工合成着色剂因色彩鲜艳、性质稳定、着色力强、可任意调配、成本低廉、使用方便等优点，应用较广。
但是，随着消费者对化学合成制品的安全意识的提高，一些原被作为食品添加剂的材料被限制甚至禁止使用。
消费者越来越倾向于以天然色素作为食品添加剂。
红曲色素作为天然着色剂在我国已有几千年的应用历史，其无毒无害、色泽鲜艳、性能稳定、染着性强等特点符合食用色素的要求。
但这类色素以醇溶性为主，仅仅应用于酒、肉及腐乳等为数不多的食品中，大大限制了其应用领域。
人们为了克服红曲色素的醇溶性，使之转化成水溶性色素，进行了广泛的研究，但其成效均不理想。
本文从液态发酵工艺出发，通过分离和诱变的方法，选取产色素高、性能稳定的红曲霉菌种，并研究了其发酵特性，为红曲色素的大规模工业化生产作好准备。
1材料与方法1.1试验材料1.1.1菌种。
本实验室保留菌种（记作S）、凤城老窖酒厂提供的红曲霉菌种（记作F）。
1.1.2培养基。
①平板分离培养基和斜面培养基：麦芽汁琼脂培养基；②种子培养基：大米粉8%、NH4NO3 0.4%、KH2PO4 0.2%、MgSO4 0.1%、ZnSO40.02%、MnSO4 0.04%。
1.2试验方法1.2.1出发菌株孢子悬液的制备。
将保藏的菌种在30℃下活化3h后，用10mL 无菌水冲洗，注入带玻璃球的小锥型瓶中振荡，纱布过滤，得孢子悬液。
1.2.2平板分离筛选。
紫外-激光复合诱变选育天冬氨酸转氨酶高产菌株
［～ ］ １ ３
０
斜面 培养基 ： 白胨 ７ 氯化钠溶 液 ０ ５， 肉浸 蛋 ， ． 牛 膏 １， ０ 无水 硫 酸镁 溶 液 ０ ２ 磷 酸 二 氢 钾 溶 液 ０ ４， ．， ．
富马酸 ｌ ， 脂 ２ ． ，蒸 馏水 定容 ，氨水 调 ｐ 为 ０琼 １７ Ｈ
７． ， ０ ０．１ ＭＰａ ２ ｎ。 ０ ｍｉ
瑚 １ 。 ｎ
平 板 培养 基 ： 在斜 面 培养 基 的基 础上 加 入指 示
剂 ， ． Ｍ ａ灭 菌 ２ ｉ ０１Ｐ ０ｍ ｎ
再生 培养 基 ： 大肠 杆 菌 Ｒ 用 Ｓ 稳 定 液 配 Ｍ ＭＭ
置 ， ． ＭＰ ０ １ ａ灭 菌 ２ ｎ ０ｍｉ。 Ｓ ＭＭ缓 冲液 ： 蔗糖 １ １ Ｍｇ １４ １ 顺 丁烯 二酸 ７ ， Ｃ２ ． ，
仅 可得 到遗传性 稳定 的高 产 菌株 ， 且 操 作条 件 和 而 技 术要求 不高 ， 实验操作 也较 为容易 ， 因而使 其在 工 业微 生物 育种 中 占有绝对 优势 的地位 。 原生 质体诱变 是一种 在细胞 原生 质体化 后进行 诱变 的育种技 术 ， 细胞被脱 去细胞 壁之后 ， 使诱 变剂 更加 容易诱发 细胞 的遗传 基 因发 生突 变 ， 而 以更 从
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据文献报道，ＧＯＸ转化起始ｐＨ值为６．０，但由于其转 化过程中ｐＨ值会逐步降低，导致偏离起始ｐＨ值，以２．２．２优 化结果为基础，分别采用控制ｐＨ６．０不变及不控制ｐＨ值的 方法考察了其对产物转化率及ｅ．ｅ的影响。
由图２Ｃ可知，是否控制ｐＨ值对产物转化率影响不大，
万方数据
约为４６％左右（按Ｒ－１，２．丙二醇折算是９２％）；若控ＳＵｐＨ６．０ 则能大幅度提高Ｄ一乳酸的对映体过量值（ｅ．ｅ），其ｅ．ｅ值在 ９５％左右，如不控￥１ＪｐＨ值６．０，其ｅ．ｅ值在１０ｈ就会逐步下降， 随着转化反应的进行，ｅ．ｅ值会降低到７１％左右，这可能是 低ｐＨ值影响了相关脱氢酶的性质，对ｌ，２．丙二醇的不同对 映体的选择性发生了一定的变化。 ３结论 ３．１以ＧＯＸ菌体干重为指标，对基础发酵培养基中的山梨 醇浓度、酵母粉浓度进行了优化，发现最佳碳源为６％山梨 醇、最佳氮源为３％酵母粉。 ３．２以静息细胞作为酶源，对其转化ｌ，２．丙二醇生成Ｄ一乳 酸的工艺进行了探讨，发现最佳转化反应条件为将１０％静 息细胞悬浮于ｐＨ６．０的０．１ｍｏｌ／Ｌ磷酸盐缓冲液中，加入 ２０％底物（Ｒ，Ｓ）ｌ，２．丙二醇，２５０ｍＬ摇瓶装液３０ｍＬ，２８０Ｃ、 ２２０ｒ／ｒａｉｎ培养３０ｈ，维持ｐＨ６．０。
全自动菌落计数仪，生物洁净工作台，数控超声波清 洗器，恒温培养摇床，立式电热蒸气灭菌器，电热恒温鼓风 干燥箱，恒温培养摇床，紫外可见分光光度计，显微镜，离 心机等。 １．１．２菌种来源
红曲霉（Ｍｏｎａｓｃｕｓ ｐｕｒｐｕｒｅｕｓ）：四川理工学院生物工 程系微生物实验室保藏菌种。 １．２试验方法 １．２．１培养基ｌｏ＇ｌ
图１ 活化后红曲霉菌丝形态图 Ｆｉｇｕｒｅ １．Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ ｏｆ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｍｏａ￥ｃｕ￥ｈｙｐｈａｌ
·６８·
２０１０ Ｎｏ．３ Ｓｅｒｉａｌ Ｎｏ．２１６
Ｃｈｉｎａ Ｂｒｅｗｉｎｇ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｒｅｐｏｒｔ
试验是以菌丝体制备原生质体进行诱变育种，所以取 培养了２４ｈ～２７ｈ的菌丝进行酶解。酶解３ｈ后镜检观察到的 原生质体（图２）可看出，酶解后菌丝释放的原牛质体呈透 亮的球状，这是因为去壁后，细胞失去细胞壁的机械保护 作用，由膜包裹的原生质受到均匀的作用力。镜检看到的 原生质体比孢子大一些，但比细胞小。
用工作功率５００Ｗ超声波对原生质体进行不同时间 诱变，作用时间分别是１０ｒａｉｎ、１５ｍｉｎ、２０ｒａｉｎ、２５ｍｉｎ、３０ｒａｉｎ、 ３５ｍｉｎ、４０ｍｉｎ。经诱变后的原牛质体稀释５个梯度，取１０５ 的原牛质体悬液中０．１ｍＬ涂布到有原生质体再生培养基 的平板，涂布３个平板，３０℃培养３ｄ，待平板上长出菌落后， 计算再生率，最后换算成致死率。 １．２．６原生质复合诱变
同时还可看出，静息细胞浓度大小对Ｄ碍Ｌ酸的ｅ．ｅ影响不大， 其ｅ．ｅ在９５％左右，这说明静息细胞浓度大小不会影响酶对 底物吸，Ｓ）１，２．丙二醇的立体选择性，据此，静息细胞浓 度选择１０９／１００ｍＬ，即１０％细胞浓度（ｗ／ｖ）。 ２．２．２不同底物浓度对产物转化率及ｅ．ｅ的影响
底物浓度对反应有较大影响，以２．２．１的优化为基础考 察了不同浓度底物限，Ｓ）ｌ，２．丙二醇对反应的影响，结果 见图２Ｂ。
Ｇｕａｎｇｙａｎ，ＪＩＡＮＧ Ｐｅｉｎａ
（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｓｉｃｈｎａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆＳｃｉｅｎｃｅ＆Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，乃ｇｏｎｇ ６４３０００，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ＇．Ｍｏｎａｓｃｕｓ ｗａｓ ｕｓｅｄ ａｓ ｔｈｅ ｓｔａｒｔｉｎｇ ｓｔｒａｉｎ；ｔｈｅ ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ ｏｆ Ｍｏｎａｓｃｕｓ ｓｔｒａｉｎ ｗａｇ ｐｒｅｐａｒｅｄ ｂｙ ｅｎｚｙｍｅ ｄｉｇｅｓｔｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ．Ｔｈｅｎ ｔｈｅ ｈｉｇｈ—ｙｉｅｌｄ ｒｅｄ ｐｉｇｍｅｎｔ ｏｆＭｏｎａｇｃｕｓ ｓｌＦｎｉｎ ｗａｇ ｂｒｅｅｄｅｄ ａｎｄ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈ ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ ａｎｄ ＵＶ ｃｏｍｐｌｅｘ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｐｉｇｍｅｎｔ ｖａｌｕｅ ｏｆ ｓｏｌｉｄ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｎａｓｃｕｓ ｃ锄ｒｅａｃｈ ｍａｘｉｍｕｍ １２８．８ Ｕ／ｍｌ ｉｎ ｔｈｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｏｆ ＵＶ ２０ ｍｉｎｕｔｅｓ ａｎｄ Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ １００ ｓｅｃｏｎｄｓ ｃｏｍｐｌｅｘ ｍｕｔａｔｉｏｎ．Ｃｏｍｐａｒｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ｓｔａｒｔｉｎｇ ｓｔｒａｉｎ，ｔｈｅ ｖａｌｕｅ ｗａｓ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｒａｎｇｉｎｇ ｆｒｏｍ １２．６％ｔｏ ６９．０３％．Ｔｈｅ ｓｔａｂｌｅ ｇｅｎｏｔｙｐｅ Ｗａｇ ｖｅｒｉｆｉｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｒｅｅ
ｔｉｍｅｓ ｏｆｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎｇ ｏｆｃｕｌｔｕｒｅ．Ｔｈｅ ｍｕｔａｔｅｄ ｓｔｒａｉｎ ｐｌａｙｅｄ ｖｅｒｙ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｒｏｌｅ ｉｎ ｔｈｅ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ ｐｉｇｍｅｎｔ．ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｗｏｒｄｓ：Ｍｏｎａｓｃｕｓ；，ｐｒｏｔｏｐｌａｇｔ；ＵＶ ａｎｄ ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ ｃｏｍｐｌｅｘ ｍｕｔａｔｉｏｎ；ｍｏｎａｓＧｕｓ ｐｉｇｍｅｎｔ
试验中紫外灯的功率和垂直照射距离是固定的，紫 外辐射强度只随时间的长短变化，而超声波清洗器的功 率在试验中也是固定的，超声波作用强度只随时间的长 短变化，故只有２个因素影响复合诱变效果，将２个因素分 别选取不同水平排列组合进行复合诱变。在单因素诱变 得到的致死曲线中，在致死率为７０％～８０％的时间段内选 取不同作用时间进行复合诱变（一般认为在这个范围内致 死率低，突变率高，不容易回复印。 ２结果与讨论 ２．１原生质的制备
研究报告
中 国 酿造
２０１０年第３期 总第２１６期 ·６７·
但野生菌株产量低和诱变菌株遗传性状不稳定等因素限 制了红曲色素产生菌的种类和质量。选育红曲色素高产 菌株方法很多，如菌种诱变、固定化细胞技术、葡萄糖流加 培养、菌种联合培养，添加抗氧化剂和金属离子，添加植物 油、青霉素以及使用超声波处理技术等，尤其以菌种诱变 最为有效剐。笔者曾通过试验验证了２种诱变方法相结合 的方式对红曲霉产红曲色素能力提高最为明显［ｓＪ。本研究 将紫外线、超声波诱变方法结合起来，对红曲色素高产菌 株的诱变方法和诱变条件做进一步研究，以期为红曲霉产 红曲色素能力的提高提供参考。 １材料与方法 １．１材料 １．１．１主要仪器设备
表２紫外线诱变效果 Ｔａｂｌｅ ２．Ｒｅｓｕｆｆ ａｆｔｅｒ ＵＶ ｍｕｔａｔｉｏｎ
项目
Ｉ’
２。
３。４。
５。
扩
－ｐ
作用时间ｉｓ 菌落直径．／ｍｍ
０
２０
５．００ ６．００
４０
６０
２．００ ８．００
８０
１００ １２０
８．００ ７．００ ２．００
色素圈大ｄ，／ｍｍ
２．００ ４．００ ０．５０ ５．００ ６．００ ４．００ Ｏ．５０
红曲色素作为一种天然的食用色素，Байду номын сангаас泛应用于酒、 糖果、熟肉制品、腐乳、雪糕、冰琪淋、火腿等的着色，还可
用于医药和化妆品的着色。目前，红曲色素主要在东、南 亚国家进行生产和应用，其中中国和日本的生产量最大【１１。
收稿日期：２００９．０８．３１ 作者简介：赵兴秀（１９７７－），女，陕两汉中人，讲师，主要从事微牛物生物化学方面的研究工作。
万方数据
４０００ｒ／ｍｉｎ离，１二，５ｍｉｎ，得到的沉淀用０．６ｍｏＦＬ ＮａＣＩ洗涤２ 次，离心后得到的沉淀用０．６ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣＩ悬浮，制成原生质 体悬液１７］。 １．２．４原生质的紫外诱变
取５ｍＬ原牛质体悬液置于无菌平皿中，距离３０Ｗ紫外 灯３０ｃｍ处，在磁力搅拌机轻轻搅拌的同时进行紫外辐射， 计时分别是２０ｓ、４０ｓ、６０ｓ、８０ｓ、１００ｓ、１２０ｓ、１４０ｓ。稀释５个梯 度，取稀释倍数为ｌＯ｛的原牛质体悬液中０．１ｍＬ涂布到有原 生质体再生培养基的平板，３０℃避光培养３ｄ，以出发菌株 原牛质作窄白对照。待平板上长出菌落后，计算再生率，最 后换算成致死率。 １．２．５原生质超声波诱变
由图２Ｂ可知，当１，２．丙二醇浓度低于２５％时，反应转 化率在４６％左右（按Ｒ－Ｉ，２．丙二醇折算是９２％），产物ｅ．ｅ 值达９５％，随着底物浓度的增加，二者都有明显的下降， 在底物浓度为３５％时，转化率仅有３００，６，ｅ．ｅ值也只有７９％， 说明过高浓度的底物会对反应产生抑制作用，同时底物浓 度高也会导致与反应有关的脱氢酶立体选择性降低，因 此，高浓度的底物不适合转化反应，因此，研究选择２０％ 底物浓度。 ２．２．３ ｐＨ控制策略对产物转化率及ｅ．ｅ的影响