生物工艺学重点内容

生物工艺学（生物技术）的概念与特点是应用自然科学及工程学原理依靠生物催化剂的作用将物料进行加工以提供产品或社会服务的技术。

（现代）发酵工程的概念与基本步骤主要指利用微生物、包括利用DNA重组技术改造的微生物在全自动发酵罐或生物反应器中生产某种商品的技术。

包括以下基本步骤：（1）菌种选育；（通过细胞诱变或基因工程技术改造等）（2）细胞大规模培养即发酵过程；（3）生产活性的诱导；（在发酵特定阶段，用化学或物理法）（4）菌体及产物的收获（利用浓缩、吸附、过滤、离心、萃取、干燥、重结晶等手段）发酵工程概念、内容和过程要求⏹概念：指采用现代工程技术手段，利用微生物的某些特定功能，为人类生产有用的产品，或直接把微生物应用于工业生产过程的一种新技术。

⏹内容：菌种的选育、培养基的配制、灭菌、扩大培养和接种、发酵过程和产品的分离提纯等。

⏹要求：a.要随时取样检测培养液中的细菌数目、产物浓度等，以了解发酵进程；b.及时添加必需的培养基组分，以满足菌种的营养需要；c.要严格控制温度、pH、溶氧、通气量与转速等发酵条件。

微生物发酵工业特征⏹反应条件温和通常由于微生物的生理特性，要求温度为30℃-40℃pH值中性偏酸性——酵母、霉菌、放线菌等pH值中性偏碱性——细菌的发酵⏹无菌发酵整个反应过程要求无菌：培养基无菌、空气无菌、补料和取样要求无菌操作、某些工程菌，其尾气也要求进行无菌处理。

⏹非连续性生产微生物的生理特性决定了发酵过程的非连续性大部分的工业发酵是以间歇操作为基础进行的，目前可以实现连续化生产的是：啤酒的连续化生产……获得发酵产品的条件⏹适宜的微生物⏹保证或控制微生物进行代谢的各种条件⏹进行微生物发酵的设备⏹精制成产品的方法和设备发酵工程的发展历史；青霉素发酵的主要的技术进展与意义⏹发展历史发酵---古老的艺术初期---微生物发现近代---深层发酵技术现代---DNA重组及细胞融合技术⏹技术进展通气搅拌解决了液体深层培养时的供氧问题。

抗杂菌污染的纯种培养技术：无菌空气、培养基灭菌、无污染接种、大型发酵罐的密封与抗污染设计制造。

⏹意义：抗生素工业的发展建立了一套完整的好氧发酵技术，大型搅拌发酵罐培养方法推动了整个发酵工业的深入发展为现代发酵工程奠定了基础代谢控制发酵理论的要点⏹定义：用人工诱变的方法，有意识地改变微生物的代谢途径，最大限度地积累产物⏹要点：大多数的工业产品并不是微生物代谢的末端产物，而是微生物代谢的中间性物质，要合成、积累这些物质，必须解除他们的代谢调控机制。

通过遗传学或其它生物化学的方法，人为地在脱氧核糖核酸（DNA）的分子水平上，(无定向诱变)改变和控制微生物的代谢，使有用的代谢产物大量生成、积累的发酵技术。

基因工程菌发酵的技术特点和意义⏹技术特点:可定向改造生物基因，按人们的意志生产产品。

⏹意义:将引起发酵工程的技术革命。

工业发酵的步骤(1) 用作培养菌种及扩大生产的发酵罐的培养基的配制(2) 培养基、发酵罐以及辅助设备的消毒灭菌(3) 将已培养好的有活性的纯菌株以一定量转接到发酵罐中(4) 将接种到发酵罐中的菌株控制在最适条件下生长并形成代谢产物(5) 将产物抽提并进行精制，以得到合格的产品(6) 回收或处理发酵过程中产生的废物和废水微生物发酵的本质可以理解为物质形式的转化过程，就是利用微生物生长所需的营养物转化成特定的产物培养基的配制原则（一）培养基组分应适合微生物的营养特点（目的明确）（二）营养物的浓度与比例应恰当（营养协调）（三）物理化学条件适宜（条件适宜）（四）根据培养目的选择原料及其来源（经济节约）不同微生物对水分活度的要求细菌：一般0.90~0.98；嗜盐菌0.75酵母菌：一般0.87~0.91；高渗酵母0.61~0.65；鲁氏酵母0.60霉菌：一般0.80~0.87；耐旱菌0.65~0.75；双孢旱霉0.60如何理解“根据培养基的应用目的选择原料及其来源”该培养基的应用目的，即：是培养菌体还是积累代谢产物？是实验室种子培养还是大规模发酵？代谢产物是初级代谢产物还是次级代谢产物？☆用于培养菌体种子的培养基营养应丰富，氮源含量宜高（碳氮比低）；☆用于大量生产代谢产物的培养基其氮源一般应比种子培养基稍低，（但若发酵产物是含氮化合物时，有时还应提高培养基的氮源含量）；若代谢产物是次级代谢产物时要考虑是否加入特殊元素或特定代谢产物的前体物；☆当所设计的是大规模发酵用的培养基时，应重视培养基中各成份的来源和价格，应选择来源广泛、价格低廉的原料，提倡以粗代精，以废代好。

实消（批式灭菌）的工艺操作要点⏹定期检查设备、管道有无渗漏，主要是：冷却管道，夹套。

⏹灭菌之前，先把发酵罐的分空气过滤器灭菌并且用空气吹干。

⏹开始灭菌时，放出夹套和蛇管中的冷水，开启排气管阀，通过空气管向罐内的培养基通入蒸汽进行加热，同时，也可在夹套内通蒸汽进行间接加热。

升温时，打开所有排气阀门，排掉空气⏹当培养基温度升到70℃左右时，从取样管和放料管向罐内通入蒸汽，培养基温度达120℃，罐压达1×105Pa(表压)时，安装在发酵罐封头上的接种、补料、消沫剂、酸、碱管道应排汽，并调节好各进汽和排汽阀门，使罐压和温度保持在这一水平进行保温30~45min。

⏹在保温阶段，凡进口在培养基液面下的各管道以及冲视镜管都应通入蒸汽，在液面上的其余各管道则应排放蒸汽，目的是对管道进行灭菌。

这样才能保证灭菌彻底，不留死角。

⏹保温结束后，依次关闭各排气、进汽阀门，待罐内压力略高于大气压力时，向罐内通入无菌空气，在引入无菌空气前，罐内压力必须低于过滤器压力；否则，培养基将倒流入过滤器内。

在夹套和蛇管中通入冷水，使培养基温度降到所需温度。

⏹引入无菌空气？保证罐内压力后方可冷却，目的是防止培养基的冷却使罐内形成负压，易染菌，甚至设备损坏。

微生物所需要的五大营养要素包括碳源、氮源、无机元素、生长因子及水发酵培养基的选择、设计和注意事项⏹(1)必须提供合成微生物细胞、代谢活动和发酵产物的基本营养成分。

（如何理解？）⏹对菌体生长与产物相偶联的发酵类型，充分满足细胞生长繁殖的培养基就能获得最大的产物。

⏹生产氨基酸等含氮化合物时，除充足的碳源物质外，还应该添加足够的铵盐或尿素等氮素化合物。

⏹主成分与其他成分的配比。

⏹合适的pH：微生物的生长繁殖或产物合成需要特定的pH环境。

⏹合适的浓度：从发酵动力学有关生长、产物合成和基质利用物料平衡的关系中推算所需原料或主要原料的需要量。

⏹柠檬酸发酵中铁、锰和锌离子都能明显影响产量，⏹钙离子对细菌淀粉酶的生产有促进作用，⏹钴离子对葡萄糖异构酶的发酵是必需的。

⏹(2)有利于减少培养基原料的单耗，即提高单位营养物质所合成产物数量或最大产率。

⏹(3)有利于提高培养基和产物的浓度，以提高单位容积发酵罐的生产能力。

⏹(4)有利于提高产物的合成速度，缩短发酵周期。

大量地接入培养成熟的菌种的优点⏹ 1.可以缩短生长过程的延缓期，因而缩短了发酵周期，提高了设备利用率，⏹ 2. 节约了发酵培养的动力消耗，⏹ 3.并有利于减少染菌机会。

淀粉质原料的处理过程预处理，水热处理，蒸煮，糖化处理代谢所需的底物只能是Glucose等单糖或双糖的微生物⏹酵母：G、F、蔗糖、半乳糖、以及部分麦芽糖等⏹大部分的细菌：GA产生菌、Lys产生菌、苏云金芽孢杆菌等淀粉水解程度的检测方法⏹1，测定还原糖，⏹2，酒精法，碘液法。

糖蜜原料的处理过程包括稀释、酸化、灭菌、澄清和添加营养盐等过程基本概念：培养基(medium)、碳氮比（C/N）、生长因子、前体物质、糖化力单位、DE值、Bx(糖度)⏹培养基：应科研或生产的需要，由人工配制的、适合于不同微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质（混合养料）。

⏹C/N比值=碳源中的碳原子的mol数/氮源中所含的氮原子的mol数⏹生长因子：凡是微生物生长不可缺少的微量有机物质⏹前体物质：指某些化合物加入到发酵培养基中，能被微生物在生物合成过程中结合到产物分子中去，其自身结构并无多大变化，但产量却因前体的加入有较大提高。

⏹糖化力单位：1g曲在2%的可溶性淀粉溶液中，60℃、1h糖化可溶淀粉转化成葡萄糖的毫克数，⏹DE值：是表示淀粉或转化淀粉按葡萄糖计算时的总还原值，以对总干物质的百分率表示。

⏹Bx（糖度）：是表示糖液中固形物浓度的单位，工业上指100克糖溶液中，所含固体物质的溶解克数。

微生物工业对菌种的要求⏹能在廉价原料制备的培养基上迅速生长和生成所需的代谢产物产量高。

⏹培养条件易于控制⏹生长迅速，发酵周期短⏹满足代谢控制的要求⏹抗噬菌体能力强⏹菌种不易变异退化⏹安全性（不是病源菌，不产毒素）种子罐的接种方法⏹微孔接种法、火焰保护法、差压法种子罐级数（制备种子需逐级扩大培养的次数）的决定因素⏹菌种生长特性、孢子发芽及菌体繁殖速度；⏹所采用发酵罐的容积⏹工艺条件根据“菌种生长特性、孢子发芽及菌体繁殖速度”，不同微生物的种子罐级数如何？⏹细菌：二级发酵。

⏹霉菌：三级发酵⏹放线菌：四级发酵⏹酵母：一级种子微生物菌种的来源⏹根据资料直接向有关科研单位、高等院校、工厂或菌种保藏部门索取或购买；⏹从大自然中分离筛选新的微生物菌种工业菌种育种的方法⏹自然选育、诱变选育、杂交育种、原生质体融合技术育种、基因工程育种诱变育种步骤？说明其中“中间培养”的重要性•出发菌株的选择•处理菌悬液的制备•诱变处理•中间培养•分离和筛选⏹由于表现延迟 (生理延迟)，需3代以上的繁殖才能将突变性状表现出来。

筛选营养缺陷型的步骤？检出营养缺陷型的原理与方法•诱变•淘汰野生型•检出缺陷型•确定生长谱⏹原理：在固体基本培养基和完全培养基上，生长情况完全不同，缺陷型在CM上生长良好，而在MM上则不生长，野生型都能生长。

⏹具体方法：影印法、点种法、夹层法柠檬酸产生菌的育种⏹柠檬酸发酵和其他代谢控制发酵一样，都是在环境水平上的代谢控制发酵，亦即，选育有代谢技能的突变株，在有控制的培养基上，在有选择的条件下，才能大量合成产物。

⏹ 1.透明圈大的菌株平板：10%甘薯 + 2 %的琼脂 + 0.5% CaCO3诱变后，涂布，透明圈大的则好，为何？淀粉的水解能力。

⏹ 2.现色圈大小平板：麦汁培养基 + pH值指示剂诱变后，33℃培养3天，透明圈大的则好。

为何？产酸量大。

⏹ 3.不分解柠檬酸的菌株⏹不利用柠檬酸为碳源进行生长的菌株，说明其TCA循环中柠檬酸后述的酶的活性较低，或者丧失，这有利于柠檬酸的积累。

⏹方法：以柠檬酸为唯一的碳源的培养基上，选择生长不好的突变株。

⏹ 4.选育不长孢子、少长孢子、迟长孢子的菌株⏹在培养基中如果菌株能够大量合成积累柠檬酸，自然会使TCA循环中的中间产物浓度降低，这样不利于孢子的形成。

（中间产物少，C架少，不利于合成代谢……）初级代谢产物与次级代谢产物的概念、主要特征与区别⏹（1）初级代谢产物⏹定义：微生物通过代谢活动所产生的、自身生长和繁殖所必需的物质。