7 高效液相色谱法-文档资料
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北京化工大学仪器分析第三章高效液相色谱精品文档
检测器
用来连续监测经色谱柱分离后的流出物 的组成和含量变化的装置。
紫外-可见检测器 荧光检测器 电化学检测器 蒸发光散射检测器 质谱检测器
紫外-可见检测器
单波长UV检测器，光源用Hg灯，加滤光 片 可 以 到 254 ， 280 ， 313 ， 334 ， 365 等 。 生化中用到很多。
多波长 光度计类似，光栅或棱镜分光
残留农药和兽药是食品中主要的污染物 世界上许多国家制定并实施食品安全法规，但是
在美国、加拿大、欧盟以及日本食品安全法规更 加严格的完善。 在食品和农产品国际贸易中，残留农药和兽药的 检测中非常苛刻的。
食品中残留检测
农产品 - 谷物：大米等 - 豆类：大豆、豌豆等。 - 水果：橘柑，苹果，葡萄等。 - 蔬菜：洋白菜（甘蓝）、菠菜等 - 茶叶，种子，蜂蜜等。
全多孔型担体 薄壳型微珠担体
固定相 --- 化学键合
R --- 极性基团 疏水基团 离子交换基团
Si OO
Si
HCO S l iOC HS l i3 ()2 C RHO SiOSi3 ()2 C RH
O
SiOH
SiOSi3 ()2 C RH
固定相的化学构造
非键合相表面
键合相表面
ODC
C18
C8
C1 Phenyl
样品的分析实例
食品 啤酒，清酒，葡萄酒，酱油等
体液 血清，尿等
医药品 肾的透析液，钙制剂等
发酵 微生物培养液，酸奶等
环境 工厂废水等
有机酸标准品的色谱图1
一个分析柱
1. 磷酸 2. 柠檬酸 3. 丙酮酸 4. 苹果酸 5. 琥珀酸 6. 乳酸 7. 甲酸 8. 乙酸 9. 乙酰丙酸 10. 焦谷氨酸
高效液相色谱法检测大脑神经递质多巴胺-最新文档资料
高效液相色谱法检测大脑神经递质多巴胺多巴胺（dopamine， DA）是一类儿茶酚胺类物质（CAs），它存在于神经组织及体液中，是下丘脑和脑垂体腺中的一种重要的神经递质，脑垂体内分泌功能的协调与多巴胺在脑内特定区域的分布及含量有密切关系，导致神经功能紊乱，是帕金森病（Parkinson’s disease）发病的一个重要影响因素。
另外，多巴胺还能够引起心脏兴奋，使血流量增加，以用于感染性休克和心源性休克。
所以，进行多巴胺检测的研究具有重要的现实意义[1]。
本文就多巴胺的高效液相色谱法检测作一综述。
高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）[2，3]也是通用的DA的检测方法。
近年来，由于高效液相色谱技术的不断发展，用HPLC法分离测定体液和组织中CAs的方法日趋完善，检测灵敏度可达pmol水平。
高效液相色谱法具有高分离率，所以在CAs的分析中受到极大重视，HPLC法同电化学检测和荧光检测相结合是目前最有效且最常用的方法。
CAs本身有自然荧光，经HPLC法分离后，可以利用它的荧光进行检测，但是由于其自然荧光相对比较弱，不能用作生物样品灵敏的选择性测定方法。
儿茶酚胺类物质具有两个官能团（氨基和邻二羟基），因此可以通过衍生化形成具有强荧光的物质，借此提高检测灵敏度。
吴予明等[4]利用HPLC和荧光检测器对嗜铬细胞瘤患者和正常人24h尿中DA含量进行测定，对样品进行调酸、萃取、调碱、吸附、洗涤、解析处理后，100微升进样，结果可见：多巴胺浓度在1.3*10-7mol/L～3.8*10-6mol/L内与色谱峰峰高的线性关系良好（r=0.998）精密度RSD（n=6）4.2%～10.3%。
衍生化可分成柱前衍生化和柱后衍生化两种，在分离前需要制备荧光衍生物的柱前衍生化是，有邻苯二甲醛（OPA）、荧光胺（FA）、丹磺酞氯（DNSCI） l，2一二苯基乙二胺（DPE）及萘一2，3一二羧醛等属于柱前衍生化试剂。
高效液相色谱法培训课件
更换色谱柱（厂家，型号）
进样操作不当
转动进样阀时应一次转到位，不能过慢或 停顿，否则易造成裂峰。
样品溶剂与流动相成分不匹配
样品溶剂与流动相成分不匹配，造成前沿 峰或倒峰。如样品用纯甲醇作溶剂，而流 动相中甲醇比例很低，这样易出现前沿峰， 改变样品溶剂成分或比例，使醇-水比例接 近于流动相。
计
色谱柱
色谱柱有柱管和固定相组成，柱管用不 锈钢制成，柱长10～30cm，内径2～ 6mm，以4.6mm的内径最常用。
根据键合基团极性不同，化学键合相可 分为非极性、中等极性和极性三类。
常用色谱柱有：
ODS柱、氰基柱、氨基柱等
非极性键合相
表面基团为非极性烃基，如C18 、C8等， 主要用于RP色谱。 C18是最常用的非极 性键合相，将十八烷基氯硅烷与硅胶表 面的硅醇基经多步反应而成。
样品纯度差——有微小的颗粒堵塞管路。 可用滤膜过滤样品后再进样。
样品浓度高——连续进样，造成过载。
如果样品吸收度不是太低，使样品浓度在 1mg/ml以下较适宜。
流动相中缓冲液浓度过高，有机相比例大—— 在色谱过程中堵塞管路，析出的盐结晶还磨损 泵、进样阀密封圈造成漏液。
缓冲液浓度一般控制在20mmol以下较适宜， 测定完毕后必须及时用水充分冲洗。
倒
前沿峰
峰
结果不能重现
表现为同一样品溶液连续进样所得峰面积 相差大，引起这种情况时，可从以下几 方面来查找原因：
泵、进样阀、管路漏液——造成峰面 积变化。
检测器灵敏度改变——如果同一样品 两次进样峰面积相差10倍或更大倍数， 则最可能的原因是检测器的灵敏度被 无意中改变，软件的灵敏度改变不会 影响峰面积的积分数值。
离子色谱是由经典的离子交换色谱发 展起来的一种液相色谱技术，利用物 质在离子交换柱上迁移的差异而达到 分离，用于亲水性阴阳离子的测定。 根据是否采用抑制柱，可分为抑制型 离子色谱和非抑制型离子色谱。
进样操作不当
转动进样阀时应一次转到位，不能过慢或 停顿，否则易造成裂峰。
样品溶剂与流动相成分不匹配
样品溶剂与流动相成分不匹配，造成前沿 峰或倒峰。如样品用纯甲醇作溶剂，而流 动相中甲醇比例很低，这样易出现前沿峰， 改变样品溶剂成分或比例，使醇-水比例接 近于流动相。
计
色谱柱
色谱柱有柱管和固定相组成，柱管用不 锈钢制成，柱长10～30cm，内径2～ 6mm，以4.6mm的内径最常用。
根据键合基团极性不同，化学键合相可 分为非极性、中等极性和极性三类。
常用色谱柱有：
ODS柱、氰基柱、氨基柱等
非极性键合相
表面基团为非极性烃基，如C18 、C8等， 主要用于RP色谱。 C18是最常用的非极 性键合相，将十八烷基氯硅烷与硅胶表 面的硅醇基经多步反应而成。
样品纯度差——有微小的颗粒堵塞管路。 可用滤膜过滤样品后再进样。
样品浓度高——连续进样，造成过载。
如果样品吸收度不是太低，使样品浓度在 1mg/ml以下较适宜。
流动相中缓冲液浓度过高，有机相比例大—— 在色谱过程中堵塞管路，析出的盐结晶还磨损 泵、进样阀密封圈造成漏液。
缓冲液浓度一般控制在20mmol以下较适宜， 测定完毕后必须及时用水充分冲洗。
倒
前沿峰
峰
结果不能重现
表现为同一样品溶液连续进样所得峰面积 相差大，引起这种情况时，可从以下几 方面来查找原因：
泵、进样阀、管路漏液——造成峰面 积变化。
检测器灵敏度改变——如果同一样品 两次进样峰面积相差10倍或更大倍数， 则最可能的原因是检测器的灵敏度被 无意中改变，软件的灵敏度改变不会 影响峰面积的积分数值。
离子色谱是由经典的离子交换色谱发 展起来的一种液相色谱技术，利用物 质在离子交换柱上迁移的差异而达到 分离，用于亲水性阴阳离子的测定。 根据是否采用抑制柱，可分为抑制型 离子色谱和非抑制型离子色谱。
高效液相色谱法()ppt文档
（二）高压输液泵
对输液泵的基本要求： ①流量准确可调。 流动相的流速在0.5-2mL/min，流量控制精度通常 要求小于±0.5%。
②耐高压。 通常要求泵的输出压力达到30-60MPa的高压。 ③液流稳定。 输出的液流应无脉动
④泵的死体积小。 泵的死体积通常要求小于0.5mL。
⑤密封性能好，耐腐蚀
第2节 基本理论
高效液相色谱法的塔板理论与气相色谱法完全相同， 速率理论略有差异。 一、柱内展宽
H A B /u (C m C sm C s)u
1.涡流扩散项 涡流扩散项与气相色谱法相同， A＝2λdp
高效液相色谱多使用3～10um球形固定相颗粒 , 以均浆高压装填，A较小。
2.分子扩散项
二、进样系统
进样器要求密封性好，死体积小，重复性好。 流路中为高压力工作状态，通常使用耐高压
的六通阀进样装置，结构如图所示：
三、分离系统 色谱柱是液相色谱的心脏部件，它包括柱管
与固定相两部分。柱管材料有玻璃、不锈钢、铝、 铜及内衬光滑的聚合材料的其他金属。金属管用 得较多。一般色谱柱长5～30cm，内径为4～ 5mm，
高效液相色谱法()
第1节 高效液相色谱仪
一、输液系统
（一）溶剂脱气与过滤 HPLC所用流动相必须预先脱气，否则容易在 系统内逸出气泡，影响泵的工作；还会影响检 测器的正常响应。
①抽真空脱气 ②超声波振荡脱气 ③吹氦脱气
溶剂应经过0.45μm滤膜过滤，以除去溶剂中的固 体杂质，防止堵塞色谱柱、管路系统，保护高压泵
使用色谱柱注意事项： 1 溶剂和样品应过滤， 防止堵塞。 2 加前置柱。 3 用完后要清洗
四、检测系统
要求检测器灵敏度高、噪声低、死体积小、线性范围宽、 重复性好、适用范围广等。
高效液相色谱法(全)
32
§3 高效液相色谱固定相和流动相
二、流动相要求： 流动相要求： 化学惰性 适宜的物理性质 溶剂清洗和更换方便，毒性小、纯度高、 溶剂清洗和更换方便，毒性小、纯度高、 价廉等， 价廉等，便于操作和安全 高纯度， 高纯度，化学稳定性好
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四种类型液相色谱法的比较
类型 吸附色谱 分配色谱 主要分离机理 主要分析对象或应用领域 吸附能力， 异构体分离、 吸附能力，氢 异构体分离、不同族化合物分 离，纯化制备 键 同系物组分的分离、 疏水分配作用 同系物组分的分离、分析 无机离子、 无机离子、有机离子分析 高分子分离， 高分子分离，分子量及其分布 的测定
18
淋洗方式
等度淋洗 梯度淋洗： 梯度淋洗：分离极性相差较大的混合物 流动相组成的变化是分段式的或连续式的，根 流动相组成的变化是分段式的或连续式的， 据控制方式而定。 据控制方式而定。 梯度洗脱优点：缩短分析时间；提高分离效能； 梯度洗脱优点：缩短分析时间；提高分离效能； 优点 改善峰形，减少拖尾；提高灵敏度。 改善峰形，减少拖尾；提高灵敏度。
N R= 4 α − 1 k 2 α 1 + k 2
容量因子k 通过控制溶剂极性大小来调节； 容量因子k：通过控制溶剂极性大小来调节； 提高理论塔板数n 降低塔板高度H 提高理论塔板数n，降低塔板高度H： 选择因子α 通过改变流动相的组成、pH值等来 选择因子α：通过改变流动相的组成、pH值等来 改变选择性； 改变选择性；
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离子交换色谱 库仑力 体积排阻色谱 溶质分子大小
一、吸附色谱
1.固定相 1.固定相：吸附活性强弱不等的吸附剂
硅胶、氧化铝、 硅胶、氧化铝、聚酸胶等
2.流动相：各种极性的洗脱剂 2.流动相 3.分离原理 物质在固定相上的吸附作用 吸附作用不同 3.分离原理：物质在固定相上的吸附作用不同 4.用途 非极性溶剂中、 4.用途：非极性溶剂中、具有中等相对分子质
高效液相色谱法知识汇总大全集(最新最值得收藏的资料整理)
高效液相色谱法知识汇总大全集（最新最值得收藏的资料整理）HPLC应用一、样品测定1．流动相比例调整：由于我国药品标准中没有规定柱的长度及填料的粒度，因此每次新开检新品种时几乎都须调整流动相（按经验，主峰一般应调至保留时间为6~15分钟为宜）。
所以建议第一次检验时请少配流动相，以免浪费。
弱电解质的流动相其重现性更不容易达到，请注意充分平衡柱。
2．样品配制：①溶剂；②容器：塑料容器常含有高沸点的增塑剂，可能释放到样品液中造成污染，而且还会吸留某些药物，引起分析误差。
某些药物特别是碱性药物会被玻璃容器表面吸附，影响样品中药物的定量回收，因此必要时应将玻璃容器进行硅烷化处理。
3．记录时间：第一次测定时，应先将空白溶剂、对照品溶液及供试品溶液各进一针，并尽量收集较长时间的图谱（如30分钟以上），以便确定样品中被分析组分峰的位置、分离度、理论板数及是否还有杂质峰在较长时间内才洗脱出来，确定是否会影响主峰的测定。
4．进样量：药品标准中常标明注入10ml，而目前多数HPLC系统采用定量环（10ml、20ml 和50ml），因此应注意进样量是否一致。
（可改变样液浓度）5．计算：由于有些对照品标示含量的方式与样品标示量不同，有些是复合盐、有些含水量不同、有些是盐基不同或有些是采用有效部位标示，检验时请注意。
6．仪器的使用：①流动相滤过后，注意观察有无肉眼能看到的微粒、纤维。
有请重新滤过。
②柱在线时，增加流速应以0.1ml/min的增量逐步进行，一般不超过1ml/min，反之亦然。
否则会使柱床下塌，叉峰。
柱不线时，要加快流速也需以每次0.5ml/min的速率递增上去（或下来），勿急升（降），以免泵损坏。
③安装柱时，请注意流向，接口处不要留有空隙。
④样品液请注意滤过（注射液可不需滤过）后进样，注意样品溶剂的挥发性。
⑤测定完毕请用水冲柱1小时，甲醇30分钟。
如果第二天仍使用，可用水以低流速（0.1~0.3ml/min）冲洗过夜（注意水要够量），不须冲洗甲醇。
高效液相色谱技术(HPLC)
溶质在固定相中的量 溶质在流动相中的量
ab
• “ k’ ”是比“ tR”还常用的保留值，它与柱子
的大小及流速无关，只与溶质在固定相和流动
相
的分
配
性
质、
柱
温 以 及 k ,＝ tR－t0 t0
相空
间
比
（
即
固
定相
和流动相之体企积比）有关。“ k’ ”又定义为
在分配平衡时某溶质在两相中绝对量之比，消
除了保留值的波动因素，而平衡常数“ K ”是
⑸选择性指标“α’ ”和相对保留值“α”
α’ 可以更直观和方便地反映色谱峰分离的好坏：
α'＝ tR(2)
进样 tR(1)
tR(2)
tR (1)
相对保留值α(分离因子)：
α＝ t' R(2) ＝ k ' (2) ( α＞1.1为好 ) t' R(1) k ' (1)
• 2. 柱效率：
•
定义：
理论塔板数
• 键合相使用硅胶作基质的优点是：
①硅胶的强度大；②微粒硅胶的了孔结构和 表面积易人为控制；③化学稳定性好。
• 硅胶 ( SiO2•n H2O) ：
OH OH —Si—O—Si—
｜｜
• 重要的键合相是：硅烷化键合相，它是硅胶与有机硅烷反应的 产物。
• 最常用的键合相键型是： ｜ ｜
—Si—O—Si—C
平衡时物质在两相中的浓度比。
• k’值的范围： 0.4＜k’＜20～30 k’＝2～5 为佳，过大则耗时太长。
⑷保留体积：VR＝tR•FC ( FC --- 流动相的流速 mL/min tR’＝ tR－t0 调整保留体积：VR’＝ VR－VR0＝tR’ •FC
第十章高效液相色谱法-精选文档97页
用的固定相柱效低，分析周期长。而现代液相色谱法引用了 气相色谱的理论，流动相改为高压输送（最高输送压力可达 4.9107Pa）；色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料填充而 成，从而使柱效大大高于经典液相色谱（每米塔板数可达几 万或几十万）；同时柱后连有高灵敏度的检测器，可对流出 物进行连续检测。因此，高效液相色谱具有分析速度快、分 离效能高、自动化等特点。所以人们称它为高压、高速、高 效或现代液相色谱法。
2019/11/12
C. 梯度洗脱装置
梯度洗脱就是在分离过程中使两种或两种以上不同极性的 溶剂按一定程序连续改变它们之间的比例，从而使流动相的强 度、极性、pH值或离子强度相应地变化，达到提高分离效果， 缩短分析时间的目的。
梯度洗脱的实质是通过不断地变化流动相的强度，来调整 混合样品中各组分的k值，使所有谱带都以最佳平均k值通过色 谱柱。它在液相色谱中所起的作用相当于气相色谱中的程序升 温，所不同的是，在梯度洗脱中溶质k值的变化是通过溶质的 极性、pH值和离子强度来实现的，而不是借改变温度（温度 程序）来达到。
灵敏度低、对温度 敏感、不能用于梯度洗 脱；
偏转式、反射式和 干涉型三种；
2019/11/12
d. 荧光检测器
（fluorescence detector）
高灵敏度、高选择性； 对多环芳烃，维生素B、 黄曲霉素、卟啉类化合物、 农药、药物、氨基酸、甾类 化合物等有响应；
2019/11/12
第三节 液-固色谱法
2019/11/12
一、HPLC与经典LC区别
主要区别：固定相差别，输液设备和检测手段 1．经典LC：仅做为一种分离手段
柱内径1~3cm，固定相粒径>100μm 且不均匀 常压输送流动相 柱效低（H↑，n↓） 分析周期长 无法在线检测
2019/11/12
C. 梯度洗脱装置
梯度洗脱就是在分离过程中使两种或两种以上不同极性的 溶剂按一定程序连续改变它们之间的比例，从而使流动相的强 度、极性、pH值或离子强度相应地变化，达到提高分离效果， 缩短分析时间的目的。
梯度洗脱的实质是通过不断地变化流动相的强度，来调整 混合样品中各组分的k值，使所有谱带都以最佳平均k值通过色 谱柱。它在液相色谱中所起的作用相当于气相色谱中的程序升 温，所不同的是，在梯度洗脱中溶质k值的变化是通过溶质的 极性、pH值和离子强度来实现的，而不是借改变温度（温度 程序）来达到。
灵敏度低、对温度 敏感、不能用于梯度洗 脱；
偏转式、反射式和 干涉型三种；
2019/11/12
d. 荧光检测器
（fluorescence detector）
高灵敏度、高选择性； 对多环芳烃，维生素B、 黄曲霉素、卟啉类化合物、 农药、药物、氨基酸、甾类 化合物等有响应；
2019/11/12
第三节 液-固色谱法
2019/11/12
一、HPLC与经典LC区别
主要区别：固定相差别，输液设备和检测手段 1．经典LC：仅做为一种分离手段
柱内径1~3cm，固定相粒径>100μm 且不均匀 常压输送流动相 柱效低（H↑，n↓） 分析周期长 无法在线检测
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现性好，可在高压下操作。 常用的进样装置有以下两种： （1）注射器进样 进样方式同气相色谱。缺点是只能在低压或停流状态下进样，
易漏液且重复性差。 （2）六通阀进样 可直接向压力系统内进样而不必停止流动相的流动。进样体
积准确，重现性好。
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六通阀
高压泵
进样前
色谱柱
进样中 （Load）
Hs——固定相传质阻力项 Hm——流动相传质阻力项
传质阻力项
Hsm——滞留流动相传质阻力项
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1. 涡流扩散项He 减小粒度，提高柱内填料装填的均匀性可以降低He
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2. 分子扩散项Hd(纵向扩散项) 组分在液体中的扩散系数比在气体中的要小4～5个数量级， 所以Hd对液相色谱峰的展宽影响可以忽略，而在气相色谱 中此项却很重要。
高压：15-35 MPa 高效：大于30000塔板/米 高灵敏：10-9g （紫外检测）、10-11g （荧光检测）
3
二、HPLC与GC差别
1．分析对象不同 GC：适于能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品；但对
高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型及高聚物的样品， 尤其对大多数生化样品不可检测
在于可能引起基线漂移。
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梯度洗脱分为高压梯度洗脱和低压梯度洗脱两类： 高压梯度洗脱：利用两台高压泵将溶剂增压后输入
梯度混合室，加以混合后送入色谱柱 低压梯度洗脱：在常压下先将溶剂按程序混合后，
再用泵增压送入色谱柱。 目前多采用低压梯度洗脱。
11
3. 进样装置
好的进样装置应满足： 样品被瞬时注入到色谱柱的柱头中心形成一个小“点”，重
可变波长检测器，波长可变，类似于紫外分光光度计；
16
5.2 光电二极管阵列检测器（photo-diode array detector， DAD） 紫外检测器的重要进展； 光电二极管阵列检测器：1024个二极管阵列，各检 测特定波长，计算机快速处理，三维立体谱图，如 图所示。
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18
峰宽
28
HPLC法中分离条件的选择
提高柱效→减小塔板高度H 1. 固定相与装柱方法的选择： 选粒径小的、分布均匀的球形固定相 （粒径≤10μm） 首选化学键合相，匀浆法装柱 2. 流动相及其流速的选择： 选粘度小、低流速的流动相——甲醇，约1ml/min 3. 柱温的选择： 选室温25℃左右
tR’——调整保留时间
W1/2——半峰宽
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二、速率理论
Giddings等提出的液相色谱速率方程如下：
H H e H d H s H m H sm
H——塔板高度 He——涡流扩散项 Hd——分子扩散项，又称纵向扩散项
塔板高度越小，则单位长度 的色谱柱具有的塔板数越多， 柱效越高。
高压泵应满足以下要求：
较高的输出压力，30～50MPa。 输出流量精确度高，并有较大调节范围。分析型HPLC
流量为0.1～10mL/min，制备型为50～100mL/min。 输出压力要平稳。否则检测器噪声将增大。
密封性好，便于更换溶剂，耐腐蚀。
高压泵示意图.swf
8
高压泵分为恒流泵和恒压泵两类。 恒压泵：流量受柱压影响，不稳定。 恒流泵：流量不受柱压影响。常用的类型是
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5.1 紫外检测器
紫外检测器.swf
是HPLC广泛使用的检测器，其检测原理与紫外可 见分光光度计相同。
结构简单；
测量池体积在5～10μL之间，但是光路长5～10mm；
灵敏度高，最小检测浓度达10-9g/mL；
对温度和流速不敏感，可用于梯度洗脱。
检测波长：
固定波长检测器，检测波长一般固定在254和280nm；
19
5.3 荧光检测器 荧光检测器是一种灵敏度高、选择性好的检
测器。许多物质，特别是带有芳香基团的物 质具有很强的荧光活性。适合于多环芳烃、 黄曲霉毒素、卟啉类化合物、酶、氨基酸、 色素、蛋白等。 灵敏度高，检出限可达10-12～10-13g/cm3， 比紫外检测器高2～3个数量级； 可用于梯度洗脱； 但是其线性范围仅为约103。
先出柱，极性大的组分后出柱， 适于分离极性组分。
在反相色谱中，固定液极性小于流动相极性；极性大的组分 先出柱，极性小的组分后出柱，适于分离非极性组分。
35
固定液流失 化学键合相解决了固定液流失问题。
载体表面
将不同的基团通过化学反应共 价键合到硅胶载体表面的游离 羟基上，代替涂渍的液体固定 相。
20
5.4 示差折光检测器
基于折射率随介质中 成分的变化而变化。 例如入射角不变，则 折射光的偏转角是流 动相中成分浓度变化 的函数。因此，测量 折射角偏转值的大小， 就可以得到试样的浓 度。
21
第三节 HPLC的理论基础
基础理论：塔板理论和速率理论
一、塔板理论
H理L/n理
Heff L/neff
XmnaS Xanm S
Xm——流动相中的溶质分子 Xa——被吸附的溶质分子 Sa——被吸附的溶剂分子 Sm——流动相中的溶剂分子 n——被吸附的溶剂分子数
分配系 K数 [[X Xm a]][S[Sm a]]nn
吸附剂
溶质 溶剂
吸附剂
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分配系 K数 [[X Xm a]][S[Sm a]]nn谱柱 色谱柱是液相色谱的心脏部件，柱
内径4.6mm或3.9mm，长度15～ 30cm，不锈钢柱，填料颗粒5～ 10μm，柱效为7000～10000理论塔 板数/m。
发展趋势： 减小填料颗粒度（3～5μm），可
减少柱长，加快分析速度； 减小柱内径（＜1mm），降低溶
上式表明，在吸附剂上吸附能力强的组分，其分配系数较 大，保留值也较大。
例如，用硅胶作为固定相，以烷烃-氯仿作为流动相进行洗 脱，弱极性组分先出柱，强极性组分后出柱。
32
二、液液分配色谱法（LLC） 流动相和固定相都是液体。 分离机制：利用组分在两相中溶解度的差异。
流动相
组分A
组分B
阳离子交换
R S O3 H
SO3R H
阴离子交换
R
CH 2N(CH 3)3OH
C2 H N(C3 H )3R OH
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阴离子交换色谱过程可表示如下：
X m R Y Y m R X
4. 流动相传质阻力项Hm
流动阻力→
流动相在固定相之间的流路 内流速不均匀；
组分与固定相的相互作用→
靠近填料颗粒的组分分子流 速比流路中心的组分分子流 速慢。
流动相 固定相
峰宽
27
5. 滞留流动相传质阻力项Hsm
填料的微孔内所含的 流动相处于停滞状态， 组分分子在这些滞留 区停留的时间不同而 造成的峰展宽。
25
3. 固定相传质阻力项Hs
试样分子在流动相和固定相之间进行传质时，由于平衡过程需要一定 时间，而引起的色谱峰展宽。
流动相
流动相中的
组分分子 流动相
流动相
固定相
固定相
固定相
固定相中的 组分分子
（1）平衡态
（2）组分由固定相→流动相 （3）峰展宽
可以通过加快组分分子在固定相上的解析加以解决。例如采用化学键合相26 或小颗粒填料。
三、离子色谱法（IC） （ion-exchange chromatography and ion pair chromatography)
四、尺寸排阻色谱法（SEC） （ size exclusion chromatography）
30
一、液固吸附色谱法（LSC）
流动相为液体，固定相为固体吸附剂。根据不同组分在固定 相上的吸附能力不同而加以分离。
GC能检测的物质占有机物总数的20% HPLC：适于溶解后能制成溶液的样品（包括有机介质溶
液），不受样品挥发性和热稳定性的限制，对分子量大、难 气化、热稳定性差的生化样品及高分子和离子型样品均可检 测
HPLC能检测的样品占有机物总数的80%
4
2．流动相不同 GC：流动相为惰性，气体组分与流动相无亲合作用力，只
5
三、HPLC的特点和实际应用
1、利用其高柱效（n=104塔板/米），有效分离复杂体系中 的痕量组分。
正相色谱分离有机溶剂中的物质 反相色谱分离水溶液中的物质——生化物质。 2、用离子型固定相建立的离子交换色谱和离子对色谱法分
析离子型待测物的含量。（蛋白质、氨基酸、常见阴阳离子 等） 3、利用多孔凝胶固定相建立空间排阻色谱法可分离高分子 化合物。 4、利用手性固定相可以拆分分离具有手性的化合物。
剂用量，提高检测浓度。
色谱柱
填料
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5. 检测器 理想的检测器应具有灵敏度高、重现性好、响应快、
线性范围宽、使用范围广、对流动相流量和温度波 动不敏感、死体积小等特性。 HPLC常用的检测器有： 紫外检测器 光电二极管阵列检测器 荧光检测器 示差折光检测器 电化学检测器 蒸发光散射检测器
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第二节 高效液相色谱仪
一、高效液相色谱法流程图
贮液器
数据处理与 显示系统
高压泵
梯度洗脱 装置
进样器
色谱柱
检测器
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1. 高压泵
HPLC利用高压泵输送流动相通过整个色谱系统。由于色谱 柱很细（直径1～6mm），固定相颗粒极细（直径5～ 10μm），因此柱阻力很大，必须有很高的柱前压力，才能 达到快速高效的分离。
第七章 高效液相色谱法
High Performance Liquid Chromatography HPLC
气相色谱中的“气相”代表什么意思？ 气相色谱：流动相是气体 液相色谱：流动相是液体
2
第一节 高效液相色谱法的特点
易漏液且重复性差。 （2）六通阀进样 可直接向压力系统内进样而不必停止流动相的流动。进样体
积准确，重现性好。
12
六通阀
高压泵
进样前
色谱柱
进样中 （Load）
Hs——固定相传质阻力项 Hm——流动相传质阻力项
传质阻力项
Hsm——滞留流动相传质阻力项
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1. 涡流扩散项He 减小粒度，提高柱内填料装填的均匀性可以降低He
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2. 分子扩散项Hd(纵向扩散项) 组分在液体中的扩散系数比在气体中的要小4～5个数量级， 所以Hd对液相色谱峰的展宽影响可以忽略，而在气相色谱 中此项却很重要。
高压：15-35 MPa 高效：大于30000塔板/米 高灵敏：10-9g （紫外检测）、10-11g （荧光检测）
3
二、HPLC与GC差别
1．分析对象不同 GC：适于能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品；但对
高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型及高聚物的样品， 尤其对大多数生化样品不可检测
在于可能引起基线漂移。
10
梯度洗脱分为高压梯度洗脱和低压梯度洗脱两类： 高压梯度洗脱：利用两台高压泵将溶剂增压后输入
梯度混合室，加以混合后送入色谱柱 低压梯度洗脱：在常压下先将溶剂按程序混合后，
再用泵增压送入色谱柱。 目前多采用低压梯度洗脱。
11
3. 进样装置
好的进样装置应满足： 样品被瞬时注入到色谱柱的柱头中心形成一个小“点”，重
可变波长检测器，波长可变，类似于紫外分光光度计；
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5.2 光电二极管阵列检测器（photo-diode array detector， DAD） 紫外检测器的重要进展； 光电二极管阵列检测器：1024个二极管阵列，各检 测特定波长，计算机快速处理，三维立体谱图，如 图所示。
17
18
峰宽
28
HPLC法中分离条件的选择
提高柱效→减小塔板高度H 1. 固定相与装柱方法的选择： 选粒径小的、分布均匀的球形固定相 （粒径≤10μm） 首选化学键合相，匀浆法装柱 2. 流动相及其流速的选择： 选粘度小、低流速的流动相——甲醇，约1ml/min 3. 柱温的选择： 选室温25℃左右
tR’——调整保留时间
W1/2——半峰宽
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二、速率理论
Giddings等提出的液相色谱速率方程如下：
H H e H d H s H m H sm
H——塔板高度 He——涡流扩散项 Hd——分子扩散项，又称纵向扩散项
塔板高度越小，则单位长度 的色谱柱具有的塔板数越多， 柱效越高。
高压泵应满足以下要求：
较高的输出压力，30～50MPa。 输出流量精确度高，并有较大调节范围。分析型HPLC
流量为0.1～10mL/min，制备型为50～100mL/min。 输出压力要平稳。否则检测器噪声将增大。
密封性好，便于更换溶剂，耐腐蚀。
高压泵示意图.swf
8
高压泵分为恒流泵和恒压泵两类。 恒压泵：流量受柱压影响，不稳定。 恒流泵：流量不受柱压影响。常用的类型是
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5.1 紫外检测器
紫外检测器.swf
是HPLC广泛使用的检测器，其检测原理与紫外可 见分光光度计相同。
结构简单；
测量池体积在5～10μL之间，但是光路长5～10mm；
灵敏度高，最小检测浓度达10-9g/mL；
对温度和流速不敏感，可用于梯度洗脱。
检测波长：
固定波长检测器，检测波长一般固定在254和280nm；
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5.3 荧光检测器 荧光检测器是一种灵敏度高、选择性好的检
测器。许多物质，特别是带有芳香基团的物 质具有很强的荧光活性。适合于多环芳烃、 黄曲霉毒素、卟啉类化合物、酶、氨基酸、 色素、蛋白等。 灵敏度高，检出限可达10-12～10-13g/cm3， 比紫外检测器高2～3个数量级； 可用于梯度洗脱； 但是其线性范围仅为约103。
先出柱，极性大的组分后出柱， 适于分离极性组分。
在反相色谱中，固定液极性小于流动相极性；极性大的组分 先出柱，极性小的组分后出柱，适于分离非极性组分。
35
固定液流失 化学键合相解决了固定液流失问题。
载体表面
将不同的基团通过化学反应共 价键合到硅胶载体表面的游离 羟基上，代替涂渍的液体固定 相。
20
5.4 示差折光检测器
基于折射率随介质中 成分的变化而变化。 例如入射角不变，则 折射光的偏转角是流 动相中成分浓度变化 的函数。因此，测量 折射角偏转值的大小， 就可以得到试样的浓 度。
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第三节 HPLC的理论基础
基础理论：塔板理论和速率理论
一、塔板理论
H理L/n理
Heff L/neff
XmnaS Xanm S
Xm——流动相中的溶质分子 Xa——被吸附的溶质分子 Sa——被吸附的溶剂分子 Sm——流动相中的溶剂分子 n——被吸附的溶剂分子数
分配系 K数 [[X Xm a]][S[Sm a]]nn
吸附剂
溶质 溶剂
吸附剂
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分配系 K数 [[X Xm a]][S[Sm a]]nn谱柱 色谱柱是液相色谱的心脏部件，柱
内径4.6mm或3.9mm，长度15～ 30cm，不锈钢柱，填料颗粒5～ 10μm，柱效为7000～10000理论塔 板数/m。
发展趋势： 减小填料颗粒度（3～5μm），可
减少柱长，加快分析速度； 减小柱内径（＜1mm），降低溶
上式表明，在吸附剂上吸附能力强的组分，其分配系数较 大，保留值也较大。
例如，用硅胶作为固定相，以烷烃-氯仿作为流动相进行洗 脱，弱极性组分先出柱，强极性组分后出柱。
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二、液液分配色谱法（LLC） 流动相和固定相都是液体。 分离机制：利用组分在两相中溶解度的差异。
流动相
组分A
组分B
阳离子交换
R S O3 H
SO3R H
阴离子交换
R
CH 2N(CH 3)3OH
C2 H N(C3 H )3R OH
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阴离子交换色谱过程可表示如下：
X m R Y Y m R X
4. 流动相传质阻力项Hm
流动阻力→
流动相在固定相之间的流路 内流速不均匀；
组分与固定相的相互作用→
靠近填料颗粒的组分分子流 速比流路中心的组分分子流 速慢。
流动相 固定相
峰宽
27
5. 滞留流动相传质阻力项Hsm
填料的微孔内所含的 流动相处于停滞状态， 组分分子在这些滞留 区停留的时间不同而 造成的峰展宽。
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3. 固定相传质阻力项Hs
试样分子在流动相和固定相之间进行传质时，由于平衡过程需要一定 时间，而引起的色谱峰展宽。
流动相
流动相中的
组分分子 流动相
流动相
固定相
固定相
固定相
固定相中的 组分分子
（1）平衡态
（2）组分由固定相→流动相 （3）峰展宽
可以通过加快组分分子在固定相上的解析加以解决。例如采用化学键合相26 或小颗粒填料。
三、离子色谱法（IC） （ion-exchange chromatography and ion pair chromatography)
四、尺寸排阻色谱法（SEC） （ size exclusion chromatography）
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一、液固吸附色谱法（LSC）
流动相为液体，固定相为固体吸附剂。根据不同组分在固定 相上的吸附能力不同而加以分离。
GC能检测的物质占有机物总数的20% HPLC：适于溶解后能制成溶液的样品（包括有机介质溶
液），不受样品挥发性和热稳定性的限制，对分子量大、难 气化、热稳定性差的生化样品及高分子和离子型样品均可检 测
HPLC能检测的样品占有机物总数的80%
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2．流动相不同 GC：流动相为惰性，气体组分与流动相无亲合作用力，只
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三、HPLC的特点和实际应用
1、利用其高柱效（n=104塔板/米），有效分离复杂体系中 的痕量组分。
正相色谱分离有机溶剂中的物质 反相色谱分离水溶液中的物质——生化物质。 2、用离子型固定相建立的离子交换色谱和离子对色谱法分
析离子型待测物的含量。（蛋白质、氨基酸、常见阴阳离子 等） 3、利用多孔凝胶固定相建立空间排阻色谱法可分离高分子 化合物。 4、利用手性固定相可以拆分分离具有手性的化合物。
剂用量，提高检测浓度。
色谱柱
填料
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5. 检测器 理想的检测器应具有灵敏度高、重现性好、响应快、
线性范围宽、使用范围广、对流动相流量和温度波 动不敏感、死体积小等特性。 HPLC常用的检测器有： 紫外检测器 光电二极管阵列检测器 荧光检测器 示差折光检测器 电化学检测器 蒸发光散射检测器
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第二节 高效液相色谱仪
一、高效液相色谱法流程图
贮液器
数据处理与 显示系统
高压泵
梯度洗脱 装置
进样器
色谱柱
检测器
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1. 高压泵
HPLC利用高压泵输送流动相通过整个色谱系统。由于色谱 柱很细（直径1～6mm），固定相颗粒极细（直径5～ 10μm），因此柱阻力很大，必须有很高的柱前压力，才能 达到快速高效的分离。
第七章 高效液相色谱法
High Performance Liquid Chromatography HPLC
气相色谱中的“气相”代表什么意思？ 气相色谱：流动相是气体 液相色谱：流动相是液体
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第一节 高效液相色谱法的特点