应用原位双膜法快速筛选人Flt3配体甲醇酵母高表达转化子(论文)

［ ］ > 重建具有重要作用 $ 最近发现，% * 能明显地促
进细胞毒 H 淋巴细胞、自然杀伤细胞特别是树突
［ ］ # 状细胞等免疫系统细胞的增生 $ 患肿瘤小鼠经 ［ ，］ % * 治疗后，可产生明显的抗肿瘤作用 I5 本文 构建了膜外区可溶型 ) % * 的酵母表达质粒，并用
生物 素，! ／ ，S "* 甘 油） 88U（ 将 S 8: U中 ／ 甘油替换为 #, ／ ／ ! "* & * 甲醇，平板加入 ! #* 琼脂糖） $ 方法 % & ’ % & ’ & % M N R 扩增目的基因片段：根据 ) % * 膜外区 ! # I个氨基酸残基的 9 J Q 1 序列，设计并合成 ! + 条# ("I "X L 的 单 链 寡 核 苷 酸$ 其 中 第 一 条 含
# 结
果
# " $ G * A H - 检测 从醋酸纤维素膜上挑选 6 7 个强染色和 6 个弱 染色的菌落进行液体培养，培养上清稀释6倍后进 行Q # * : & 检 测，结 果 证 明 强 染 色 转 化 子 均 表 达 ! " # 膜外区，且染色强度与液体诱导表达水平正相 关（表6 ） ’
# " ! ( ) *+ , - 片段的合成和重组表达载体的构建 6 >条单链寡核苷酸经1轮 ) + / 后得到编码 ! " # 和$ 双酶切，与 膜外区的 $ " # ! % # /! % & 片段，经 ! 万方数据 经同样处理的 ( ) * + , - 连接，构建得到重组表达质
； （ ） + " " + ’ ( +
生物化学与生物物理进展
) * + . / + 0 1 2 3. / + 1 6 , 4 5
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应用原位双膜法快速筛选人 ! " # $ 配体 甲醇酵母高表达转化子 !
! 杨克恭 狄 旭 熊安琪 张友鸿 张艳丽 陈松森!
（ 中国医学科学院基础医学研究所 ） 医学分子生物学国家重点实验室，北京 ! " " " " # 中 国协 和医 科 大 学 基 础 医 学 院
# " # 双膜原位杂交筛选高表达 ( ) * 的转化子 电转时用不同的细胞浓度铺 F$ ／ . 2 A G板，每 板得到6 7 7 # 6 7 7 7个转化子’酵母菌落被转到醋酸 纤维素薄膜上以后，置于 B FFK 平板上， H 7 I诱 导表达’两者之间的硝酸纤维素薄膜将透过醋酸纤 维素薄膜的酵母外泌 ! " # 捕获，根据免疫显色的 强弱鉴定转化子表达水平的高低，各染色点对应于 醋酸纤维素薄膜的相应菌落，不同菌落的显色强度 有明显差异（图 > ） ，而且有许多菌落在硝酸纤维 素薄膜上找不到相应染色点，说明这些菌落基本无 表达’
粒( （图6 ） ) * + , . ! " # ’经测序结果正确’
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! " ##酶切位点，采用酵母嗜好密码子，第十二条 含$ % # R#切点$共经过>轮 M N R 反应，逐步扩增
! “十五”国家高技术“ ! ! 通讯联系人
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将固体培养基上的菌落转移到醋酸纤维素薄膜上， 再利用硝酸纤维素薄膜原位捕获穿过醋酸纤维素薄 膜的菌落外泌蛋白，然后用免疫方法检测与硝酸纤 维素薄膜结合的蛋白，其染色强度直接反映菌落的 蛋白外泌量$原位双膜筛选法较 : > ! 6 抗性等其他 筛选方法更为快捷、准确$ ， % & ’ ( 配 体 （? , @ A & B 2 <’ ; D @ B E <2 B E F @ < A (& B F E G C ）是! % * 7 7 (年新发现的造血细胞生长因子，它对 造血干 ／ 祖细胞的增生、分化、动员、维持及长期
原位双膜筛选法得到较高表达的酵母转化子，表达 量约+ ／ ", *$ -
% 材料和方法
% & % 材料 % & % & % 质 粒、菌 株、酶 和 主 要 试 剂：大 肠 杆 菌 J K # ! 细 胞 株 由 本 室 保 存$: 0 ! ! #酵母菌株和 万方数据 M / N 7 O 购自/ E P B ’ ; D < E 公 司$ 限 制 性 内 切 酶， L -
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生物化学与生物物理进展
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摘要
原位双膜法是一种基于免疫原理的快速筛选高表达甲醇酵母转化子的方法，即首先将固体培养基上的菌
落转印至醋酸纤维素薄膜上，再利用硝酸纤维素薄膜原位捕获穿过醋酸纤维素薄膜的菌落外泌蛋白，然后用免 疫方法检测与硝酸纤维素薄膜结合的蛋白$ 利用此法筛选到人 % & ’ ( 配体（) % *）的甲醇酵母高表达转化子，液 体诱导表达量约+ ／ ", * $. * / 0 1 结果证明，原位双膜法所得的菌落染色强度与该菌落液体诱导表达水平正相 关$蛋白质印迹结果显示，培养上清在+ #2 3处有明显杂交条带，而对照组杂交呈阴性，且表达量随诱导天数增 加$原位双膜法是一种良好的筛选方法，可以快捷、准确地筛选高表达酵母转化子$ 关键词 人 % ） ，表达，巴斯德毕赤酵母，原位双膜筛选法 & ’ (配体（) % * 学科分类号 4 5 6
( ) * + S . ! " # ST U V W ( 2 A G X 4 5 4 & ’ ( ! ! " # !
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巴斯德毕赤甲醇酵母是一种有效的外源基因表 $ 但是 毕赤酵母每个转化子表达外源蛋白的能力差异极 大，寻找高表达转化子的工作极为费时费力$ ! 7 7 5
［ ］ 年8 9 : ; < = 等 ( 创建原位双膜筛选法，他们首先
达系统，目前已表达外源蛋白 + " "
［ ， ］ ! + 多种
M ? 3 A J Q 1 聚合酶，J Q 1 连接酶购自 H F O F R F公司、 上海 0 F E D E公司及 S D < ) ; B E < ;8 F E E ) < B , 公司；单 链寡 核 苷 酸 片 段 由 上 海 0 F E D E 公 司 合 成； 由 H F O F R F公司进行 J Q 1 序列测定$ 低分子质量标 准蛋白购自 M ) F ; , F 9 B F公司$兔抗 ) % * 多克隆抗体 为0 ’ ; F ’ ) , F E ES B D ’ < 9 ) 公 司 产 品$ 碱 性 磷 酸 酶 （1 ）标记羊抗兔/ M : 购自北京邦定泰克生物技术 有限公司$ ／ ／ ， % & % & ’ 培养基： 8J A K B @平板（! ( T >*U Q S W > ／ 生物素， ／ ／ > V ! " -* + "* 葡萄糖， ! #* 琼脂 糖） ，U ／ ／ M J（! "* 酵 母 粉，+ "* 蛋 白 胨， ／ ／ ，S + "*葡萄糖，平板加入 ! #* 琼脂糖） 8: U （ ／ ／ ／ ! "* 酵母粉， + "* 蛋白胨， " T !, D & * 磷酸