08实验八+细胞凋亡的诱导和细胞凋
细胞凋亡诱导技术的使用教程
细胞凋亡诱导技术的使用教程细胞凋亡是一种广泛应用于生物研究和药物开发领域的重要技术。
它是一种程序性细胞死亡的形式，通常由外界刺激或内源性信号引起。
本文将为您介绍使用细胞凋亡诱导技术的步骤、方法和注意事项。
第一步：选择适当的细胞凋亡诱导剂在进行细胞凋亡实验前，您需要根据实验目的和研究对象选择适当的细胞凋亡诱导剂。
常用的细胞凋亡诱导剂包括化学物质如顺铂和纤维芽细胞生长因子（FGF）等，以及光照、温度、药物等其他外界刺激。
确保所选的诱导剂具有稳定的活性和可重复性。
此外，在选择诱导剂时，还需考虑细胞类型和所需的凋亡研究重点。
第二步：确定适当的细胞系和培养条件选择适当的细胞系对于细胞凋亡实验至关重要。
不同类型的细胞对于细胞凋亡的响应可能不同，因此在开始实验之前，您应首先确认所选细胞系是否容易发生细胞凋亡。
一般来说，肿瘤细胞比正常细胞更容易发生凋亡反应。
此外，确定细胞的培养条件也是非常重要的。
不同的细胞系对培养基组分和培养条件的要求有所不同，在实验前应进行相关的优化。
第三步：优化诱导剂的浓度和处理时间在实验中，您需要确定诱导剂的最佳浓度和处理时间。
这些参数的选择应基于前期的实验数据和文献报道。
一般来说，使用较低剂量的诱导剂和较短的处理时间可以获得更为准确和可靠的实验结果，并减少不必要的细胞损失。
因此，在进行正式实验之前，先进行浓度梯度和时间梯度的预实验是非常重要的。
第四步：检测细胞凋亡的方法选择在细胞凋亡实验中，您需要选择适当的方法来检测细胞凋亡的程度。
常用的方法包括荧光染料染色、流式细胞术和电镜观察等。
荧光染料如荧光素酶染料（如Annexin V-FITC/PI染色）可用于进行早期和晚期凋亡细胞的区分，而流式细胞术则可提供关于凋亡细胞比例和细胞周期的详细信息。
根据实验需要和设备条件，选择适当的检测方法。
第五步：数据分析和实验结果解读在完成细胞凋亡实验后，您需要对结果进行合理的数据分析和解读。
根据实验所用的方法，计算并记录凋亡细胞比例、细胞周期等相关指标。
细胞凋亡实验详细步骤及说明
细胞凋亡实验详细步骤及说明
细胞凋亡是细胞在正常发育或应激条件下程序性死亡的过程。
为了深入了解细胞凋亡的机制和影响因素，以下是细胞凋亡实验的详细步骤及说明：
步骤一：培养细胞
1. 准备培养皿并涂覆培养基，确保培养基的成分适合所使用的细胞类型。
2. 从培养细胞的主要来源（如细胞培养库）中获取细胞。
3. 将细胞转移到培养皿中并在适当的温度和湿度下孵育。
步骤二：处理实验组
1. 将培养的细胞分为实验组和对照组。
实验组是要进行细胞凋亡诱导的组，而对照组则用于对比分析。
2. 选择适当的方法诱导细胞凋亡，例如化学诱导剂（如某种药物）或物理刺激（如辐射）。
3. 根据实验需要，在指定的时间间隔内观察细胞凋亡的现象和变化。
步骤三：检测细胞凋亡
1. 使用合适的细胞凋亡检测方法，如细胞染色和流式细胞术。
这些方法可用于分析各种细胞凋亡标志物的表达。
2. 准备相应的染色试剂或抗体，并按照说明溶解或稀释。
3. 按照实验需求，将细胞标本与染色试剂或抗体共孵育，并进行相应的分析和读数。
步骤四：数据分析与结果
1. 对实验和对照组的数据进行统计学分析，如均值和标准差计算。
2. 进一步分析和解释实验结果，评估细胞凋亡发生的程度和影响因素。
3. 根据实验结果撰写实验报告，包括方法、结果和结论，并进行讨论和对比分析。
以上是细胞凋亡实验的详细步骤及说明。
通过进行这些实验，
我们可以更好地理解细胞凋亡的机制以及可能对其产生影响的因素。
请根据具体实验的要求和细胞类型的特点，调整实验步骤和方法，
并确保实验过程中的安全性和可重复性。
细胞凋亡的诱导和调控
细胞凋亡的诱导和调控细胞凋亡是一种程序化死亡，它在生殖、发育和人体健康中发挥着重要的作用。
细胞凋亡是一个高度调控的细胞过程，凋亡的过程可以被不同的信号诱导和调控。
在这篇文章中，我们将讨论细胞凋亡的诱导和调控机制。
一、细胞凋亡的诱导细胞凋亡的诱导通常是由内源性或外源性信号引起。
其中内源性信号包括DNA损伤、细胞周期调节紊乱和生物化学异常等。
而外源性信号包括神经递质、药物、放射线和细胞因子等。
1.DNA损伤的诱导DNA损伤是诱导细胞凋亡最常见的内源性信号。
DNA损伤会导致一系列信号通路的激活，如P53、P63和P73等。
这些蛋白质可以直接或间接诱导凋亡。
2.细胞周期调节的紊乱细胞周期调节的紊乱也会导致细胞凋亡的发生。
在生长过程中，许多基因和蛋白质都起到了调节细胞周期的作用。
这些基因和蛋白质中只要有一个出现异常，都可能导致细胞周期失控和细胞凋亡的诱导。
3.外源性信号的诱导外源性信号包括生物或非生物的刺激，例如细胞因子和放射线等。
这些信号通常会引起一系列反应，包括激活损伤信号、调节转录因子和调节各种基因表达等。
二、细胞凋亡的调控细胞凋亡的发生需要经过一系列的调控过程，包括激活和执行期等。
1.激活期激活期是指一个系列的信号通路被激活，从而导致细胞凋亡。
这个主要涉及到两个关键的蛋白质家族，即Bcl-2家族和Caspase 家族。
Bcl-2家族中的Bax和Bak蛋白质是促凋亡蛋白，当它们被激活后，会导致线粒体外膜的破损，释放出Cytochrome c，激活Caspase蛋白质，引起一个连锁反应。
2.执行期执行期是指启动了Caspase后，引起了DNA和蛋白质的降解，最终导致细胞死亡。
Caspase蛋白质能够切割或活化多种蛋白质，特别是可以分解凋亡的抑制因子XIAP（X-linked inhibitor of apoptosis protein），释放出存在于细胞内的活性Caspase，最终导致DNA和蛋白质的降解和细胞死亡。
细胞凋亡的诱导及检测
细胞凋亡的诱导及检测一、实验目的1、了解细胞凋亡的诱导及检测。
2、了解细胞凋亡的机制及生物学意义。
二、实验原理细胞凋亡过程不同于坏死性死亡，其染色质断裂，细胞核破裂成裂片，细胞质浓缩，细胞体积变小，细胞膜内折，整个细胞通过起跑和发芽的方式形成一些大小不等凋亡小体，并逐渐被细胞周围的吞噬细胞吞噬。
在整个凋亡过程中，线粒体基本保持完好，细胞的内容物没有泄露，不会引起周围组织的炎症反应，凋亡的细胞核的核DNA 的断裂发生在核小体之间，因此产生的断裂DNA在电泳是会呈180至200dp整数倍大小的阶梯状条带，这是识别凋亡细胞的可靠生化特征，能诱导细胞凋亡的方法很多，在这里采用H202诱导细胞凋亡。
细胞凋亡的检测方法也很多，而形态学的观察方法更为方便，1、吖啶橙只进入活细胞，正常细胞及处于凋亡早期的细胞，从而将细胞染成绿色而嗅化乙啶（EB）只进入死细胞，凋亡的细胞核染成橙红色，2、是一种荧光染料他可以与DNA双螺旋凹槽部分结合，可在紫外线下激发蓝光也可以用于观察凋亡的细胞。
三、实验材料1、酿酒酵母，2、荧光显微镜，3、8.8mol/LH2O2，4、AO/EB的PBS溶液5、酿酒酵母培养基，6、DAPI溶液台盼蓝四、实验步骤1、使用马铃薯培养基恒温30摄氏度，在振荡条件下培养24h再用3500rpm×10min 除去上清液，再用去离水洗涤，沉淀即湿菌体。
2、取上述酵母湿菌体，加双氧水2ml，在室温下缓慢振荡24h后加入乙醇，室温固定10min。
3、去掉乙醇，用PBS洗净。
4、染色DAPI染色法，加入500ml的PBS和50ul的DAPI的母液染色约10min置显微镜下观察。
AO/ EB染色法：取25ml上述悬浮细胞于载玻片上加入AO/ EB混合液，再从中取10ml 于载玻片上加一滴台盼蓝，染色5至10min，盖上盖玻片，放在荧光显微镜下观察。
五、实验结果DAPI：有的细胞染色均匀且表面光滑为正常细胞，有的细胞染色不均表面不光滑，核轮廓不规则，这是凋亡前期的细胞，有的细胞核固缩染色体凝聚边缘化，为凋亡中期细胞有的细胞崩解成碎片可看见颗粒状碎片，这是凋亡后期碎片。
08 细胞凋亡的诱导及观察
山东大学实验报告2018年5月28日________________________________________ _________________________姓名：丁志康系年级：2016级组别：周一下午科目：细胞生物学实验题目：细胞凋亡的诱导及观察学号：201600140055一、实验目的1.学习细胞凋亡的简史、概念和原理。
2.了解细胞凋亡的检测方法。
3.掌握诱导和形态学观察动植物细胞凋亡的基本方法。
二、实验原理1．细胞凋亡细胞凋亡（apoptosis）指为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序的死亡，也称细胞程序性死亡。
细胞凋亡与细胞坏死不同，细胞凋亡不是一件被动的过程，而是主动过程，它涉及一系列基因的激活、表达以及调控等的作用，它并不是病理条件下，自体损伤的一种现象，而是为更好地适应生存环境而主动争取的一种死亡过程。
2．细胞凋亡的生理意义1)维持生物体内环境的稳定；2)参与防御反应；3)胚胎发育过程中清除一些细胞。
3．细胞凋亡的检测方法●细胞凋亡的形态学检测●磷脂酰丝氨酸外翻分析（Annexin V法）●线粒体膜势能的（△Ψmt）检测●DNA片段化检测●TUNEL法●Caspase-3活性的检测●WB检测●凋亡相关蛋白的表达和细胞定位分析4．细胞凋亡的形态学检测未染色细胞：凋亡细胞的体积变小、变形，细胞膜完整但出现发泡现象，细胞凋亡晚期可见凋亡小体。
贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落。
染色细胞：常用姬姆萨染色、瑞氏染色等。
凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化，核膜破裂、染色质分割成块状和凋亡小体等典型的凋亡形态。
5．细胞凋亡的诱导因素➢物理因素：射线、热休克、冷激等。
➢化学因素：重金属离子、激素、毒素、活性氧、一氧化氮等。
➢生物因素：病毒、细菌、肿瘤坏死因子、抗肿瘤药物、DNA和蛋白质合成抑制剂等。
6．细胞坏死细胞坏死（necrosis）被认为是因病理而产生的被动死亡，如物理性或化学性的损害因子及缺氧与营养不良等均导致细胞坏死。
细胞凋亡的诱导与检测
•
• 荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜
• 一般以细胞核染色质的形态学改变来评判细胞凋亡的进展情况。常用 的DNA特异性染料有：HO ,Hoechst 33342;HO, Hoechst 33258; DAPI。
• 电子显微镜观察
(扫描电镜) 正常细胞
(扫描电镜)
(透射电镜)
凋亡细胞—凋亡小体 凋亡细胞 凋亡小体
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细胞凋亡诱导及检测
1.概述 2.细胞凋亡的过程与机制 3.凋亡与坏死的区别 4.细胞凋亡生物学意义 5.细胞凋亡的诱导及检测
细胞凋亡
细胞凋亡是指细胞在一定的生理或 病理条件下，受内在遗传机制的控 制自动结束生命的过程。
• 概述
悉尼· 悉尼·布雷诺尔
罗伯特· 罗伯特·霍维茨
约翰· 约翰·苏尔斯顿
增殖细胞群中细胞去除、去除潜在有害的自身反应性淋巴细胞
■参与防御反应
细胞毒T 细胞毒T细胞
凋亡过多或不足→→疾病： 肿瘤、艾滋病、神经变性性疾病、缺血性损伤
细 胞 凋 亡
1、细胞凋亡的形态学检测 、
• 光学显微镜和倒置显微镜
未染色细胞：凋亡细胞V变小、变形，细胞膜完整但出现发泡现象， 晚期可见凋亡小体。 • 染色细胞：常用姬姆萨染色、瑞氏染色、苏木精染色等。凋亡细胞的 染色质浓缩、边缘化，呈新月状附在核膜周围。
七.注意事项：
1.由于荧光会发生淬灭，加入DAPI染色后要尽 量避光 操作，在显微镜下操作时，先用可见光 找到细胞再转换到紫外光，因为紫外光对荧光的 淬灭效果比可见 光强很多。 2.实验要求阴性对照，不然说明不了问题。 3.每一个步骤都要PBS溶液洗掉上一步的试剂， 避免 影响下一步。 4.EB为强染色剂，使用实应高度注意。 5.在显微镜下观察时候要操作迅速因为细胞会 变干而发生改变。
凋亡细胞的诱导与形态观察
凋亡细胞的诱导与形态观察实验目的1.熟悉普通光镜下凋亡细胞的形态变化2.了解一些诱导细胞凋亡的实验方法实验原理细胞凋亡(apoptosis)是细胞受到内、外因子刺激后发生的由基因调控的生理性死亡行为,是一个主动和高度有序的过程。
细胞凋亡对生物体的生长发育有着重要的作用。
近年来,它已成为生命科学的热点研究领域,并取得许多突破性进展。
细胞凋亡的研究最早始于对动物的研究。
植物细胞由于覆有细胞壁,难于操作与检测。
因此,凋亡研究相对起步较晚。
现在许多研究证明,植物中也普遍存在凋亡现象,如植物正常生长发育过程(胚的发育,导管筛管的形成,根、茎、叶的发育等) ,对环境的胁迫反应,及被病原体侵入引起的超敏反应( hypersensitive response ,HR)中等。
实验用品1.仪器和用具：普通光学显微镜、刀片、镊子、载玻片、盖玻片、离心管。
2.材料：洋葱3.试剂：（1）1mol/L Cacl2，2mol/L Cacl2，5mol/L Cacl2，8mol/L Cacl2，10mol/L Cacl2(2)改良本分品红染色液：A液：取3.0g碱性品红溶于100ml 70%酒精中，此液可于4℃长期保存。
B液：取A液10ml加入90ml 5%苯酚水溶液中（两周内使用）。
C液：取B液55ml，加入6ml 冰醋酸和6ml 38%的甲醛（可长期使用）。
取C液10ml，加入90ml 45%醋酸和1.5g山梨醇。
山梨醇为助渗剂，兼有稳定染色液的作用。
防止两周后使用，染色效果更好，可普遍用于植物组织的压片法和涂片法。
使用2~3年不变质。
实验方法和步骤（1）处理液的准备：第一组：2ml去离子水。
第二组：2ml去离子水+1ml 1mol/LCacl2。
第三组：2ml去离子水+1ml 2mol/L Cacl2。
第四组：2ml去离子水+1ml 5mol/L Cacl2。
第五组：2ml去离子水+1ml 8mol/L Cacl2。
第六组:2ml去离子水+1ml 10mol/L Cacl2。
细胞生物学实验习题
细胞生物学实验习题实验一利用各种显微镜观察细胞形态、结构1.简述显微镜的主要结构和操作要领。
2.分析在使用低倍镜、高倍镜和油镜时，对光亮度的要求。
3.分析聚光镜在成像质量中的作用。
实验二显微摄影1.要想得到一张完美的显微摄影照片，应注意哪些方面的问题，主要关键是什么2.结合数码互动显微镜摄影操作，写出操作工程、拍摄关键点以及注意事项。
实验三细胞的亚显微结构观察1.比较光镜与电镜工作原理的区别。
2.分析扫描电镜与透射电镜的主要异同点。
实验四细胞膜的渗透性1.讨论溶血实验在研究中应用的可能性。
实验五动物细胞培养及其生长特性的观察分析1.哪些物品适合于高压灭菌，并说明理由。
2.紫外线消毒的适用范围和目的是什么3.血清在细胞培养中有何作用4.为什么配制培养基之前要反复处理配制用水并要事先高压处理5.配制培养基时调节pH值的目的是什么6.细胞传代培养的目的是什么7.贴壁细胞和悬浮细胞传代方法上有什么不同8.如何防止传代过程中不被微生物污染9.悬浮细胞和贴壁细胞在计数时有何不同10.讨论细胞存活率在研究中的应用和意义。
实验六细胞器的分离与观察1. 线粒体提取分离过程中，为什么要在0～4℃进行2. 将线粒体沉淀作一涂片，用姬姆萨染色，检查是否混杂细胞核和胞质碎片，估计分离所得线粒体的纯度。
要获得高活性的线粒体，在线粒体提取、分离和活性鉴定的过程中需注意哪些问题根据你的实际体会，写出操作注意事项及改进方法。
3. 分离介质L 及L 缓冲蔗糖溶液哪一种在下层有什么作用实验七细胞骨架的观察1.微丝观察实验中，1% Triton X -100 处理细胞的作用是什么2.微丝观察实验（考马斯亮蓝R 250 染色法观察微丝）中，是否能看到微管、中间纤维为什么3.M –缓冲液的作用是什么4.说明细胞中由微丝组成的结构及其功能。
实验八细胞凋亡的诱导和细胞凋亡的形态特征的观察1.总结凋亡细胞的形态特征。
2.试述本实验鉴别凋亡细胞、坏死细胞核正常细胞的原理。
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（2）高浓度盐Ca2+的处理：
100nmol/L或500nmol/L的CaCl2或NaCl处理洋葱 内表皮8h左右； 48h后用改良苯酚品红染液染 色30min，清洗；镜检。
三、材料和试剂
材料：人类淋巴细胞株、洋葱内表皮 试剂：100μmol/L cyt c的水溶液、 100nmol/L或500nmol/L的CaCl2、改良苯 酚品红染液
四、实验方法与步骤
1.取样
（1）人类淋巴细胞株的培养
（2）直接撕取洋葱内表皮细胞
2.细胞调亡的诱导 （1） cyt c处理： 共做三组样品。试验组样品要先经cyt c处 理，浓度为12.5 μmol/L，时间控制在48h左右； 正对照样品不需要处理，为正常生长的细胞； 负对照样品是将正常细胞煮沸10min，使其坏死。
五、 实验结果
形态学变化 调亡率统计
四、实验报告
设计一个刺激诱导PCD的实验。
（3）不同机械刺激的处理（温和）：
冷激、热激、振荡等
3.形态学观察 在显微镜下观察细胞形态变化，比较和描述不同调
亡诱导，诱导细胞调亡形态变化的异同点并对试验
组细胞进行调亡率统计。
计算调亡率＝（调亡细胞数/总细胞数）×100％。
在光学显微镜下照相（数码互动显微镜）。
4.DNA电泳（梯状DNA）
实验八 细胞凋亡的诱导和细胞凋亡的 形态特征的观察
一、实验目的
了解细胞调亡的原理；
掌握用于细胞调亡检测的常规方法。
二、实验原理
细胞死亡作为生物体的一种常见现象，一般可 分为两种类型：细胞坏死和细胞程序性死亡 （PCD），也称细胞调亡。 细胞程序性死亡分为两类：受体介导的细胞程 序性死亡和线粒体介导的细胞程序性死亡。 调亡细胞的形态学观察：HE染色、Giemsa染色、 台盼蓝染色、改良苯酚品红染色；细胞调亡生 化特征的检测：DNA电泳、细胞膜磷脂酰丝荧光 显示、调亡细胞原位末端标记法。