实验五 小鼠初级精母细胞染色体畸变试验 2009.12.01
实验2-小鼠精子畸形试验-20121025
制
颈椎脱臼 处死小鼠 取双侧 附睾
片
3ml磷酸盐 剪碎附睾 缓冲液
擦镜纸 过滤
取悬液滴于 玻片上推片
甲醇固定5 分钟
伊红染色30分钟
（五）阅片
首先在低倍镜下选择背景清晰、精子分布 均匀、重叠较少的区域，然后在高倍镜下 观察结构完整的500个精子，计数其中畸 形的精子数。
五、结果分析与评价
精子畸形形态观察 无钩、香蕉形、无定形、双头、 胖头、 折尾、双尾 计算精子畸形的发生率（头部重叠或全部 重叠的精子、无尾精子不进行计数）。
注意鉴别制片过程中人为造成的精子损伤。
正常精子
胖头精子
双头精子
双尾精子
双尾精子
双尾精子
香蕉形精子
人类精子
Thanks!
四、操作步骤
（一）动物选择 （二）剂量与分组 （三）染毒与采样 （四）制片 （五）阅片
（四）制片
颈椎脱臼法处死小鼠，剪开腹腔，分离并摘取 双侧附睾，将附睾放入盛有约3ml磷酸盐缓冲液或 生理盐水的小平皿中，以眼科剪将附睾剪成小 块，用吸管将悬浮液轻轻吹打5～6次，静置3～ 5min，用四层擦镜纸滤除组织碎片，吸取此精子 悬液滴于清洁载玻片上，均匀推片，待玻片晾干 后用甲醇固定5min，干燥后（此时也可镜检观察 精子形态）再用1%的伊红醇溶液染色1～2h（或 30min），流水冲洗，晾干后镜检。
一、目的
精子畸形试验是检测受试化学毒物 能否破坏哺乳动物精子正常形态的 实验方法 通过该实验，学习和掌握小鼠精子 畸形试验的原理和步骤
二、原理
精子畸形是指精子的形状异常和异常精 子数量的增多; 生殖系统对化学毒物的作用十分敏感, 在其它系统还未出现毒性反应之前，生 殖系统可能已出现损害作用;
实验一小鼠精子畸形试验(共13张精选PPT)
实验目的
通过该实验，学习和掌握小鼠精子畸形 实验的原理和步骤
实验原理
精子畸形是指精子形状改变和畸形精子 器材：眼科剪、眼科镊、玻璃平皿、显微镜、擦镜纸、吸管
精子畸形百分率 分别记录各种类型畸形的精子，进行精子畸形类型构成比分析，并计算每组动物精子畸形百分率。 精子畸形是指精子形状改变和畸形精子数量增多。
酰胺（ 50mg/kg ）
实验操作步骤
一、动物分组及处理
动物选择 分组及处理：
， 阳性对照组：8只雄鼠 环磷酰胺腹腔注射三次
空白对照组：16只雄鼠，不做任何处理
实验操作步骤
二、制片
实验操作步骤
三、片
低倍镜 找到背景清晰、精子重叠较少的 部位高倍镜 按顺序检查精子的形态。
每只动物检查完整的精子1000个。
实验结果分析与评价
精子畸形 主要表现在头部，畸形的类型 阳性对照组：8只雄鼠，环磷酰胺腹腔注射三次 可分为无钩、香蕉形、无定形、胖头、 空白对照组：16只雄鼠，不做任何处理
精子畸形 主要表现在头部，畸形的类型可分为无钩、香蕉形、无定形、胖头、双头以及双尾等。 通过该实验，学习和掌握小鼠精子畸形实验的原理和步骤
双头以及双尾等。 实验动物：雄性小鼠 （6-8周）24只
空白对照组：16只雄鼠，不做任何处理 试剂：生理盐水、甲醇（分析纯）、 2%伊红水溶液环磷酰胺（ 50mg/kg ）
精子畸形百分率 分别记录各种类型畸形 阳性对照组：8只雄鼠，环磷酰胺腹腔注射三次
器材：眼科剪、眼科镊、玻璃平皿、显微镜、擦镜纸、吸管 精子畸形百分率 分别记录各种类型畸形的精子，进行精子畸形类型构成比分析，并计算每组动物精子畸形百分率。
精子畸形是指精子形状改变和畸形精子数量增多。 阳性对照组：8只雄鼠，环磷酰胺腹腔注射三次
实验五
毒理学实验五小鼠精子畸形实验一、实验目的1、学习观察小鼠精子畸形的实验方法。
2、检测受试物对雄性生殖细胞的遗传毒性。
二、实验原理小鼠精子畸形受基因控制，具有高度遗传性，许多常染色体及X、Y性染色体基因直接或间接地决定精子形态。
在正常情况下，人与其它哺乳动物的精液中也有少量畸形精子，毒物影响下，数量大大提高。
三、试剂材料1、健康成年雄性小鼠，体重25 g ~30g2、器材剪子、镊子、玻璃小平皿、滴管、载玻片、擦镜纸、染色缸、显微镜3、试剂生理盐水、甲醇、2％伊红水溶液、受试物及阳性对照物环磷酰胺四、实验内容1、解剖小鼠、摘取附睾、涂片、固定。
2、镜下观察精子形态，记录畸形精子。
3、计算精子畸形率。
4、结果分析与评价。
五、操作步骤1、染毒：染毒5天，途径（一般经口）2、处死：35天后颈椎脱臼处死3、取材：附睾4、涂片：将附睾所有内容物直接涂片（一滴生理盐水）5、晾干：6、固定：甲醇固定5分钟7、冲洗和干燥8、镜检：低倍镜----油镜，镜检1000个精子，记录座标。
阴性对照组精子畸变率一般为1-3%精子畸形主要表现：(1)头部：无钩、香蕉形、胖头、无定形、双头(2)尾部：卷尾、双尾六、实验设计剂量和分组方法:受试物至少设3个剂量组，同时设阳性和阴性对照组。
最高剂量组应能使部分动物死亡，然后以高剂量组的1/2～1/4递减作为中、低剂量组。
阳性对照组给予环磷酰胺(20mg/kgBW～40mg/kgBW)，腹腔注射，连续5d，每天一次。
阴性对照组给予等体积的溶剂。
七、实验结果及分析1、正常小鼠精子涂片：由于是正常小鼠的精子涂片，因其畸形精子比例较低，没有观察到畸形精子，观察到一些正常精子，但由于没有进行固定染色，所以不是非常清晰。
在观察图片过程中，看到了一些条纹状的结构，阻碍了精子的观察，考虑可能是浓度太浓或者除精子外的其他组织被涂在载玻片上所致。
2、通过小鼠染毒的畸形精子样片，在镜下观察到了正常精子及畸形精子。
染色体畸变分析
五、操作步骤
1. 注射秋水仙素 2. 骨髓细胞的制备 3. 低渗 4. 固定 5. 制片 6. 干燥 7. 染色
毒理学基础实验课
染毒与取样时间 一般染毒一次或多次，多次更为合理。
具有这种能力的化学物质可能对生物体产生潜在性的远期危害。
三、器材与试剂 小鼠骨髓细胞染色体畸变分析试验
具有这种能力的化学物质可能对生物体产生潜在性的远期危害。 染色体畸变分析
（Chromosome Aberration Analysis)
染色体畸变分析
毒理学基础实验课
阳性结果的判定： 每只小鼠分析100个骨髓细胞。 实验组畸变率与阴性对照组比较，并进行统计分析，如果实 验组的畸变率显著高于阴性对照组，并有剂量反应关系，则 可认为该受试物对小鼠骨髓细胞有致染色体畸变的作用。
毒理学基础实验课
染色体畸变分析
（Chromosome Aberration Analysis)
哈尔滨医科大学公共卫生学院 卫生毒理学教研室 任锐
复 习
毒理学基础实验课
化学毒物致突变类型?
基因突变
碱基置换 移码突变
转换 颠换
染色体畸变 染色体数目改变
遗传学终点:
毒理学基础实验课
复习
基因突变
Ames实验
染色体畸变
微核实验 染色体畸变分析
染色体组畸变 染色体畸变分析
DNA原始损伤 分子生物学方法
毒理学基础实验课
小鼠骨髓细胞染色体畸变分析试验
毒理学基础实验课
一、目的
染色体畸变实验
实验十染色体畸变试验可用末梢血淋巴细胞，或人和哺乳动物体细胞系作为材料，常用的体细胞系有中国地鼠卵巢细胞（CHO），中国地鼠肺成纤维细胞（V79和CHL），人胚肺2倍体成纤维细胞等。
这里介绍外周血淋巴细胞为对象的染色体畸变的试验方法。
1．实验原理外周血中小淋巴细胞几乎都处在细胞增殖周期的G1期或G0期（不同于体外培养的体细胞），一般条件下是不会再分裂的。
当在培养物中加入适量的PHA，在37℃下，经52～72h 的培养，淋巴细胞开始转化，进入细胞增殖周期，此时可获得大量的有丝分裂的细胞。
再经过秋水仙素处理，低渗、固定，即可在显微镜下观察到良好的中期染色体分裂相。
电离辐射，化学有害物质作用于机体或体外细胞，均可引起细胞染色体的损伤，且与剂量（浓度）呈良好的线性关系。
因此，染色体畸变已用于电力辐射事故的生物计量估算。
2．方法与步骤（1）试剂①RPMI-1640培养液，含20%小牛血清。
②肝素：每支含肝素12500U，使用时用生理盐水配成500U/ml，4℃冰箱内保存备用。
③秋水仙素：配成40ug/ml浓度。
称取秋水仙素4mg，溶解于100ml 0.85%Nacl 溶液中，经6号细菌漏斗过滤，4℃冰箱内保存。
使用时吸取0.05或0.1ml加入到5ml细胞培养物中，其终浓度为0.4～0.8ug/ml。
④双抗：青霉素100U/ml，链霉素100ug/ml。
⑤PHA:PHA为冰干注射剂（广州生产）每支10mg，使用时用2ml生理盐水溶解。
⑥KCl低渗液：KCl 1.88g，双蒸水1000ml使之溶解，其浓度为0.025M.⑦冰醋酸甲醇固定液：冰醋酸1份，甲醇3份，混合而成。
（2）细胞培养常规细胞培养。
（3）受试物的处理实验分组：至少设立五个组，即阳性对照、阴性（溶剂）对照及三个剂量组。
最高剂量和最低剂量之间相差10倍，中间再设一个剂量，阳性对照物为已知的染色体断裂剂，如丝裂霉素C(MMC)，剂量为0.02μg/ml；黄曲霉素毒素B1，浓度为10-6M等。
小鼠初级精母细胞减数分裂前期联会复合体观察
小鼠初级精母细胞减数分裂前期联会复合体观察汪虹英;蔡欣【期刊名称】《西北农林科技大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2012(040)006【摘要】【目的】通过SCP3蛋白免疫荧光染色法,研究小鼠初级精母细胞减数分裂前期Ⅰ不同分裂相联会复合体的形态变化。
【方法】从小鼠睾丸取曲细精管,用铺展法制片,对初级精母细胞SCP3蛋白进行免疫荧光染色,观察减数分裂前期Ⅰ不同分裂相联会复合体的形态变化。
【结果】在细线期,可见短小、不连续而杂乱簇聚的SCP3蛋白片段;在偶线期,SCP3蛋白趋于明显,连续并呈线状,但没有形成完整的联会复合体;在粗线期,SCP3蛋白结构完整而清晰,小鼠初级精母细胞联会复合体共有20条,包括19条常染色体联会复合体和1条XY联会复合体;双线期,构成联会复合体的2条SCP3蛋白开始相互排斥而分离,导致联会复合体开始解体,但此时的二价体结构依然清晰可见。
【结论】SCP3蛋白免疫荧光染色是研究减数分裂前期Ⅰ不同分裂相联会复合体形态变化的强有力工具。
【总页数】4页(P19-22)【作者】汪虹英;蔡欣【作者单位】西南科技大学材料科学与工程学院,四川绵阳621010;西南科技大学生命科学与工程学院,四川绵阳621010【正文语种】中文【中图分类】Q234;Q343.23【相关文献】1.白菜同源多倍体减数分裂期联会复合体蛋白ZYP1的细胞学分析 [J], 韦珍珍;毋瑞华;魏小春;杨妍;田保明;位芳;师恭曜;曹刚强;张晓伟2.减数分裂联会复合体整体制片的银染技术 [J], 牛新华;邢娟3.减数分裂联会复合体的制备技术 [J], 牛新华4.植物减数分裂中联会复合体的研究进展 [J], 范竹萱;宋莹;曹刚强;位芳5.减数分裂联会复合体异常与不孕不育相关性研究进展 [J], 聂辉;张译文;李佳宁;王楠楠;徐澜因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
小鼠精子畸形实验
操作步骤
处死动物：用颈椎脱法处死小鼠，剪开腹腔， 处死动物：用颈椎脱法处死小鼠，剪开腹腔，取 出两侧附睾 过滤：放入盛有约１ 生理盐水的平皿中 生理盐水的平皿中， 过滤：放入盛有约１ml生理盐水的平皿中，用眼 科剪剪碎附睾， 科剪剪碎附睾，四层擦镜纸过滤 涂片： 涂片：取１小滴滤液涂片 固定：干燥，甲醇固定５分钟（ 固定：干燥，甲醇固定５分钟（可以直接涂片镜 检） 染色： 伊红染色１小时， 染色：用２％伊红染色１小时，冲洗 镜检：干燥镜检（先用低倍镜，再用高倍镜， 镜检：干燥镜检（先用低倍镜，再用高倍镜，在 较暗的视野下观察） 较暗的视野下观察）
小鼠精子畸形实验 Sperm Abnormality Test in Mouse
西南大学药学院
Hale Waihona Puke 目的观察精子在生成过程中形态的改变来 检 查受试物对雄性生殖细胞的致突变作 用.
原理
精子的成熟和正常形态受多种基因控制， 当这些基因中任何一个在化合物的作用下 发生突变，就会导致畸形率增高。某些特 殊的染色体重排，如性-常染色体易位是 精子产生畸形的主要机理。但是，缺血、 变态反应、感染和体温升高也可能导致精 子的畸形。
器材与试剂
器材：显微镜；镊子；剪刀；平皿 试剂：生理盐水；无水乙醇；2%伊红水 溶液
试验设计
1、试验动物：采用6～8周龄性成熟雄性小 、试验动物：采用 ～ 周龄性成熟雄性小 鼠 2、接毒剂量及分组：受试物设高、中、低 、接毒剂量及分组：受试物设高、 三个剂量组，同时设阴性和阳性对照组。 三个剂量组，同时设阴性和阳性对照组。 受试物高剂量组的总剂量应能使部分动物 死亡，然后以1/5或 递减为中、 死亡，然后以 或1/10递减为中、低剂量 递减为中 组。 阳性对照组用环磷酰胺20 阳性对照组用环磷酰胺 mg/kg，腹腔注 ， 连续５ 每天一次。 射，连续５天，每天一次。
细胞致畸实验报告
本实验旨在探究甲、乙两种化学物质是否具有致畸作用，并通过比较二者的毒性强度，为相关领域的科学研究提供实验依据。
二、实验材料1. 实验材料：小白鼠胚胎、胰蛋白酶、动物细胞培养液、动物细胞固定液、适宜浓度的龙胆紫溶液、滴管、培养皿、剪刀、锥形瓶、细胞培养箱、载玻片、盖玻片、光学显微镜。
2. 实验试剂：甲、乙两种化学物质。
三、实验方法1. 制备细胞悬液：用胰蛋白酶处理小白鼠胚胎组织，使其离散成单个细胞，制成细胞悬浮液。
2. 细胞培养：取A、B、C三个洁净的培养瓶，分别加入等量的细胞悬浮液。
向A、B两个培养瓶中加入化学物质甲、乙，并将培养瓶摇匀；C瓶不作处理，作为对照。
3. 培养条件：将3个培养瓶放在37℃的细胞培养箱中培养。
4. 观察与统计：待细胞生长至一定阶段后，制作临时装片。
使用显微镜观察有丝分裂中期的细胞，并与C组对比，以确认发生变异的细胞。
统计该期变异的细胞占该期细胞总数的百分数（Q值）。
5. 数据分析：比较A、B两组的Q值，判断甲、乙两种化学物质的致畸作用。
四、实验结果1. A组：Q值为0.1%，表明化学物质甲具有致畸作用。
2. B组：Q值为0.2%，表明化学物质乙具有致畸作用。
3. C组：Q值为0.05%，作为对照组，无致畸作用。
五、实验结论通过本实验，我们得出以下结论：1. 甲、乙两种化学物质均具有一定的致畸作用。
2. 在比较毒性强度方面，化学物质乙的致畸作用强于甲。
1. 本实验采用动物细胞培养方法，观察化学物质对细胞的影响，具有较好的准确性和可靠性。
2. 实验结果表明，化学物质甲、乙均具有一定的致畸作用，提示我们在日常生活中应避免接触这些物质。
3. 本实验为相关领域的科学研究提供了实验依据，有助于进一步探讨化学物质致畸作用的机制。
4. 在后续研究中，可以进一步探究化学物质致畸作用的阈值、作用机制以及预防措施等。
七、实验建议1. 实验过程中，应严格控制培养条件，确保实验结果的准确性。
2. 可增加实验重复次数，提高实验结果的可靠性。
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8、读片 在低倍镜下按一定顺序寻找背景清晰、
分散良好、染色体收缩适中的中期分裂相细
胞，再在油镜下选取邻近无游离染色体或中
期相的细胞进行观察。
9．观察 每只动物分析100个中期分裂相
细胞。 （1） 裂隙、断片、缺失、微小体、环状
染色体、整倍体和非整倍体改变等。
（2）相互易位 涉及非同源染色体间末
端断片的交换，需要两次断裂和修复。
1.5～2mg/kg
腹腔注射一次；或环磷酰胺40mg/kg， 腹腔注射，1次/d，连续5天。
试验设计
－剂量组 高剂量 根据急性LD50，选用使动物轻
微中毒，体重略有下降，不引
起动物死亡的剂量 按等比级数2向下设置中、低剂量组
接触途经
与实际接触途经一致或接近，
可一次接触，也可每天接触一次，连续5
天的方法。 取样时间 各组均于第一次接触后第12～14
试剂
0.04% 秋水仙素：置于棕色瓶中，冰箱
保存;
低渗液：1 %柠檬酸三钠溶液; 1 %枸橼
酸三钠溶液；0.4％KCL, 300ml
60%冰乙酸: 临用时现配, 100ml 固定液: 甲醇与冰醋酸以3:1混合，临用
时现配, 400ml;
试剂
磷酸盐缓冲液（pH 6.8）
12水磷酸氢二钠（Na2HPO4）11.81 g （磷酸氢二
（3）X-Y和常染色体的单价体
结果评价
统计学方法：受试样品组与对照组的断片、易位、畸
变细胞率、常染色体单价体、性染色体单价体等分别
按X2检验或Kastenbaum 和Bowman所述方法进行统计 分析。 阳性：受试样品组染色体畸变率与阴性对照组相比， 统计学意义上有显著性差异，并有明显的剂量—反应
仪器和器械
生物显微镜、离心机、解剖剪、眼科镊 子、注射器、灌胃针头、小平皿、离心
管、吸管、滴管、试管架、载玻片、玻
璃染色缸、擦镜纸等。
试剂
姬姆萨（Giemsa）染液
Giemsa染料
甲醇
3.8 g
375 ml
甘油
125 ml
配制：将Giemsa染料和少量甲醇于乳钵里仔 细研磨，再加入甲醇至375 ml，待完全溶解后， 再加入125ml甘油，混合均匀。置37℃恒温箱 中保温48h。保温期间振摇数次，促使染料的 充分溶解。取出过滤，两周后使用。
钠：4.74g）
磷酸二氢钾（KH2PO4）4.50 g
加蒸馏水至 1000 ml
Giemsa应用液:
取1份Giemsa染液与9份1/15mol/L 磷酸盐缓冲
液混合而成，临用时配制。
试验设计
实验动物 7～12周龄健康雄性小鼠，每组保
证至少5只存活
剂量分组
– 阴性对照组 溶剂 – 阳性对照组
丝裂霉素C
天将动物处死采样。
操作步骤
1、注射秋水仙碱 动物处死前6h腹腔注射 秋水仙碱4mg/kg（0.04％，0.1ml/10g） 2、动物处死 颈椎脱臼处死小鼠，取两侧 睾丸，去净周围组织和脂肪，放入盛有 转入另一小平皿中 。
适量低渗液的小平皿中，洗去毛和血污，
3、低渗 用眼科镊撕开睾丸被膜，轻轻
分离曲细精管，加低渗液10mL，用滴
实验五 小鼠初级精母细胞染色体畸变试验
Mammalian Spermatocyte Chromosome Aberration Test
目的
本试验是一项检测生殖细胞染色体畸变效 应试验，利用细胞遗传学方法，检测整体 哺乳动物初级精母细胞染色体畸变，以评 价受试样品引起生殖细胞可遗传突变的可 能性。 学习小鼠初级精母细胞染色体畸变试验方 法的基本操作步骤。
管吹打混悬曲细精管，室温下低渗20～
40min（低渗时间依室温条件而定）。 4、固定 仔细吸净低渗液，加固定液 10mL，固定20min。必要时可存放在冰 箱中过夜，但软化前应将固定液吸掉，
再加入新鲜固定液，固定10min。
5、软化 吸净固定液，加60％冰醋酸2mL，
滴管吹打至不透光，立即加入4mL固定液，
原 理
不同发育阶段的雄性生殖细胞对化学物质的敏感性 不同，初级精母细胞对化学诱变剂较敏感。多数情 况下，化学诱变剂诱发染色体畸变必须经过DNA复 制期。哺乳动物精子发生过程中，DNA合成是在初 级精母细胞细线期以前的各阶段细胞中进行，以后 孵育的细胞不再进行DNA合成，故受试物需在前细 线期给予。于小鼠第一次接触受试物后的第12～14 天采样制片，可观察到前细线期接触引起的精母细 胞染色体畸变效应。
关系或在一个受试样品量—反应关系，则
须进行重复试验，结果能重复者可确定为阳性。
小白鼠的染色体分裂相（2n＝40）
小白鼠的染色体
用滴管打匀，移入离心管，以1 000r/ min离
心10min。 6、制片 弃去大部分上清液，留下约0.5～ 1mL，充分打匀制成细胞悬液。将细胞悬液 均匀地滴于冰水玻片上，轻吹细胞悬液扩散 平铺于玻片上。每个睾丸制片2～3张。空气 干燥或微热烘干。
滴片
预冷的玻片
7、染色 将制备好的标本片放入Giemsa应用液 中染色20～30min。立即用蒸馏水或磷酸盐缓 冲液冲洗。晾干。