免疫组化-概论抗原抗体
免疫组化
什么是免疫组化免疫组化是应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学技术(immunohistochemistry)或免疫细胞化学技术(immunocytochemistry)。
免疫组织化学技术按照标记物的种类可分为免疫荧光法、免疫酶法、免疫铁蛋白法、免疫金法及放射免疫自影法等。
（一）免疫组织化学技术的基本原理免疫组织化学技术是用显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项技术。
即先将组织或细胞中的某些化学物质提取出来，以其作为抗原或半抗原去免疫小鼠等实验动物，制备特异性抗体，再用这种抗体（第一抗体）作为抗原去免疫动物制备第二抗体，并用某种酶（常用辣根过氧化物酶）或生物素等处理后再与前述抗原成分结合，将抗原放大，由于抗体与抗原结合后形成的免疫复合物是无色的，因此，还必须借助于组织化学方法将抗原抗体反应部位显示出来（常用显色剂DAB显示为棕黄色颗粒）。
通过抗原抗体反应及呈色反应，显示细胞或组织中的化学成分，在显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞或组织原位确定某些化学成分的分布、含量。
组织或细胞中凡是能作抗原或半抗原的物质，如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测。
免疫学的基本原理决定了免疫组织化学技术具有高度特异性，因此，免疫组织化学技术从理论上讲也是组织细胞中抗原的特定显示，如角蛋白（keratin）显示上皮成分，LCA显示淋巴细胞成分。
只有当组织细胞中存在交叉抗原时才会出现交叉反应。
ABC法或SP法的出现，使抗体稀释上千倍、上万倍甚至上亿倍仍可在组织细胞中与抗原结合，所以免疫组织化学技术又具有敏感性高的特点。
免疫组化技术
免疫组化技术免疫组化技术是一种广泛应用于生物医学研究和临床诊断中的重要技术手段。
它通过利用抗体与其特异性抗原相互作用的特性，实现对细胞、组织和分子的检测和定位。
本文将从免疫组化技术的原理、应用、优缺点等方面进行介绍。
首先，免疫组化技术的原理主要基于抗原与抗体的高度特异性反应。
抗原一般是指能够被免疫系统识别并引发抗体产生的物质，它可以是细胞膜上的蛋白质、细胞核中的核酸、胞浆中的酶等。
而抗体是机体免疫系统产生的一类蛋白质，具有高度特异性与抗原结合。
在免疫组化技术中，通常选择一种与目标物高度特异性结合的抗体，通过与目标物反应形成抗原-抗体复合物，再利用染色、荧光等方法对其进行检测和定位。
免疫组化技术广泛应用于生物医学研究和临床诊断中。
首先，在生物医学研究领域，免疫组化技术可以用于检测和定位特定蛋白质或细胞标志物。
例如，科研人员可以利用特异性抗体对肿瘤标志物进行检测，从而实现早期肿瘤的筛查和诊断。
此外，免疫组化技术还可以用于研究免疫反应、细胞分化和分子信号传递等生物学过程。
其次，在临床诊断中，免疫组化技术可用于肿瘤诊断、感染病的检测和诊断，以及免疫性疾病的诊断等。
临床医生可以利用免疫组化技术对病理切片进行染色，帮助判断疾病类型和严重程度。
免疫组化技术具有多种优点。
首先，它具有高度特异性和敏感性。
由于抗体与特定抗原的结合是高度特异性的，因此免疫组化技术可以实现对目标物的准确检测和定位。
其次，它可以同时对多个目标进行检测。
通过同时使用多个不同特异性的抗体，可以对多个目标分子进行检测，从而提高检测效率。
此外，免疫组化技术还可以实现对细胞或组织的形态学和功能的研究，有助于揭示生物学过程的机制。
然而，免疫组化技术也存在一些限制和不足之处。
首先，技术操作复杂。
免疫组化技术需要对抗体的选择、染色剂的选择和实验条件等进行严格控制，技术操作要求较高。
其次，需要合适的阳性和阴性对照。
在使用免疫组化技术时，需要合适的阳性和阴性对照样品，以确保实验结果的准确性和可靠性。
免疫组化的原理与操作
肿瘤分类
01
通过检测肿瘤组织中特定抗原的表达，有助于判断肿瘤的性质
和来源，为肿瘤的分类提供依据。
预后评估
02
免疫组化检测肿瘤细胞增殖、侵袭和转移相关的分子标志物，
有助于评估患者的预后和制定治疗方案。
靶向治疗
03
针对特定肿瘤相关抗原的免疫组化检测，有助于发现潜在的靶
点，为靶向治疗提供指导。
在感染性疾病诊断中的应用
病原体检测
通过检测感染组织中特定病原体的抗原或抗体，有助于确诊感染 性疾病的病因。
鉴别诊断
对于临床表现相似的感染性疾病，免疫组化检测有助于鉴别诊断， 为临床治疗提供依据。
流行病学调查
对感染性疾病的免疫组化检测结果进行分析，有助于了解疾病的 流行病学特征和传播途径。
在自身免疫性疾病诊断中的应用
自身抗体检测
控制显色反应的条件，避免背景染色和假阳性结果。
实验后的质量控制
1 2
结果判读
建立标准化的结果判读方法，确保结果的一致性 和可重复性。
室内质控
定期进行室内质控，评估实验的稳定性和可靠性。
3
室间质评
参与实验室间的质评活动，提高实验结果的可靠 性。
05
免疫组化在临床病理诊断中的应用
在肿瘤诊断中的应用
02
抗体选择与实验设计
抗体来源与特性
01
02
03
抗体来源
免疫组化抗体主要来源于 动物免疫系统，如小鼠、 兔、羊等，通过注射抗原 产生特异性抗体。
抗体特性
抗体具有高度的特异性， 能够识别并结合特定的抗 原，用于标记和定位组织 中的目标分子。
抗体纯度
高质量的抗体应具有高纯 度，低交叉反应性和低非 特异性结合，以提高实验 的准确性和可靠性。
免疫组化总结
免疫组化总结免疫组化定义用标记的特异性抗体对组织切片或细胞标本中某些化学成分的分布和含量进行组织和细胞原位定性、定位或定量研究，这种技术称为免疫组织化学( immunohistochemistry )技术或免疫细胞化学( immunocytochemistry )技术。
原理免疫组织化学染色方法的原理抗原( antigen)1. 定义：是一类在适合条件下能激发机体免疫系统发生免疫应答，并能与免疫应答产生的效应物质(抗体和效应细胞)在体内或体外发生特异性结合反应的物质。
抗原具有两种性能：(1)免疫原性(immunogenicity)指抗原分子具有诱导机体产生免疫应答的特性。
(2)反应原性(reactogenicity)指抗原分子与抗体或效应T细胞等免疫应答产物发生特异性反应的特性。
2. 抗原的分类 -- 完全抗原、半抗原免疫学分类胸腺依赖抗原与非依赖抗原外源性抗原：微生物、花粉等内源性抗原：隐蔽的自身抗原、肿瘤相关抗原等临床分类同种异型抗原：人类白细胞抗原、血型抗原异嗜性抗原：人与其他动物、植物等之间存在的共同抗原抗体( antibody)1. 定义：机体受到抗原刺激后，通过体液免疫应答，B 淋巴细胞活化、增殖，分化为浆细胞，由浆细胞合成并分泌的仅与该抗原发生特异性反应的球蛋白，称为抗体。
大部分抗体电泳后位于丫区带，1972年国际免疫学联合会正式将化学结构相同或相似的一类球蛋白分子统一命名为免疫球蛋白(immunoglobin，Ig)。
2. 抗体的种类：五类，即IgA、IgD、IgE、IgG、IgM。
免疫组织化学染色技术中，使用的抗体主要是IgG,个别情况下使用IgG的亚型，多为lgG1。
免疫组织化学染色的反应原理染色反应的最基本原理是抗原抗体的反应。
通过对针对标本中相应抗原的抗体上标记某种发色剂或酶类，再通过激发发色剂或使用某种显色剂，在显微镜下使标本中抗原抗体反应的部位产生肉眼可观察到的颜色以确定所要检测的抗原是否存在。
免疫组化原理及应用
象PAP法那样由抗酶血清制备而成，所以背景着色减少，
敏感性更高。
HRP HRP
ABC法：
HRP biotin
ABC复合物 马抗兔（二抗）
兔抗x（一抗）
⑥S-P法：是在ABC法的基础上进行了改进，第一、第二步
与ABC法相同，在第三步，将链酶卵白素直接与酶耦合在
一起，减少了操作步骤，进一步增加了灵敏度，现被广泛
应用。
HRP
HRP
S-P法：
SA
酶链卵白素
HRP
BT
羊抗鼠IgG（二抗）
BT 鼠抗x（一抗）
（三）具体操作步骤
以S-P法为例：
1. 石蜡切片脱蜡至水；
2. 蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟，（如需采用抗原修复，可 在此步后进行）；
3. 3活%性H；2O2室温孵育5-10分钟，以消除内源性过氧化物酶的
4. 5-10%正常山羊血清（PBS稀释）封闭，室温孵育10分钟。 倾去血清勿洗，滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液， 37℃孵育1-2小时或 4 ℃过夜；
HRP HRP
PAP法：
HRP
兔PAP复合物（三抗）
羊抗兔IgG （二抗）
兔抗 x
（一抗）
⑤ABC法：很早以前，人们就注意到给动物饲以大量的鸡蛋
白，会引起明显的“维生素H缺乏症”。经研究发现，在
鸡蛋白中含有一种碱性蛋白，分子量为68000，称卵白素
（avidin）。一个avidin分子上有4个biotin（生物素）结合
—HRP(FITC)
直接法：
②间接法：也称二步法。第一步用的是不标记的第一抗体， 第二步用标记有酶或荧光素的抗第一抗体同种动物IgG的 抗体。本方法的优点是在检测各种不同抗原时，只要第一 抗体是免疫同一类动物产物的抗体，均可应用相同的第二 抗体，不象直接法那样需对各种抗体逐个标记。此外由于 第一抗体的一个分子作为抗原可结合多个第二抗体分子， 故敏感性较直接法大为提高。
免疫组化原理和步骤
免疫组化原理和步骤免疫组化（Immunohistochemistry，IHC）是一种广泛应用于组织学和细胞学研究中的实验方法，主要用于检测和定位蛋白质在组织或细胞中的分布和表达水平。
它结合了免疫学原理和组织学技术，通过使用特异性的抗体和染色剂来实现对目标蛋白质的检测和可视化。
免疫组化的原理主要是利用抗体的高度特异性与抗原相结合，然后使用染色技术来显示抗原的位置。
该技术的基本原理可分为抗原-抗体反应、信号放大和信号显示三个步骤。
第一步：抗原-抗体反应免疫组化的第一步是选择合适的抗体，通过与目标蛋白质的特异性结合来形成抗原-抗体复合物。
抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。
单克隆抗体具有高度特异性，只能结合到特定的抗原上。
多克隆抗体具有高度敏感性，可以结合多个位点，从而实现信号放大。
通常，为了提高抗原的可检测性，需要对组织样本进行抗原修复处理。
这可以通过热处理（如蒸汽加热、微波加热）或酶切处理来实现。
修复可以解除组织样本中抗原与蛋白质结构之间的交联，增加抗体的渗透性和可结合性。
当抗原-抗体反应发生时，可通过一系列化学反应来形成抗原-抗体复合物。
例如，可以使用二抗来与抗原-抗体复合物结合，然后使用辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AP）标记的二抗来与二抗结合。
该反应可形成稳定的抗体-酶复合物。
第二步：信号放大由于抗原-抗体复合物的信号很弱，通常需要进行信号放大以便更好地检测到目标蛋白质。
放大信号的方法有很多种，其中最常用的是酶免疫标记联合酶放大技术。
酶免疫标记是通过将抗体与酶结合，使其能够催化特定的化学反应来产生荧光、色素或光学信号。
常用的酶免疫标记包括辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（AP）。
这些酶能够催化荧光素、二苯基胺、硝基蓝等底物的氧化还原反应，从而产生可视化的信号。
酶放大技术常用的方法包括：免疫酶化学法（如DAB法）、免疫荧光法和免疫酶学荧光混合法等。
这些方法可通过将底物转化为可见的色素或荧光信号来标记抗原-抗体复合物，从而实现目标蛋白质的检测和定位。
免疫组化是什么意思
免疫组化是什么意思免疫组化是一种常用于分析生物组织或细胞的实验技术，通过使用特定的抗体和染色试剂，可以检测和定位特定的蛋白质或分子在组织或细胞中的表达情况。
在医学、生物学和生物医学研究领域，免疫组化技术被广泛应用于诊断疾病、研究细胞生物学过程以及评估药物的疗效。
免疫组化的原理基于免疫学的核心概念，即抗原与抗体的特异性互相结合。
抗原是指能够诱导免疫系统产生抗体的分子，而抗体则是由免疫系统产生的特异性蛋白质，可以与抗原结合形成稳定的复合物。
免疫组化利用这一原理，使用特异性抗体与待检测的蛋白质结合，然后通过染色试剂的辅助作用，使该蛋白质在组织或细胞中形成可见的沉积物。
在实际操作中，免疫组化通常需要以下步骤：取得待检测的生物组织或细胞样品，首先进行固定和切片处理，以保持样品的形态结构。
然后将切片进行抗原修复处理，以恢复组织中蛋白质的三维结构，增强抗体与抗原的结合效果。
接下来，样品与特定的抗体进行孵育，抗体与待检测的蛋白质结合。
为了可视化抗原抗体复合物，通过染色试剂的作用，使抗原抗体复合物形成可见的染色沉积物。
染色沉积物的颜色和位置可以反映出目标蛋白质在组织或细胞中的表达情况。
通过免疫组化技术，研究人员可以获得目标蛋白质在组织或细胞中的空间分布信息。
例如，在肿瘤研究中，免疫组化技术可以检测癌细胞中增殖标记物的表达情况，帮助判断肿瘤的恶性程度以及预测患者的预后。
此外，免疫组化还可以用于研究细胞信号传导通路、免疫反应以及发育过程中关键分子的定位和表达。
然而，免疫组化技术也存在一些限制和挑战。
首先，由于不同抗体的特异性和亲和力可能存在差异，需要进行严格的抗体验证，确保其特异性和可靠性。
其次，免疫组化的结果通常是主观的，需要经验丰富的操作人员进行解读和分析。
此外，由于样品处理和染色过程中多个步骤的影响，免疫组化结果的重现性可能受到影响。
随着技术的发展和进步，免疫组化技术也不断更新和改进。
例如，引入了自动化设备和图像分析软件，可以提高实验的效率和结果的准确性。
免疫组化的原理
免疫组化的原理免疫组化是一种用来检测组织中特定蛋白质或抗原的方法。
它主要通过特异性抗体与组织中的抗原结合，然后利用染色或其他方法来显示这种结合。
免疫组化在医学诊断、病理学研究、生物医学研究等领域有着广泛的应用。
免疫组化的原理主要包括抗原-抗体反应、信号放大和结果显示三个方面。
首先，抗原-抗体反应是免疫组化的核心原理。
抗原是指能够被免疫系统识别并产生抗体应答的物质，通常是蛋白质或多肽。
而抗体则是免疫系统产生的一种特异性蛋白质，能够与特定抗原结合。
在免疫组化中，我们首先需要选择特异性抗体，使其与我们要检测的抗原发生特异性结合。
这种抗原-抗体反应是免疫组化的基础，也是其能够检测特定蛋白质的关键。
其次，信号放大是免疫组化的重要环节。
由于组织中的抗原含量往往很低，为了能够准确检测到这些抗原，我们通常需要进行信号放大。
常用的信号放大方法包括酶标记、荧光标记等。
通过这些方法，我们可以将抗原-抗体反应产生的信号放大数倍甚至数十倍，从而提高检测的灵敏度和准确性。
最后，结果显示是免疫组化的最终步骤。
在免疫组化中，我们需要将抗原-抗体反应和信号放大的结果显示出来，通常采用染色、荧光显微镜等方法。
通过这些方法，我们可以直观地看到组织中特定蛋白质的位置和分布情况，从而对组织的特定病理变化进行定量和定性的分析。
总的来说，免疫组化的原理主要包括抗原-抗体反应、信号放大和结果显示三个方面。
通过这些步骤，我们可以准确地检测组织中特定蛋白质的存在和分布情况，为医学诊断和病理学研究提供重要的信息和依据。
免疫组化技术的不断发展和完善，将进一步推动医学和生物医学领域的发展，为人类健康事业做出更大的贡献。