苏大分子生物学第七章

㈠ 核酸酶Sl保护分析法(nuclease Sl protection assay)
用标记的基因组DNA作为探针，在适宜条件下与 待测RNA进行液相杂交，DNA外显子区可与mRNA 形成DNA:RNA杂交体，而DNA的其余部分(内含子等) 仍为单链，核酸酶S1可专一地降解未形成杂交体的 DNA单链，而与RNA杂交的DNA区则受到保护不被 降解。通过聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶电泳分析消化产 物，即可确定不被降解的DNA片段大小，用目的基因 不同区段的DNA进行杂交，可确定mRNA的3′、5′端 以及内含子的精确定位等，通过杂交条带的光密度扫 描还可进行定量分析(图7-14,15)。
固相杂交包括膜上印迹杂交和细胞原位杂交两类。 固相杂交是印迹技术及杂交信号检测技术等相结合， 从而获得清晰的杂交图谱，有利于定性或定量分析待 测核酸样品中的特定片段(靶序列)，在核酸的结构和 功能研究以及基因工程研究中，其应用比液相杂交更 为广泛，其技术发展也更为迅速。 一、膜上印迹杂交 膜上印迹杂交是指将待测核酸序列结合到一定的 支持物上，然后与存在于液相中的核酸探针进行杂交 的过程，是目前最常用的一种核酸分子杂交方法。
㈢ 放射自显影检测杂交信号
利用放射线在X线片的成影作用来检测杂交信号，称 为放射自显影。这种方法的操作步骤如下： (1) 将滤膜用保鲜膜包好，置于暗盒中。 (2) 在暗室中，将磷钨酸钙增感屏前屏置滤膜上，光 面向上，压1~2张X线片，而后再压上增感屏后屏， 光面向X线片，盖上暗盒，置于70℃，曝光适当的时 间。
第二节 核酸探针
核酸探针是指带有放射性同位素、生物素或其他 活性物质标记的某种特定的DNA或RNA片段。 一、核酸探针的类型 ㈠ 基因组DNA探针
用克隆化的基因片段作探针应尽可能选用基因的编 码序列(外显子Байду номын сангаас。 ㈡ cDNA探针
与mRNA互补的DNA链称cDNA，特异性高，是 一种较理想的核酸探针。
⒉显色反应：通过连接在抗体或抗生物素蛋白上的显色物质 (如酶、荧光素等)进行杂交信号的检测。碱性磷酸酶可使其底 物BCIP脱磷并聚合，在此过程中释放出的氢可使NBT (四氮唑 蓝)还原而形成紫色的化合物(图7-7)。
第三节 核酸分子杂交技术
在液体中进行杂交反应称为液相杂交；在固相支持 物上进行杂交则称为固相杂交。
第七章
核酸分子杂交
核酸分子杂交是指具有一定同源序列的两条核酸 单链在一定条件下按碱基互补配对原则退火形成异 质双链的过程, 即来源不同的两条单链核酸分子通过 碱基互补可形成异源双螺旋，称为核酸分子杂交 (hybridization)。具有灵敏度高、特异性强等优点， 主要用于特异DNA或RNA的定性、定量检测。
(2) 离子强度 高离子强度溶液中，其正离子可中和DNA链磷酸 基团的负电荷，消除其间的静电斥力，有利于杂交分 子的形成。 (3) 温度 通常杂交温度在低于Tm 20~25℃温度下进行。不 含变性剂甲酰胺时，大多数杂交反应在68℃进行。当 含50%甲酰胺时，在42℃进行。 寡核苷酸探针一般在低于Tm值5℃~10℃下进行。 (4) 杂交促进剂 用硫酸葡聚糖，其微粒的表面可以吸附DNA探针 分子，使接触面积增大，有利于杂交反应。
非放射性同位素标记的探针，除酶直接标记探针外， 其它非放射性标记物并不能被直接检测，需先将非放 射性标记物与检测系统偶联，再显色。 ⒈偶联反应：大多数非放射性标记物是半抗原(如地高 辛)，因此可以通过抗原抗体反应系统与显色体系偶联： Dig-DNA探针+抗Dig抗体-碱性磷酸酶(或辣根过氧化 物酶)+底物(BCIP和NBT)；生物素可与抗生物素蛋白 (卵白素，avidin)或链亲合素(streptavidin)结合，再与 显色体系相偶联。
⒊电转法如图7-11所示。
㈣ 印迹类型
Southern印迹杂交法(Southern blot hybridization)(图 7-12)。
2. Northern印迹杂交(Northern blot hybridization)： Northern杂交是将RNA样品变性和通过琼脂糖 凝胶电泳进行分离，再转移到硝酸纤维素膜等固相 载体上，用标记的DNA或RNA特异探针对固定在膜 上的RNA进行杂交。其基本原理与Southern杂交相 同，只不过变性方法不能采用碱变性法，因为碱导 致RNA水解，一般采用聚乙二醛和二甲基亚砜、甲 醛、甲基氢氧化汞等变性方法。
㈢ 印迹方法 ⒈虹吸印迹法(图7-9)
利用毛细管的虹吸作用由转移缓冲液带动核酸分 子转移至滤膜上。
⒉真空转移法(图7-10) 其原理是利用真空泵将转移缓冲液从上层容器中 通过凝胶抽到下层真空室中，同时带动核酸分子转 移到凝胶下面的滤膜上。该法的最大优点是快速， 转膜的同时进行DNA的变性和中和，整个过程只需 1h左右。
•第一节 核酸分子杂交的基本原理 •第二节 核酸探针 •第三节 核酸分子杂交技术
第一节
核酸分子杂交的基本原理
DNA和DNA链、RNA与DNA链或两条RNA链之间， 只要具有一定的互补序列均可在适当的条件下发生杂 交。常用已知的DNA或RNA的片段作为探针，包括 特异的DNA序列，或转录的RNA序列或cDNA序列， 或人工合成的寡核苷酸片段。
㈢ RNA探针
RNA探针有下述优点：
①杂交体的稳定性高，杂交反应条件严格，特异性更 高。
②RNA单链不存在双链DNA探针的互补双链的复性， 杂交效率较高。 ③RNA无高度重复序列，非特异杂交少。
④杂交后用RNase消化未杂交的RNA探针，可降低杂 交本底。
㈣ 寡核苷酸探针
寡核苷酸探针是由实验者设计、经核苷酸合成仪人工 合成的。 1.探针制备方便，可以根据需要设非常适用于检测已知序列基因中的点突变或定点诱 变技术产生的点突变。
(2) T4DNA聚合酶标记法。加入dNTP后抑制外切 活性可将标记的dNTP进行填充标记。
(3) T4多核苷酸激酶标记法。用该酶可将-32P从[32P] ATP转移至核酸的5′-OH端 (4) 末端脱氧核苷酸转移酶标记法。将多种标记的 dNTP逐个转移到核酸缺口中的3′-OH端，形成长尾 标记。
平移法适用于标记大于1 kb的双链DNA。
⒉随机引物法(图7-2)
随机引物法的基本原理是DNA聚合酶可利用随机引 物，沿单链模板进行DNA的合成。
⒊末端标记
只将DNA 3′端或5′端标记的方法称末端标记，常用的 方法如下：
(1) DNA聚合酶I Klenow片段末端标记法(图7-3)。用 该酶将含有核素标记的dNTP补平切口或粘性末端。
3.斑点杂交(dot hybridization)：直接将变性DNA样
品点于硝酸纤维素膜上，固定好后先预杂交，再与
标记探针杂交，然后通过高严谨性冲洗(低盐高温)，
降低本底和提高特异性。预杂交和杂交可在密封袋
中进行，密封袋比较方便，反应体积小，可以使用
高浓度探针，封口前去除气泡，使杂交液与膜充分
接触，反应体积以膜不贴壁、能浮动为宜。探针与
三、探针放射性同位素标记法
㈠ 放射性同位素的选择
32P、 35S或 3H均可用于标记DNA或RNA。 32P最常用
于核酸的标记。35S适用于原位杂交和DNA序列测定。
3H放射比活度低，故常用于原位杂交。
㈡ 核酸探针的标记方法
⒈缺口平移法(图7-1) 大肠杆菌DNA聚合酶I具有5′3′DNA聚合酶活性， 以相对应的链为模板，从切口处3′-OH端逐个加入新 的核苷酸，此酶还具有5′3′外切核酸酶活性，可从 切口的5′端逐个切去核苷酸，造成切口平移。若反应 体系中存在一种或多种标记的核苷酸，如[-32P] dNTP，则随着反应的进行，这些标记的核苷酸将置 换原有的核苷酸，制备出核素标记的DNA探针。缺口
2. 光敏生物素标记法：先通过连接臂将一个光敏基 团连接于生物素，成为光敏生物素(photobiotin)， 如图7-5。 ㈡ 半抗原地高辛配基标记方法
将Dig与dUTP(或dCTP，dCTP)相连生成Dig-dUTP 复合物，再通过切口平移法和随机引物法将其掺入 到DNA上(图7-6)。
㈢ 非放射性核酸探针的检测
(3) 根据放射线的强度曝光一定的时间后，在暗室里 取出X线片，显影定影。如曝光不足，可再压片重新 曝光。
㈠ 生物素标记
生物素能以共价结合方式连接到UTP或dUTP的嘧啶 环C5位置上，形成生物素化的核苷酸(图7-4)。
1. 掺入标记法：生物素标记的dNTP可代替相应的 单核苷酸，在DNA聚合酶的作用下，通过随机引物 法或缺口平移法，将生物素化核苷酸掺入到DNA分 子中，获得生物素标记的DNA探针。
同源样品杂交后，阳性结果产生斑点，故称斑点杂
交。
4.反向斑点杂交(reverse dot hybridization)：直接将不 同的探针点印并固定在膜上，再将待测的DNA样品与 之杂交，这样一次杂交反应就可以判断待测DNA是否 含有这些探针的同源序列。
5.菌落或噬菌斑杂交(图7-13)。
二、核酸原位杂交
(4)
与核酸分子的结合稳定牢固，
非特异性吸附少。
(5)
具有良好的机械性能。
下面介绍几种常用的固相支持物：
(1) 硝酸纤维素膜：特别适用于蛋白质(如抗体和酶等) 的非放射性标记探针的杂交体系。 (2) 尼龙膜(nylon membrane)：尼龙膜结合单链及双链 DNA和RNA的能力较硝酸纤维素膜更强，耐碱处理适 合于一步法的菌落原位印迹法。 尼龙膜的缺点是不宜使用非同位素探针，即使用各种 蛋白(如BSA、牛奶等)进行预杂交，产生的杂交信号 本底较高，与非特异吸附有关。 PVDF膜：比尼龙膜结合力更强，且在预杂交中很容 易被封闭，使用同位素和非同位素探针都可产生较浅 的本底，而且结实耐用，可以多次杂交。
二、杂交动力学
杂交过程的第一步是两条核酸单链随机碰撞形成局 部双链，如果此局部双链周围的碱基不配对则会重新 解离，继续碰撞，一旦找到正确的互补区，两侧的序 列迅速配对形成完整的双链分子，后一步反应是一个 自发过程。