Bt(苏云金杆菌)乳剂生产工艺规程
Bt(苏云金杆菌)乳剂生产工艺规程
Bt（苏云金杆菌）乳剂生产工艺规程衡阳市微生物厂一九九二年三月Bt 乳剂工业生产技术一、概述Bt 即苏云金杆菌（Bacillus thuringiensis ）的简称，是一种寄生于昆虫体内引起昆虫发病死亡的能产生伴孢晶体的芽孢杆菌，其制剂广泛应用于农、要、果、蔬、城市园林方面的害虫防治。
二、生产工艺流程砂土管菌种 斜面菌种 扁瓶菌种扩大培养 发酵罐 过滤 浓缩加助剂 检验 包装三、生产工艺操作规程 （一）砂土管菌种的制备 1、砂的处理：取建筑用砂或河砂经60－80目过筛后用工业Hc 浸泡48h 后用清水洗净，再用0.2NNao 中和，烘干后用磁铁除去其中带磁性之金属微粒，装入洁净容器内备用。
2、砂土管制备：将以上已处理好之砂土分装于1.2×12公分之小试管中，每管约装2克，塞上棉塞，先用2.0kg/cm 2高压灭菌1.5小时，间歇灭菌三次，再以160℃干热灭菌2小时，经无菌试验，即抽取一点砂土置于斜面试管中 36℃培养24小时才检查无杂菌后备用。
27－29℃48－72h 27－29℃ 18－24h 27－29℃36－48h3、砂土孢子的制作：选择生长良好，经过生产能力考查合格的优良试管斜菌种一支加入无菌水5ml，用接种针刮下孢子制成高浓度的孢子悬液用无菌吸管吸取0.2－0.3ml接入砂土管中，而后置入真空干燥器内，用真空泵间歇抽干，用石蜡封口，以后置于0－5℃冰箱中，在干燥情况下保存。
（二）斜面菌种的制备1、培养基：牛肉膏0.3%、蛋白胨1%、琼脂2%，调节7.5－8.0溶化后分装试管，加塞放入试管篓内包好灭菌。
2、灭菌：在消毒锅内 1.1kg/cm2下蒸气灭菌30分钟，等冷却到60－70℃时取出摆成斜面，空白培养2天观察无杂菌方可使用。
３、接种培养：将菌种试管斜面放在接种室内或无菌操作箱中，打开紫外线灯灭菌30分钟后关闭。
用接种环按操作规程刮取种子菌苔少许，转至新鲜斜面培养基上划线接种，然后放入30℃培养箱内3－4天，经检查正常，放入冰箱内备用。
苏云金芽孢杆菌生物农药的制备、伴胞晶体的分离纯化及杀虫活性
JIUJIANG UNIVERSITY实验论文题目苏云金芽孢杆菌生物农药(Bt制剂)的制备、伴孢晶体的分离纯化及杀虫活性院系生命科学学院专业生物技术姓名樊晓乐、严学芬、王伟、周明宣、邹红虹班级B0933指导教师张炳火二零一一年十一月摘要：苏云金芽孢杆菌是目前世界上研究最多、产量最大、应用范围最广的微生物杀虫剂，具有专一性强、对人畜无害、防治效果好、易生物降解及无残毒等优点。
本试验采用固体培养，对一株苏云金芽孢杆菌进行了发酵，制备了Bt制剂，对伴孢晶体进行了分离纯化，采用菜地试验，检测了Bt制剂和伴孢晶体对白菜虫害的防治效果。
关键词：苏云金芽孢杆菌（Bt）；伴孢晶体；杀虫活性前言苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis,简称Bt）是一种革兰氏阳性细菌，其菌体为短杆状，生鞭毛，单生或形成短链。
它在芽孢形成过程中产生称为δ-内毒素的杀虫伴胞晶体蛋白(控制合成这种蛋白质的基因在质粒上），这些蛋白具有很高的杀虫活性。
Bt由于具有专一性强、对人畜无害、防治效果好、生物降解无残毒、所用原料简单等优点，在虫害防治中发挥着越来越重要的作用，随着对Bt研究的深入，Bt的基因改造、毒理学研究、杀虫机理、对人类的安全性等方面的研究都对高纯度的Bt伴胞晶体提出了极大的需求。
因此，Bt伴胞晶体的分离纯化方法逐步得到了发展，如等密度梯度离心法、液体双相分离法、等电点沉淀法、离子交换分离法、碱裂解法、高速离心法和生物物理法等。
本实验采用2种液体培养基、2种培养条件对苏云金芽孢杆菌进行培养。
镜检观察当90％以上的芽孢脱落时处理菌体，经碱液裂解后比较等电点沉淀和液体双相分层法提取Bt蛋白的收率和纯度。
1 材料与方法1.1 菌种苏云金芽孢杆菌为九江学院生命科学学院微生物实验室保藏。
1.2 培养基种子培养基：牛肉膏0.5%,蛋白胨1.0%,NaCl 1.0%,调pH 7.2 左右,121℃灭菌30 min。
发酵培养基：牛肉膏0.5%,蛋白质 1.0%,葡萄糖0.3%,NaCl 0.2%, MgSO4·7H2O 0.03%, K2HPO4 0.03%, MnSO4 0.005%,调pH 7.5,121℃灭菌30min,灭菌后pH 7.3。
苏云金杆菌粉剂发酵工艺
苏云金杆菌粉剂发酵工艺一、引言随着人们对健康的重视和对安全、绿色食品的需求不断增加，生物农药逐渐成为农业生产的主流。
其中，苏云金杆菌粉剂作为一种重要的生物农药，具有广谱、高效、低毒等优点，在防治农作物病虫害方面起到了重要的作用。
本文将对苏云金杆菌粉剂的发酵工艺进行深入探讨。
二、苏云金杆菌粉剂的发酵工艺2.1 苏云金杆菌苏云金杆菌（Pseudomonas putida）是一种革兰氏阴性菌，广泛存在于土壤和水体中。
这种细菌能够分解多种有机物，对农作物病害有很好的防治效果。
2.2 发酵工艺的重要性苏云金杆菌粉剂的发酵工艺是生产高质量、高效生物农药的关键环节。
通过优化发酵工艺，可以提高苏云金杆菌粉剂的发酵产量和质量，并降低生产成本。
2.3 发酵工艺的基本步骤苏云金杆菌粉剂的发酵工艺主要包括以下几个步骤：2.3.1 菌种培养苏云金杆菌的菌种是发酵生产的基础，菌种的良好培养能够保证发酵过程的顺利进行。
一般来说，使用已经培养纯化的苏云金杆菌菌种，通过在适宜的培养基上进行预培养，培养至菌液浓度适宜后即可进行发酵。
2.3.2 发酵过程控制发酵过程中，控制温度、pH值、搅拌速度、通气量等参数对于苏云金杆菌生长和代谢产物的合成具有重要影响。
合理控制这些参数可以提高苏云金杆菌的生长速度和产量。
2.3.2.1 温度控制一般情况下，苏云金杆菌的适宜生长温度在25-30摄氏度之间。
通过控制发酵罐的冷却或加热系统，保持发酵液温度的稳定，有利于细菌的生长和代谢产物的积累。
2.3.2.2 pH值控制苏云金杆菌的生长对pH值有一定的要求，一般在6.0-7.0之间。
通过添加酸碱调节剂，调节发酵液的pH值，可以提供一个适宜的环境条件供苏云金杆菌生长。
2.3.2.3 搅拌速度控制搅拌速度对发酵产物的合成也有一定的影响。
适当的搅拌速度可以保持发酵液的均匀混合，有利于苏云金杆菌的生长和代谢产物的积累。
2.3.2.4 通气量控制苏云金杆菌属于好氧菌，因此通气量的控制对其生长发酵过程至关重要。
乳剂生产工艺
乳剂生产工艺
乳剂生产工艺是指将固态乳化剂与液态成分按一定比例混合，经过搅拌、乳化、调整pH值等步骤制成稳定的乳状液体产品
的过程。
下面是乳剂生产的一般工艺流程。
1. 原材料准备：根据产品配方，准备好各种原材料，包括乳化剂、溶剂、防腐剂、活性成分等。
2. 材料称量：按照配方要求，使用精密称量设备将各种原材料精确称量。
3. 搅拌：将称量好的原材料倒入搅拌罐中，启动搅拌机，将各种原材料充分混合。
4. 加热：根据配方要求，将搅拌罐中的混合物进行加热，使其达到所需温度。
5. 乳化：将搅拌罐中的混合物通过高剪切乳化机进行乳化处理。
乳化机能够剪切液体成分，形成小于1微米的乳状颗粒，提高产品稳定性。
6. 调整pH值：根据产品要求，用酸碱调节剂调整乳状液体的pH值，使其符合要求。
7. 冷却：将乳化后的液体经冷却设备进行冷却处理，使其降至室温。
8. 检测：对冷却后的乳状液体进行质量检测，包括外观、粘度、稳定性等指标的检测。
9. 包装：待质检合格后，将乳状液体通过灌装机进行灌装，将其包装成各种规格的容器。
10. 产品成品：经过包装后的乳状液体即为成品，需要进行标
签贴附和产品入库。
乳剂生产工艺主要包括原料准备、材料称量、搅拌、加热、乳化、调整pH值、冷却、检测、包装和成品等步骤。
整个生产
过程需要控制各个环节的参数，确保产品的质量和稳定度。
同时，操作人员必须遵守相关的操作规程和安全措施，确保生产过程的安全性和卫生质量。
苏云金杆菌BT油悬浮剂OD的研制
苏云金杆菌BT油悬浮剂OD的研制标签：油悬浮剂OD 增稠剂配方溶剂乳化剂分类：剂型研究2009-12-10 19:53苏云金杆菌(Baeillus thuringiensis，简称Bt)制剂是目前国内外研究最多、产量最大、应用最广的一类微生物杀虫剂，对马尾松毛虫、美国白蛾、杨扇舟蛾、舞毒蛾、尺蠖、菜青虫、玉米螟等林农害虫具有良好的防治效果。
目前Bt剂型主要是水悬浮剂和可湿性粉剂，在使用过程中需用水稀释，抗蒸发能力较差，雾滴直径小，易漂移，低空飞行作业效率低，影响使用效果，不适宜飞机防治。
我们研制的Bt油悬浮剂具有渗透性和黏附性强、抗蒸发、耐贮藏和增效等优点，特别适合飞机超低容量喷雾防治森林害虫。
1材料与方法1．1材料Bt原粉，本单位自备。
溶剂有棉子油、蓖麻油、桐油、液体石蜡、豆油、A1、A2、邻苯二甲酸二甲酯、邻苯二甲酸二丁酯等25种；增稠剂有膨润土、硬脂酸铝、QH凝胶、龙胶粉、F1、黄原胶等11种：分散剂有拉开粉、NNO、LFS、B1、碳黑等15种。
1．2方法1．2．1溶剂的筛选制备Bt油悬浮剂用的固体原药在亲脂溶剂中的溶解性能欠佳，为提高分散度，要求分散介质黏度较大。
同时要求溶剂闪点高(开口闪点大于70℃)，毒性和挥发性低，以适应飞机超低容量喷雾。
在搜集溶剂时首先选择开口闪点大于70℃、挥发性低的棉子油、蓖麻油等25种溶剂。
1)兼容性试验：将定量的Bt原粉与溶剂混合，在54℃±2℃的温度下贮存14d，通过生测．筛选出与 Bt兼容性良好的溶剂。
2)单元溶剂的筛选：将溶剂与Bt原粉按一定的比例配制成17 600 IU·μL-1Bt油悬浮剂，通过对其悬浮率、流动性等物理性状的测定筛选出较好的单元溶剂。
悬浮率通常采用悬浮的液层高度占总液面高度(悬浮液高度+清液层高度)的百分率来表示。
3)二元溶剂的筛选：为了获得更好的物理性状，故进行二元溶剂的筛选。
将筛选出的单元溶剂按一定比例配成二元溶剂，以供进一步选择之用。
微生物农药——BT农药
杀虫机理
苏云金杆菌可寄生130多种鳞翅目幼虫。 苏云金杆菌可寄生 130多种鳞翅目幼虫。 130多种鳞翅目幼虫 此外，膜翅目、 双翅目、 此外，膜翅目、双翅目、直翅目和鞘翅 目中的一 些昆虫也可被此菌感染。 目中的一些昆虫也可被此菌感染。 控制 毛虫、小蔡蛾、棉铃虫等。 毛虫、小蔡蛾、棉铃虫等。 苏云金杆菌杀虫的作用在于它所产生的 某些毒素。这些毒素 主要是δ 某些毒素。这些毒素主要是δ内毒素和 外毒素。
在昆虫病原细菌中， 在昆虫病原细菌中，以 苏云金杆菌在害虫 防治中的应用最为广泛， 效果也最好。 其杀虫 范围有一定的广谱性， 并且具有不亚于某些化 学杀虫剂的速效性。 学杀虫剂的速效性。在这一点上苏云金杆菌 优 于真菌和病毒制剂。
苏云金杆菌的生态习性
(1)营养条件 苏云金杆菌是弱寄生菌，容易培养，能利用的碳、 苏云金杆菌是弱寄生
BT的制备
用玉米粉,豆饼粉,NaH2PO4和NaCl来调整原料粉 中C,N,P,Cl含量,使其分别处于3-20%,1-10%, 0.512%,0.1-1.0%的范围内,加入5%-30%的谷壳, 10%30%的水,搅拌均匀得到固态发酵培养基,灭 菌后介 入苏金云芽孢杆菌菌种,发酵,干燥,粉碎 得到苏金云 芽孢杆菌农药原粉
微生物农药——BT农药
什么是微生物农药
包括农用抗生素和活体微生 物农药.为利用微 生物或其代谢产 物来防治危害农作物的病,虫, 草, 鼠害及促进作物生长.它包括以菌 治虫,以 菌治菌,以菌除草等.这 些微生物农药包括细 菌,真菌,病 毒或其代谢物.
微生物农药的分类
包括细菌,真菌,病毒,原生动物,线虫等,主要是前三者 微生物杀虫剂：细菌杀虫剂 真菌杀虫剂 虫剂
bt农药的介绍btbacilussthuringiensis苏云金芽孢杆菌用途最广开发时间最长产量最大应用最成功占生物防治剂总量的95以上已有60多个国家登记了120多个品种美国用以防治蔬菜害虫和玉米害虫的面积分别占总面积的80和50销售额从80年代末的4000万美元上升到90年代的5亿多美元内第一家bt杀虫剂生产企业我国目前已登记的bt杀虫剂粉剂有16种液剂12种生产厂家达76家年产量达20108kg30108kg由中国构建的高效杀虫重组苏云金杆菌已于2000年底通过了安全评价并获准进行商品化生产bt的杀虫机理bt毒蛋白在虫子体内被分解成有毒的多肽这些多肽与虫肠上皮细胞一些特异受体蛋白结合破坏细胞膜最后导致害虫死亡
1000吨年苏云金芽孢杆菌厂生产工艺初步设计
年产1000吨苏云金芽孢杆菌的发酵车间工艺设计包文雨（辽宁石油化工大学，石油化工学院，生物工程1102，辽宁营口，1132050215）摘要苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)于1901年在日本被发现，1911 年由柏林纳从地中海粉螟的患病幼虫中分离出来，并依其发现地点德国苏云金省而命名. 苏云金芽孢杆菌简称苏云金杆菌，是内生芽孢的革兰氏阳性土壤细菌，在芽孢形成初期会形成杀虫晶体蛋白对敏感昆虫有特异性的防治作用。
本设计首先初步介绍了苏云金芽孢杆菌的发展过程，然后就其产品化进行了讨论，苏云金芽孢杆菌的发酵共有两种工艺路线，即液体深层发酵和固态发酵。
它们都有其优缺点，但是经过对比论证，最终选择了液体深层发酵。
随后根据相关资料确定了苏云金芽孢杆菌的生产周期及期产量，依照期产量对其进行了物料衡算和热量衡算，最后对设备进行了合理的选型。
关键词：苏云金芽孢杆菌；产品化；工艺路线；设备选型1000 tons of Bacillus thuringiensis fermentation processdesign workshopBao Wenyu(Class 1102, Department of Biological Engineering, School of Environmental and Biological Engineering, Liaoning Shihua University, Liaoning Yingkou, 1132050215, China)AbstractBacillus thuringiensis (Bacillus thuringiensis) in 1901, was discovered in Japan in 1911 by the Berliner from the Mediterranean flour moth larvae in the prevalence of isolated and found locations in Germany according to their province and named Bacillus thuringiensis. thuringiensis Called Bacillus thuringiensis, is endogenous Gram-positive Bacillus soil bacteria, initially formed in the spore formation of insecticidal crystal protein (insecticidal crystal protein), insects have specific sensitive rats.The preliminary design of the first Bacillus thuringiensis introduced the development process, and then conducted a discussion of its products, the fermentation of Bacillus thuringiensis There are two process routes, that is, submerged fermentation and solid-state fermentation. They all have their advantages and disadvantages, but after comparison argument, I finally chose the submerged fermentation. Then determined according to the relevant information of Bacillus thuringiensis and production cycle of production, production was carried out in accordance of the material balance and heat balance, the last of the equipment for a reasonable selectionKey words:Bacillus thuringiensis; product of; process routes; equipment selection目录摘要 (1)ABSTRACT ............................................................................................................................ I I 第1章绪论 (1)1.1项目背景 (1)1.2苏云金芽孢杆菌介绍 (1)1.2.1苏云金芽孢杆菌定义 (1)1.2.2苏云金芽孢杆菌资源 (2)1.2.3苏云金芽孢杆菌鉴定与分类 (3)1.2.4孙云锦芽孢杆菌生态学及安全性 (3)1.2.5苏云金芽孢杆菌产品化 (4)1.3设计方案 (5)1.3.1产品方案 (5)1.3.2选址 (6)1.3.3车间生产过程设计 (6)第2章工艺流程确定与论证 (8)2.1工艺流程确定 (8)2.1.1苏云金芽孢杆菌液体深层发酵 (8)2.2.2苏云金芽孢杆菌固态发酵 (9)2.2.3小结 (11)第3章物料衡算 (12)3.1生产条件 (12)3.2各设备的物料衡算 (12)3.2.1发酵罐物料衡算 (12)3.2.2接种罐物料衡算 (13)3.2.3过滤后的物料横算 (13)3.2.4干燥后的物料衡算 (14)第4章能量衡算 (15)4.3 热量衡算基础数据的计算和查取 (16)4.3.1比热容的计算 (14)4.3.2 状态热的计算 (17)4.3.3 化学反应热的计算 (18)4.4热量衡算 (18)4.4.1反应过程的热量衡算 (18)4.4.2过滤和离心过程的热量衡算 (21)4.4.3产品干燥岗位的热量衡算 (23)第5章设备确定及选型 (23)5.1 发酵罐的设计 (23)5.1.1 发酵罐的尺寸设计 (26)5.1.2 发酵罐搅拌器轴功率计算 (24)5.2 种子罐的计算 (27)5.2.1种子罐的尺寸计算 (27)5.2.2 种子罐轴功率计算 (28)5.3 发酵液的贮罐计算 (28)5.4过滤器的选择 (29)5.5离心机的选择 (30)5.6干燥机的选择 (31)5.7其他设备的选择 (31)第6章结论 (32)参考文献 (33)附录 (35)附录一生产原料 (35)附录二设备一览表 (34)致谢 (36)第1章绪论1.1项目背景我国研究和应用苏云金杆菌起于1959年，于1965年在长沙和武汉进行了工业化生产，也就是工业生产初级阶段，到70年代工业产品每年1000t左右，1974年湖北宜昌地区，飞机防治松毛虫的面积达82.5万亩，取得了满意的效果。
苏云金芽孢杆菌生产工艺流程
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Bt（苏云金杆菌）乳剂生产工艺规程
衡阳市微生物厂
一九九二年三月
Bt 乳剂工业生产技术
一、概述
Bt 即苏云金杆菌（Bacillus thuringiensis ）的简称，是一种寄生于昆虫体内引起昆虫发病死亡的能产生伴孢晶体的芽孢杆菌，其制剂广泛应用于农、要、果、蔬、城市园林方面的害虫防治。
二、生产工艺流程
砂土管菌种 斜面菌种 扁
瓶
菌种扩大培养 发酵罐 过滤 浓缩
加助剂 检验 包装
三、生产工艺操作规程 （一）砂土管菌种的制备 1、砂的处理：
取建筑用砂或河砂经60－80目过筛后用工业Hc 浸泡48h 后用清水洗净，再用0.2NNao 中和，烘干后用磁铁除去其中带磁性之金属微粒，装入洁净容器内备用。
2、砂土管制备：
将以上已处理好之砂土分装于1.2×12公分之小试管中，每管约装2克，塞上棉塞，先用2.0kg/cm 2高压灭菌1.5小时，间歇灭菌三次，再以160℃干热灭菌2小时，经无菌试验，即抽取一点砂土置于斜面试管中 36℃培养24小时才检查无杂菌后备用。
27－29℃
48－72h 27－29℃ 18－24h 27－29℃
36－48h
3、砂土孢子的制作：
选择生长良好，经过生产能力考查合格的优良试管斜菌种一支加入无菌水5ml，用接种针刮下孢子制成高浓度的孢子悬液用无菌吸管吸取0.2－0.3ml接入砂土管中，而后置入真空干燥器内，用真空泵间歇抽干，用石蜡封口，以后置于0－5℃冰箱中，在干燥情况下保存。
（二）斜面菌种的制备
1、培养基：牛肉膏0.3%、蛋白胨1%、琼脂2%，调节7.5－8.0溶化后分装试管，加塞放入试管篓内包好灭菌。
2、灭菌：在消毒锅内 1.1kg/cm2下蒸气灭菌30分钟，等冷却到60－70℃时取出摆成斜面，空白培养2天观察无杂菌方可使用。
３、接种培养：将菌种试管斜面放在接种室内或无菌操作箱中，打开紫外线灯灭菌30分钟后关闭。
用接种环按操作规程刮取种子菌苔少许，转至新鲜斜面培养基上划线接种，然后放入30℃培养箱内3－4天，经检查正常，放入冰箱内备用。
（三）扁瓶扩大种子制备
1、培养基：同斜面培养组成，另加葡萄糖1%，溶化后装入扁瓶。
2、灭菌、接种、培养均与斜面菌种同。
（四）发酵
1、培养基棉籽饼粉 3.5%
玉米粉 2.0%
鱼粉 1.0%
酵母粉0.2%
CaCO30.1%
泡敌0.03%
用NoaH调PH8.5 消毒后为7.0左右
2、灭菌：发酵罐在投料之前清洗干净，按投料系数50%投料，分过滤器以2kg/cm2灭菌30分钟，实罐灭菌1.1kg/cm2，罐温121－125℃，保持30分钟（按灭菌操作步骤进行）。
3、孢子悬浮液准备：取培养好的扁瓶种子3－4个分别加入无菌水，将菌苔洗成悬液，再倒入接种瓶内，配上注射针头。
将此孢子悬液进行水浴75℃20分钟处理。
4、接种：通过发酵罐接种孔利用压差将孢子悬液注入发酵罐中。
5、培养：罐压保持0.3－0.5kg/cm2，搅拌220转/分钟，通气量在接种后4小时前小些，逐步增至1：1，温度30℃±1℃。
在上述条件下菌体生长发育经历期为：
0－4小时，调整生长期；
5－12小时，生长繁殖期；
13－20小时，芽孢晶体形成期；
21－放罐，芽孢晶体成熟期。
6、检测：培养过程4、8、12、16、20……各取样检测生长情况、PH 值，最后一次取样进行菌数测定。
（五）发酵液的后处理
1、将发酵好的发酵液用工业盐酸调至PH5.0－6.5。
2、用薄膜浓缩器（或离心机）进行真空浓缩。
3、检测：根据发酵液的含菌数及浓缩倍数估算含菌数100亿/毫升取样检测，化验符合产品质量标准时即可终止浓缩，压入贮罐。
4、添加剂：按规定添加NaCl1%，苯甲酸钠0.3%搅拌均匀。
5、成品检验：
（1）成品经质检部门检验各项指标达产品质量标准后，下达包装通知。
（2）包装：采用1立升塑料瓶包装，瓶有内外盖，不泄漏，包包装应符合产品库存、搬运和运输过程的技术和安全需要，箱内应有产品合格证和使用说明书。
四、Bt乳剂主要生产设备一览表：
附件一：Bt乳剂质量检验方法：
A、Bt乳剂芽孢数的测定：
A1原理
利用血球计数板在光学显微镜下，数出芽孢数，再用公式算出每1
毫升产品中含芽孢数。
A2仪器
血球计数板、光学显微镜等。
A3操作
A3·1晶体处理
将待测样品摇匀后迅速吸取10毫升于等量的0.5N的NaoH溶液中，间歇摇动，处理1－2小时，使晶体全部自溶，直至显微镜检查无晶体为止。
A3·2稀释
在500毫升三角瓶（内装玻璃珠）中，装入99.5毫升无菌水，将经NaoH处理过的样品摇匀后迅速用吸管吸取0.5毫升于三角瓶中（即共稀释400倍）。
A3·3制片
用无菌吸管从充分摇匀的400倍稀释液中吸取少许，从盖玻片的一端注入血球计数板，使菌液沿玻片间渗入，并用滤纸吸干槽中流出多余菌液，操作过程中血球计数板不得产生气泡，否则应重做。
静置15分钟后再计数。
A3·4观察读出芽孢数
制好片后用低倍镜观察，用25×16的计数板，数四个角上的四个中方格和中间的一个中方格的芽孢数，然后再换算成1毫升菌液中的总芽孢数。
A4计算
每1毫升产品中含芽孢数其计算方式如下：
A＝B×C×5×104
式中，A为样品1毫升菌液的芽孢数（亿个/毫升）。
B为五个中方格含芽孢总数。
C为稀释倍数。
5×104为常数即血球计数板每中格体积的含菌数换算成1毫升含菌数。
注：如果用16×25血球计数板计数，则用下面公式进行计算：A＝B×C×3.2×104
B、Bt乳剂和毒效测定：
B1供试虫采集
人工饲养或野外采集（最好在特定区域范围内，同一株植物上收集），龄期一致（一龄或二龄），生长发育良好的健康昆虫（常用菜青虫，但要避免在喷药不久的作物上采取），在室内观察1－2天后备用。
B2一切用具洗净，用1kg/cm2蒸汽灭菌30分钟，备用。
B3操作
B3·1将样品稀释500、1000、1500、2000倍，每个浓度设3个重复。
B3·2用12cm培养皿或罐头瓶作容器，其中放2－3片白菜叶，将菌液涂在菜片上（正、反两面），晾干后放入20－25头二龄菜青虫，同时作一组对照组。
B3·3在27－28℃光照下，饲养试验幼虫。
B4结果记录
试验后24、48、72小时分别观察和记录死活虫数以及虫体化蛹数，并将观察结果列入下表。
Bt乳剂致病率测定记录表
B5计算
根据上表所列数据计算72小时菜青青菜虫死亡率，其计算方法按下
面公式进行：
死亡虫数
死亡率（%）＝×100
供试昆虫
注1：在计算和统计过程中，化蛹虫数不参与死亡率计算。
注2：若对照组死亡率>5%，应校正其死亡率，其校正方法如下：
对照组活虫数－处理组活虫数
校正死亡率（%）＝×100
对照组活虫数
注3：若无菜青虫，可用二龄家蚕代之，检验方法不变。
C、PH值测定：
采用精密PH试纸测定。
附件二：
Bt制剂使用说明书
【简介】本品为高效微生物杀虫剂。
具有对人畜无害，不伤天敌、无污染、价廉等特点。
可广泛使用于农、林、果、蔬、城市园林方面的害虫防治，在建立无公害蔬菜、烟草、茶叶经济作物区上，尤其具有极为良好的推广价值。
实践证明，我厂生产的Bt乳剂，不仅杀虫效果显著，药效期长，而且带来了广泛的社会效益和生产效益。
完全可以取代钾胺磷等部分剧毒农药。
【性状】液剂型（粘稠乳状液体）
【规格】每毫升含孢子数100亿以上，孢子比1：1。
【用途用量】亩用量一般2公两。
兑水低量喷雾。
具体参照下表：。