试验一酶蛋白的定量测定及纯度检测
酶的纯度检测方法
酶的纯度检测方法一、SDS-PAGE电泳SDS-PAGE电泳是一种常用的蛋白质分析技术，可用于检测酶的纯度和分子量。
其原理是将蛋白样品在聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳分离，利用SDS对蛋白质进行线性变性，使其保持负电荷，根据蛋白质的分子量和电荷，使其在凝胶中以不同速度移动，最终形成不同大小的条带，根据条带的位置可以确定目标蛋白的分子量和纯度。
在实验操作中，首先将待检测的酶样品与SDS-PAGE样品缓冲液混合，然后将混合溶液加热至95℃，使蛋白质变性，接着将样品加载到SDS-PAGE凝胶槽中，开启电源进行电泳分离，最后用染色剂染色并观察结果。
通过比较目标蛋白与其他蛋白的条带位置和强度，可以确定酶的纯度。
二、凝胶过滤层析凝胶过滤层析是一种分子大小排除原理的层析技术，适用于检测酶的分子量和纯度。
其原理是在凝胶柱中，根据蛋白质的大小进行分级排除，较大的蛋白质会快速通过凝胶柱底部，较小的蛋白质会在凝胶柱中受到阻滞，从而实现蛋白质的分离和检测。
在实验操作中，首先将待检测的酶样品加入到凝胶柱中，然后进行层析分离，最后收集各个分离后的蛋白样品，通过比较目标蛋白的峰形和大小与其他蛋白的区分度，确定目标酶的分子量和纯度。
三、亲和层析亲和层析是利用目标蛋白与配体之间的特异亲和性进行分离和检测的一种技术。
在亲和层析中，通常通过牢固地固定配体在固定基质上，然后将目标蛋白与配体结合，再通过洗涤和洗脱等步骤，最终实现目标蛋白的纯化和检测。
在实验操作中，首先在含有配体的固定基质中将待检测的酶样品加入，然后进行洗涤和洗脱过程，最终收集得到目标酶。
通过比较目标酶的产率和纯度与其他蛋白的区分度，可以确定酶的纯度。
四、离子交换层析离子交换层析是利用蛋白质在不同离子强度和pH值下的电荷性质进行分离和检测的技术。
在离子交换层析中，通常通过固定阴离子或阳离子交换基质，再根据待检测的酶的电荷性质，通过调节离子强度和pH值，实现酶的分离和检测。
在实验操作中，首先将待检测的酶样品加入到含有离子交换基质的柱中，然后通过逐步改变离子强度和pH值，逐步洗脱目标酶，并通过收集得到的分离蛋白检测目标酶的产率和纯度。
抗体纯度鉴定的常用方法
抗体纯度鉴定的常用方法抗体纯度鉴定是指确定抗体制备物中所含目标抗原特异性抗体的纯度和杂质的程度。
合理的抗体纯度鉴定方法可以确保实验结果的准确性和可靠性。
本文将介绍抗体纯度鉴定的常用方法，包括蛋白电泳分析、Western blot、ELISA、免疫沉淀和色谱技术等。
1.蛋白电泳分析蛋白电泳是一种常见的蛋白质分离和分析方法，可以用于鉴定抗体制备物中的纯度和杂质。
常用的蛋白电泳包括SDS-PAGE和非变性凝胶电泳。
SDS-PAGE可以将蛋白质按照大小分离，通过比较目标抗原特异性抗体与其他蛋白质之间的差异，可以初步判断抗体制备物中的纯度。
非变性凝胶电泳则可以用于鉴定抗体制备物中是否存在聚集物和降解产物等杂质。
2. Western blotWestern blot是一种常用的蛋白质检测和定量分析方法，可以用于鉴定抗体制备物中的目标抗原特异性抗体的纯度和特异性。
通过将抗体制备物与目标抗原进行免疫印迹分析，可以确定抗体制备物中是否存在非特异性结合和杂交抗体，从而评估其纯度和特异性。
3. ELISAELISA是一种常用的酶联免疫吸附测定方法，可以用于定量测定抗体制备物中特异性抗体的含量，并进一步评估其纯度。
ELISA的原理是利用抗体与其特异性抗原的结合来检测抗体制备物的纯度和含量，通过比较样品与标准曲线的光学密度值，可以确定抗体制备物的纯度和含量。
4.免疫沉淀免疫沉淀是利用抗体和抗原之间的特异性结合来沉淀目标蛋白质的方法，可以用于鉴定抗体制备物中的目标抗原特异性抗体的纯度和特异性。
免疫沉淀可以通过将抗体制备物与目标抗原一起进行沉淀，然后通过蛋白质分析方法，如Western blot或质谱分析，来确定抗体制备物中特异性抗体的纯度和特异性。
5.色谱技术色谱技术是一种常用的分离和纯化蛋白质的方法，可以用于鉴定抗体制备物中的纯度和杂质。
常用的色谱技术包括凝胶过滤色谱、离子交换色谱、亲和层析和逆流层析等。
这些色谱技术可以通过分离、纯化和定量目标抗原特异性抗体，从而评估抗体制备物的纯度和杂质水平。
如何认识蛋白质类药物纯度检测
如何认识蛋白质类药物纯度检测？
1 从蛋白质制剂中检测出少量的污染蛋白质是 很困难的。因为污染蛋白质的量可能低于很多 测定方法的检测下限。制剂中往往含有大量的 辅料。
2 当用一种方法测定蛋白质纯度时，可能有两 种或更多的蛋白质表现出相似的行为。这种类 似的行为可能会导致本来是混合物的样品也被 认为是均一物质的错误结论。
HPLC法应根据不同的纯化工艺选择不同的方法。 一般尽量采用与SDS- PAGE法原理不同的反相柱或其 他离子交换柱进行分析，而不主张用分子筛分析。在 质量标准中要说明采用的是什么性质的分析柱。如有 些产品不适合用反相柱，要说明原因。
1.3 毛细管电泳
毛细管电泳的方法简便、快速，灵敏度和 分辨率高，但价格昂贵，重现性差，尚未作为 常规检定。
与产品相关的杂质包括：
突变物、错误裂解的产品、二硫化物异构体、 二聚体和多聚体；化学修饰的形态：脱去酰氨 基的或氧化的形态、其他降解产物等。
4.1宿主细胞蛋白含量
概念: 宿主细胞蛋白质一般简称宿主蛋白，是指生产过
程中来自宿主或培养基的残留肽等杂质。基因工程 药物中的宿主蛋白含量，可用 ELISA法(enzymelinked immunosorbent assay)测定。
3 只用一种方法作为纯度试验的标准是很不 可靠的，必须选择多种测定纯度的方法。
最好的纯度标准是建立多种分析方法，从 等电点、相对分子质量、疏水性等不同的角度 来证明了蛋白质样品的均一性。
4 纯度最终取决于所用方法的类型和分辨力， 低分辨率方法检测合格的样品改用高分辨力方 法时就有可能证明它是不纯的。
3.3等电点测定 可以表征药物的理化性质和纯度 均一的重组蛋白质只有一个等电点，有时因加工 修饰等影响可出现多个等电点，但应有一定的范 围。所以等电点测定是控制重组产品生产工艺稳 定性的重要指标。
生物制药技术使用中的监测方法与结果解读指南
生物制药技术使用中的监测方法与结果解读指南随着生物制药技术的不断发展，越来越多的生物药物被开发和应用于临床治疗中。
在生物制药的生产过程中，监测方法的选择和结果的解读至关重要，因为这直接关系到药物的质量和疗效。
本文将介绍一些常见的生物制药技术使用中的监测方法，并提供一些结果解读的指南。
一、细胞培养监测方法在生物药物制造过程中，细胞培养是关键环节之一，因为生物药物通常是使用细胞来产生的。
常见的细胞培养监测方法包括细胞密度测定、细胞活力测定和细胞产物测定。
1. 细胞密度测定：细胞密度是指单位体积内细胞的个数，通常使用显微镜计数法或细胞计数仪来测定。
细胞密度的变化可以提供有关细胞增殖和死亡情况的信息，利于调整培养条件。
2. 细胞活力测定：细胞活力是指细胞的活动状态和功能活跃程度，通常使用细胞染色法、酶活性测定或细胞内特定蛋白的表达来测定。
细胞活力的监测可以评估细胞的健康状况，以及细胞内代谢产物的表达和积累情况。
3. 细胞产物测定：细胞产物是指细胞培养过程中产生的目标蛋白或其他生物活性物质。
常用的测定方法包括酶活性测定、免疫学方法（如ELISA或Western blot）和质谱分析等。
细胞产物的测定有助于评估生产过程中产物的质量和纯度。
二、病原体检测方法生物制药过程中使用的细胞培养系统可能存在病原体污染风险，因此对病原体的监测非常重要。
常见的病原体检测方法包括核酸检测、免疫学检测和生物学检测。
1. 核酸检测：核酸检测是一种直接检测病原体核酸序列的方法，包括PCR、实时荧光PCR和基因芯片等。
核酸检测方法具有高度的敏感性和特异性，可以快速准确地检测到病原体的存在。
2. 免疫学检测：免疫学检测通过检测体液中的病原体特异性抗体或抗原来间接地检测病原体的存在。
常用的免疫学检测方法包括酶联免疫吸附试验（ELISA）、免疫荧光分析和免疫印迹等。
3. 生物学检测：生物学检测主要包括细菌培养和病毒滴度测定等。
通过对样品进行培养或使用细胞系进行感染，可以检测到病原体的存在，并测定其数量。
酶联免疫吸附测定法
酶联免疫吸附测定法（ELISA）1.定义 (3)2.原理 (3)2.1抗原抗体反应 (3)2.2免疫测定在临床检验中的应用 (5)3.ELISA的类型 (5)3.1双抗体夹心法测抗原： (6)3.2双抗原夹心法测抗体 (6)3.3间接法测抗体 (6)3.4竞争法测抗体 (7)3.5竞争性测抗原 (7)3.6捕获包被法测抗体 (7)3.7ABS-ELISA法 (8)4.ELISA试剂的组成 (9)4.1固相载体： (9)4.2包被的方式 (9)4.3包被用抗原：天然抗原、重组抗原、合成多肽抗原。
(10)4.4包被的条件： (10)4.5洗涤液： (10)4.7酶的催化性； (11)4.8结合物的制备 (11)4.9结合物的保存 (12)4.10酶的底物 (12)4.11酶反应终止液 (12)4.12参考标准品 (13)4.13加样： (13)4.14保温 (13)4.15保温方式： (13)4.16室温温育的反应 (13)4.17洗涤 (14)4.18显色 (14)4.19比色 (14)4.20酶标比色仪 (15)4.21结果判定 (15)4.22定量测定 (16)4.23ELISA的操作要点 (16)1.定义酶联免疫吸附测定法（Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay），简称ELISA，采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接，然后通过酶与底物产生颜色反应，对受检物质进行定性或定量分析的一种检测方法。
2.原理采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接，然后通过酶与底物产生颜色反应，可对受检物质的定性或定量分析。
2.1抗原抗体反应2.1.1可逆性抗原与抗体结合形成抗原抗体复合物的过程是一种动态平衡，其反应式为：Ag+Ab→Ag·Ab抗体的亲和力（affinity），可以用平衡常数K表示：K=[Ag·Ab]／[Ag][Ab]，Ag·Ab 的解离程度与K值有关。
实验一、血液标本提取DNA(蛋白酶K-酚抽提法)
实验一、血液标本提取DNA（蛋白酶K-酚抽提法）一、实验原理离心分离到外周血的白细胞层；用细胞裂解液溶解细胞膜、核膜，使组蛋白与DNA分离，再用酚、三氯甲烷/异戊醇抽提去除蛋白质，最后经乙醇沉淀即可得到基因组DNA片段。
二、实验步骤：1、血液标本处理 1.0ml抗凝全血(ACD、EDTA抗凝均可)2000rpm离心10min（1.5mlEP管）。
轻轻去上清液（血浆），吸出淡黄色悬浮液（白细胞层）置于另一2.0mlEP管中。
（约50μl）2、细胞裂解加入10倍体积组织细胞裂解液，37℃1h，3、加入蛋白酶K消化加入蛋白酶K至终浓度100μg/ml（约4μl），充分混匀，37℃震荡12-24h或37℃1h后，56℃水浴3h。
保温过程中不时摇动，混匀反应液。
液体逐渐变粘稠，表明已有DNA释放出来，操作应轻柔。
4、酚抽提：将上述溶液冷却至室温，加等体积的Tris饱和酚（pH8.0）溶液，温和缓慢颠倒离心管10min，混匀两相成乳液。
12000rpm 5分钟，两相分层。
用宽口径移液管小心吸出上层粘稠的水相，移至一新的2.0mlEP管中。
（小心一点，不要吸入蛋白层。
如交界处有白色沉淀，需重新抽提有机相，用酚重新抽提两次，合并水相）5、三氯甲烷/异戊醇抽提上清液加等体积三氯甲烷：异戊醇（24：1），倒转混匀10分钟，12000rpm5分钟，取上层水相0.5ml入另一新的2.0mlEP管；6、DNA沉淀上清液中加0.2倍体积3.0mol/L 醋酸钠，再加2倍体积的4℃冰箱冷却后的无水乙醇，轻柔振摇，充分混匀；应可看到白色絮状物（DNA）。
12000rpm 5分钟，弃上清液；7、纯化：加1ml 70%乙醇洗涤，12000rpm 离心5分钟，去上清夜，重复1次；（此过程不得振荡摇动）8、溶解：弃上清液后，自然干燥（挥发痕量乙醇）后，用30μl pH8.0TE完全溶解，保存在-20℃备用。
三、注意事项1、加样准确，操作轻柔；微量加样器绝对不能超过最大量程；2、加酚试剂时，不要接触到皮肤上，有腐蚀性；如不小心弄到，立即用清水冲洗；3、取上清液时，不可吸到下层溶液；4、加TE液后轻摇10min溶解DNA或-4˚C保存待用。
胰蛋白酶比活力测定的实验操作
胰蛋白酶比活力测定的实验操作胰蛋白酶（trypsin）是一种重要的消化酶，用于蛋白质的降解。
测定胰蛋白酶的比活力可以评估其酶活性及纯度。
下面是测定胰蛋白酶比活力的实验操作步骤。
实验所需材料：1.胰酶溶液2. Brain Heart Infusion (BHI)培养基3. 丙氨酰-L-苯丙氨酰-L-色氨酸对(L-Tyr-L-Phe)4.0.1M氢氧化钠（NaOH）溶液5.0.1M硫酸（H2SO4）溶液实验步骤：1.准备酶样品：取适量的胰酶溶液，可以是商业制备的纯胰蛋白酶或者胰腺提取物。
2. 酶样品稀释：将胰酶溶液与BHI培养基按照一定比例混合，使得最终浓度在0.5-1.2mg/mL之间。
3.加入底物：向每个试管中加入20μL的丙氨酰-L-苯丙氨酰-L-色氨酸对底物。
4.孵育反应：将试管置于37℃恒温培养箱中，在设定的时间内进行酶催化反应。
5.终止反应：用加入2NNaOH溶液终止酶反应，使底物水解停止。
6.酶解产物的提取：将反应液离心，取上清液转移到新的离心管中。
实验测量方法：1. 分光光度计法：利用胰酶催化底物水解产生的对分光光度计可见吸收的产物进行测定。
用1cm光程的比色皿，将底物水解产物的吸光度读数记录下来。
2. pH差比色法：用pH差比色法测量胰酶反应液中产生的酪氨酸分解产物。
黄色小麦胚芽酪氨酸（Tyr）的醛缩反应，其产物具有红色或紫色，在526nm处吸收峰。
通过比较不同样品的吸收度可以得出胰酶比活力。
数据处理：1.分光光度计法：根据底物水解产物的吸光度，绘制标准吸光度-底物浓度曲线，利用该曲线确定底物浓度，进一步计算胰酶的比活力。
2.pH差比色法：计算样品吸收值，将其与标准吸光度曲线相对应的底物浓度进行比较，计算胰酶的比活力。
注意事项：1.操作要严格遵守无菌技术，以避免细菌或其他污染物对实验结果的干扰。
2.实验过程中可以选择不同的底物和测量方法，以适应实验目的和条件。
3.实验操作需谨慎，避免接触眼睛和口腔，注意个人安全。
蛋白质纯化后的评价标准
蛋白质纯化后的评价标准在评价样品纯度之前，首-先需要鉴定待测杂质的类型，如核酸、碳水化合物、脂质、无关蛋白质、同工酶类、失活蛋白质，进而确定在特定溶液条件中, 能够区分假定杂质和目标蛋白质的理化特性(化学分析或物理特征）。
而纯度则是指待测杂质含量低于某个特定水平。
需要注意的是，上述说明中并没有要求描述杂质的性质。
纯化过程可能已将某一杂质的浓度降低到检测下限以下，但色谱峰中还有残留。
毫无疑问，表观纯度取决于所选择的测定方法及其灵敏度。
由于大多数分离方法都能够有效地去除非蛋白质类杂质，因此本文将主要介绍蛋白质样品中蛋白质类杂质的检测方法。
目前有一些高灵敏度的方法可用于检测样品中的杂质。
其中每种方法测定分子的一种特定物理特性。
方法的选择依赖于以下标准:①可用于检测的蛋白质的量；②待测杂质的性质;③所需的检测精度;④所需的检测灵敏度;⑤可能干扰到该方法的蛋白质及其溶剂特性。
蕞为简单和常用的方法是，经一次或多次分离后证实只有一种组分可被检测到。
若纯度标准为只可以存在一种可检测物质，则需用多种分离手段检测杂质。
当所选择的某种检测方法无法从主要分析物中分辨出一种未知杂质时，推荐使用正交的方法(orthogonal)。
蕞后，谨慎处理样品非常重要，这样可以防止在制备分析所用的样品过程中改变其杂质谱。
并且，洁净的环境、适宜的温度及适当材质的容器都会为分析提供帮助。
一、蛋白质的组成和活性分析一些方法能够量化氨基酸、特定辅基团或活性位点的摩尔数，可以用来评价蛋白质样品的纯度。
如果已知纯蛋白质的活性，那么单位活性测量可以用来检测相对纯度。
这些方法是间接的，因为总要将分析物假设为不含杂质的纯品，并将该假设纯品的量作为参照。
这些方法主要适用于纯化过程早期的多相系统，或适用于需要特殊环境来保持活性的分子(如膜蛋白）。
一般需要检测两项: 第1项是分析所用样品中蛋白质(或原料）的总量; 第二项是定量已知的活性对象或其他特殊的分析对象。
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§2. SDS-凝胶电泳检测木瓜 凝乳蛋白酶的纯度
❖一、实验原理
聚丙烯酰胺凝胶：是由丙烯酰胺和交联剂甲叉 丙烯酰胺在催化剂作用下，聚合而成的凝胶， 凝胶具有网状立体结构和具有分子筛效应， 因此可用此凝胶为支持物进行电泳。
聚丙烯酰胺凝胶电泳有2种形式：
第一种，非变性聚丙烯酰胺凝胶：蛋白质在电 泳中保持完整的状态，在电泳过程中影响蛋 白迁移速率的因子包括：蛋白大小、蛋白形 状和蛋白所带电荷。
二、试剂与材料 1、10%过硫酸铵溶液 （新鲜配制） 2、 TEMED（四甲基乙二胺）（避光保存） 3、分离胶缓冲液：1.5M Tris-HCl,pH8.8 4、浓缩胶缓冲液：0.5M Tris-HCl, pH6.8 5、染色液：0.05%考马斯亮蓝甲醇溶液 6、脱色液：7%冰醋酸 7、蛋白标准、木瓜凝乳蛋白酶样品 8、材料：电泳仪电源、 垂直电泳槽
实验目的 ❖ 1、掌握考马斯亮蓝法测定酶蛋白含量的原理
和方法 ❖ 2、掌握SDS-凝胶电泳检测酶蛋白纯度的原
理和方法
§1 木瓜凝乳蛋白酶含量测定
一、实验原理 考马斯亮蓝法：根据蛋白质与染料特异性结 合原理设计的。考马斯亮蓝G-250 （Coomassie brilliant blue G-250）在游离 状态下呈红色，最大光吸收在488nm处；当 它在酸性溶液中与蛋白质结合后变为蓝色， 这个结合主要是与蛋白质中的碱性氨基酸 （特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结 合。
❖ 第二种，变性聚丙烯酰胺凝胶：在非变性 凝胶电泳中加入SDS和巯基乙醇变性剂， SDS能破坏蛋白质分子之间的非共价键， 在巯基乙醇或二硫苏糖醇的作用下，蛋白 质分子内的二硫键被打开并解聚成多肽链。
❖ 蛋白质分子与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质 -SDS复合物，该复合物具有3个特点:
❖ A.所带的负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷 量，这就消除了不同蛋白质分子之间原有的电荷差 异；
❖ B.在溶液中的形状像一个长椭圆棒，消除了蛋白质 间分子形状的差异。
❖ C.不同蛋白质所形成的椭圆棒的短轴是相同的（约 18μm），但长轴的长度则与蛋白质分子量的大小 成正比，因此这种复合物在SDS-PAGE系统中的电 泳迁移率主要取决于蛋白质分子量的大小。
❖ 当蛋白质的分子量在15-200kD之间时，电泳迁移 率与分子量的对数呈线性关系。由此可见，SDSPAGE可以分离、鉴定蛋白质，也可检测其纯度。
其结合物在595nm左右波长下有最大光吸收, 而且光吸收值与蛋白质含量成正比，因此 可用于蛋白质的定量测定。该结合反应在 2min左右的时间内达到平衡，且在室温下 1h内保持稳定。
该法具有操作简便、反应灵敏、稳定性强的 优点。
适用测定蛋白质浓度的范围为0～1 000μg／ mL。
❖ 二、实验材料 ❖ 1.考马斯亮蓝G-250 ❖ 2.标准蛋白液：0.5mg/mL牛血清白蛋白 ❖ 3.NaCl溶液 ❖ 4.木瓜凝乳蛋白酶纯化酶 ❖ 5.分光光度计
（µg/mL）0
上述溶液摇匀，室温反应2分钟，在595nm处测定吸光度， 以蛋白质含量为横坐标，吸光度为纵坐标，绘出标准曲线； 并同时测定木瓜凝乳蛋白酶的吸光度，在标准曲线上求出 木瓜凝乳蛋白酶的含量。
v 四、实验结果
v 1、做出标准曲线并求出其相关系数
v 2、求出木瓜凝乳蛋白酶含量 （µg/mL ）
要求 1、蛋白含量测定：2人/组 2、SDS-凝胶电泳：每人做一块胶，2人/套电泳槽 3、实验完毕，所有器皿必须清洗后收到实验柜中
值日：第1-3组
四配、制电实泳验凝方胶（法包括分离胶和浓缩胶）
上样（上样量为10 µl ,注意不留空槽） 电泳（浓缩胶150V电压，分离胶180V） 电泳胶处理（染色、脱色、拍照保存）
分光光度计PC3100使用注意事项： 测蛋白含量用“含量测定”模式
注意事项： 1、制胶时操作戴PE手套 2、玻璃板必须擦干净再做胶
三、实验方法
试管
CK 1
2
3
4
5
6 样品 样品 ……
BSA（µl）
50 100 200 300 400 500
0.5mMNaCl(µl)
450 400 300 200 100 0
0.15 mMNaCl(µl) 500
样品（µl）
500 500
考马斯亮蓝（mL） 5
5
5
5
SA 稀释后浓度