猪圆环病毒2型Cap蛋白表达及免疫原性鉴定

·研究论文·Chinese Journal of Animal Infectious Diseases中国动物传染病学报2014,22(5): 28-34猪圆环病毒2 型Cap 蛋白表达及免疫原性鉴定朱 鹏1,2，张小飞2，徐延伟2，尹秀凤2（1.安徽农业大学动物科技学院，合肥230036；2.南京天邦生物科技有限公司 生物技术研究所，南京211102）摘 要：以猪圆环病毒2型 (Porcine circovirus type 2，PCV2) WH 株基因组 DNA 为模板，扩增 ORF2 截短基因，经Bam H I /Not I 双酶切处理后与经相同酶切处理的 pET32a (+) 原核表达载体连接，获得重组质粒 pET32a-Cap2。

将重组质粒转化至 BL21（DE3），经IPTG 诱导，对表达产物进行 SDS-PAGE 和 Western blot 分析。

纯化的重组蛋白免疫小鼠，并对获得的血清进行间接 ELISA 检测和中和活性测定。

SDS-PAGE 分析表明，ORF2 截短基因在大肠杆菌中得到表达，蛋白分子质量大小为40 kDa ，重组 PCV2 Cap 蛋白主要以上清的形式存在。

Western blot 证实重组蛋白能够识别抗 PCV2 阳性血清。

经间接ELISA 检测，鼠抗PCV2 Cap 血清抗体效价能达到1:25 600，间接免疫荧光检测分析表明，鼠抗PCV2 Cap 血清能特异性识别PCV2感染细胞中的Cap 蛋白。

病毒血清中和实验证实，抗PCV2 Cap 血清抗体具有中和病毒的活性，中和效价为1:36。

猪圆环病毒2型 Cap 蛋白的表达，为进一步研究该蛋白的功能及Cap 蛋白亚单位疫苗和检测试剂盒的制备奠定了基础。

关键词：猪圆环病毒2型 ；Cap 蛋白；免疫原性；中和活性中图分类号：S852.659.2文献标志码：A文章编号：1674-6422（2014）05-0028-07EXPRESSION AND IMMUNOGENICITY OF RECOMBINANT CAP PROTEINOF PORCINE CIRCOVIRUS TYPE 2ZHU Peng 1,2, ZHANG Xiao-fei 2, XU Yan-wei 2, YIN Xiu-feng 2(1. College of Veterinary Medicine, Anhui Agricultural University, Hefei 230036, China; 2. Biotechnology Research Institute, Nanjing Tech-bank Bio-industry Co. Ltd., Nanjing 211102, China)Abstract: The truncated ORF2 of Porcine circovirus type 2(PCV2) WH strain was ampli fi ed and cloned into expression vector pET32a (+). The expression vector pET32a-Cap2 was then transformed into BL2 (DE3) for expression with induction of IPTG. The expressed pET32a-Cap products were analyzed in SDS-PAGE and Western blot. The recombinant Cap protein was a soluble protein with molecular weight of 40 kDa. The puri fi ed Cap protein was used to immunize mice to prepare antiserum. The resulting murine antiserum had ELISA titer at over 1:25 600 and reacted with PCV2 in infected PK-15 cells in indirect immuno fl uorescence assay (IFA). The murine antiserum also showed neutralizing titer at 1:36. The availability of the recombinant PCV2 Cap protein provides the basis for development of vaccine and diagnostic reagents.Key words: Porcine circovirus type 2; Cap protein; immunogenicity; neutralization收稿日期：2014-03-07作者简介：朱鹏，男，硕士，主要从事动物疾病研究通信作者：张小飞，E-mail：xiaofei0804@猪圆环病毒（Porcine circovirus，PCV）为圆环病毒科圆环病毒属成员，由 Tischer 于1974年首先在 PK-15细胞中发现，并于1982年命名为猪圆环病毒。

PCV 有2种血清型，即 PCV1和 PCV2[1]。

PCV1 无或对猪的致病性低，广泛存在猪体内和猪肾传代细胞系中；PCV2 有致病性，是引发猪断奶后多系· 29 ·第22卷第5期朱鹏等：猪圆环病毒2 型Cap 蛋白表达及免疫原性鉴定剂盒为天根生化科技（北京）有限公司产品；FITC 标记的葡萄球菌A蛋白购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.2 引物的设计与合成 应用 Primer premier5.0 软H I 、Not I 酶切位点。

引GC-3'，下游引物5'-AGAGCGGCCGCTTAGGGGT TAAGTGGGGGGTCTTT-3'，下划线部分为酶切位点。

1.3 ORF2 基因的扩增 取-70℃ 保存的 PCV2 WH 株，接种于已长满单层的 PK-15 细胞培养48~72 h，收获全部培养物，用DNA提取试剂盒提取总DNA。

建立25 μL 扩增体系: r Taq 0.3 μL、上下游引物各 1 μL、dNTP 1 μL、模板 DNA 2 μL、10×buffer（Mg 2+）2.5 μL 、ddH 2O 17.2 μL。

按如下程序扩增：94℃预变性4 min；94℃变性40 s，55℃退火40 s，72℃延伸40 s，共30个循环；最后72℃延伸10 min。

PCR产物电泳检测后，剩余PCR产物用胶回收试剂盒回收。

1.4 重组表达质粒 pET32a-Cap2 的构建及鉴定 分别用Bam H I、Not I 双酶切上述胶回收产物和载体 pET32a (+) ，酶切产物经胶回收后，用T4 DNA连接酶于16℃连接过夜，将连接产物转化DH5α 感受态细胞。

挑取单个菌落培养，提取质粒，分别做PCR 及酶切鉴定，选取阳性质粒，送至上海生工生物工程技术有限公司进一步测序确证，将阳性重组表达质粒命名为pET32a-Cap2。

1.5 重组蛋白的诱导表达及 SDS-PAGE 凝胶电泳分析 分别将空载体 pET32a(+) 和重组阳性质粒转化至 BL21（DE3）感受态细胞中，涂板37℃过夜。

挑取单菌落接种于 LB 液体培养基中（氨苄霉素终浓度100 μg/mL），37℃过夜后，按1:100 的比例接种于氨苄抗性的 LB 液体培养基中，37℃ 振荡培养2~4 h，至OD 600值为0.4~0.6 时加入终浓度为1mmol/L的 IPTG 进行诱导，37℃继续培养。

在诱导 1、2、3、4、5、6 h时收集1 mL菌液，4℃、13 000×g统衰弱综合征（postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS）的主要病原[2]，主要侵害机体的免疫系统，造成机体的免疫抑制[3]。

PCV2 与其他细菌病和病毒病混合感染后，大大加剧猪的死亡，业发展的重要病原之一苗和药物来防止 PMWS PCV2 含有2个主要的开放阅读框( open reading frame, ORF)，其中 ORF2 基因编码病毒的衣壳蛋白(Cap)是主要结构蛋白，包含主要的抗原中和表位，具有良好的免疫原性，且 PCV1 和 PCV2 之间不发生血清学交叉反应，是检测病毒抗体水平的良好抗原[6]，也是发展新型疫苗的良好靶基因[7]。

利用杆状病毒表达系统在体外表达的重组 Cap 蛋白（30 kDa）能够自我组装为病毒核衣壳样粒子，并表现出了良好的免疫原性[8]，但因蛋白的表达量较低，限制了进一步的应用。

赵玲等[9]构建了pET32a-ORF2 原核表达质粒，但表达的蛋白主要以包涵体的形式存在。

本研究对 PCV2 ORF2 截短基因进行了原核表达，通过对蛋白表达条件的优化，获得了可溶性的重组蛋白，并且对蛋白的免疫原性进行分析，为进一步研究 Cap 蛋白的功能，研发更为安全、高效、廉价的 PCV2 Cap 蛋白亚单位疫苗和特异、方便、快速检测试剂盒奠定了基础。

1 材料与方法1.1 质粒、菌种及试剂 PCV2 WH 株、PCV2 阳性血清、pET-32a(+) 载体系统、受体菌DH5a及BL21（DE3）感受态细胞均由南京天邦生物科技有限公司生物技术研究所制备并保存；Bam H I、Not I、T4 DNA 连接酶、DNA 提取试剂盒、DNA Marker （DL2000）均购自 TaKaRa公司；质粒提取试剂盒、DNA 胶回收试剂盒均购自 Axygen 生物技术有限公司；蛋白纯化试剂盒购自上海生工生物工程技术有限公司；弗氏佐剂及弗氏不完全佐剂、HRP 标记的羊抗猪 IgG 二抗购自 Sigma 公司；DAB 显色试· 30 ·2014年10月中国动物传染病学报r/min 离心1 min，收集菌体，重悬于适量5×SDS 上样缓冲液中，沸水浴10 min，取10 μL 13 000×g 进行SDS-PAGE 电泳分析。

1.6 重组蛋白的可溶性分析 将诱导表达的菌体，4℃、13 000×g1.7 重组蛋白的纯化用SDA-PAGE检测蛋白纯度，目的蛋白浓缩后用蛋白定量试剂盒定量。

1.8 融合蛋白的 Western blot 鉴定 将纯化后的样品经处理后进行SDS-PAGE，电泳结束后电转移到硝酸纤维素膜上，用5%的脱脂乳37℃封闭2 h，PBST洗涤5次；用1:100 稀释的抗PCV2阳性血清作为一抗37℃孵育1 h，PBST洗涤5次；放入1:8000稀释的辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗猪的二抗中，37℃作用40 min，PBST 洗涤5次后，DAB进行显色。