微生物发酵法生产抗癌讲义药物紫杉醇
微生物发酵生产紫杉醇研究进展
微生物发酵生产紫杉醇研究进展摘要：综述了微生物发酵生产紫杉醇的主要研究进展，包括产紫杉醇的内生真菌的生物多样性、真菌细胞发酵生产紫杉醇的优势，同时也对如何改良内生真菌菌种性能和优化培养基组成及培养条件以提升其产紫杉醇的能力，作出了较为全面的综述。
关键字：紫杉醇，微生物发酵，内生菌，产量前言：目前国外市场上的紫杉醇仍依靠从红豆杉树皮中提炼和人工合成方法，目前并未见有第三种形式形成大规模产业化制作的报道。
紫杉醇的生产受着原材料与科技二个方面的约束，短期内无法突破。
为克服红豆杉资源匮乏和紫杉醇需要量的日益扩大的问题，人类对生产紫杉醇开展了多种多样的科学研究，涉及化学全合成、植物细胞培养、微生物转化和微生物发酵。
微生物发酵法生产紫杉醇由于具备突出优点，其研制与发展日益引起中外科研学者的普遍重视。
一、紫杉醇产生菌的研究进展（一）产紫杉醇的内生真菌的种类Stierle和Strobel等首次从短叶红豆杉的树枝上分离出一个可以形成紫杉醇的内生真菌，命名为安德列亚霉[1]。
当时这一发现对于紫杉醇的药源研究是一次重要的突破，为开发紫杉醇的物源提出了一个崭新的途径。
此后，各地研究者相继进行对产紫杉醇的内生真菌的分离操作，先后在西藏红豆杉、云南省红豆杉、东北地区红豆杉、欧洲红豆杉和中国红豆杉中分离到能形成紫杉醇的内生真菌，其寄主植被基本包括红豆杉属下的所有种类。
在国外的树木中，科学家也分离出来到了可形成紫杉醇的内生真菌。
Li等在不同种类的秃柏的韧皮部和木材部中均分离出能形成紫杉醇的内生真菌[2]。
GA等18人在同一种松树中分离出产紫杉醇的内生真菌。
这表明，产紫杉醇的内生真菌不但存在于红豆杉属植被中，在某些非红豆杉属植被中也存在，他的研究结果更拓宽了产紫杉醇的内生真菌的研究范畴。
（二）真菌发酵制备紫杉醇的优越性与过去在红豆杉植株的树皮上获得的紫杉醇比较，由内生真菌发酵制备紫杉醇有着更多的优越性，微生物发酵方法具有以下特点：（1）微生物发酵的方法易扩大化，有利于工业化生产的落地实施；（2）微生物易于通过诱变育种等方法筛选高产菌株，提高紫杉醇的产量，微生物育种及选育速度明显高于植物细胞株；（3）内生真菌生长迅速，在简单培养基中便可大量繁殖，形成丰富的发酵活性性质；（4）内生真菌在生物反应器中生长时，可人为调节各项发酵参数，使代谢路径朝着有利于紫杉醇的生产及高浓度紫杉醇的积累的方向进行。
真菌发酵法生物合成抗癌药物紫杉醇的研究
真菌发酵法生物合成抗癌药物紫杉醇的研究真菌发酵法生物合成抗癌药物紫杉醇的研究一、引言癌症是当今世界严重威胁人类健康的重大疾病之一，寻找有效的抗癌药物一直是医学和生物学领域的研究热点。
紫杉醇作为一种重要的抗癌药物，具有独特的作用机制和显著的临床疗效。
传统的紫杉醇提取方法主要依赖于从红豆杉属植物中提取，然而红豆杉生长缓慢，资源有限，这限制了紫杉醇的大量生产。
因此，探索新的紫杉醇生产方法具有重要的现实意义。
真菌发酵法生物合成紫杉醇作为一种有潜力的替代方法，受到了广泛的关注。
二、紫杉醇的结构与作用机制1. 紫杉醇的化学结构紫杉醇是一种复杂的二萜类化合物，其分子结构包含多个手性中心和独特的官能团。
它的基本结构由紫杉烷环和侧链组成，紫杉烷环是一个刚性的四环结构，侧链则连接在紫杉烷环的特定位置上。
这种复杂的结构赋予了紫杉醇独特的物理和化学性质。
2. 紫杉醇的抗癌作用机制紫杉醇主要通过促进微管蛋白聚合，抑制微管解聚，从而稳定微管结构来发挥抗癌作用。
在细胞分裂过程中，微管是构成纺锤体的重要成分，紫杉醇稳定微管的作用会导致纺锤体无法正常形成，进而阻断细胞的有丝分裂过程，使癌细胞停止增殖并最终死亡。
此外，紫杉醇还可能通过其他机制影响癌细胞的生物学行为，如调节细胞信号传导通路、诱导细胞凋亡等。
三、真菌发酵法生物合成紫杉醇的研究进展1. 产紫杉醇真菌的筛选与鉴定研究人员从自然界中广泛筛选能够产生紫杉醇的真菌。
通过对不同环境样本（如土壤、植物组织等）进行分离培养，然后利用高效液相色谱（HPLC）等分析方法检测培养物中是否含有紫杉醇。
经过大量的筛选工作，已经发现了一些能够产生紫杉醇的真菌菌株，如紫杉霉属（Taxomyces）、拟盘多毛孢属（Pestalotiopsis）等。
对这些产紫杉醇真菌进行准确的分类鉴定，有助于深入了解它们的生物学特性和代谢途径。
2. 真菌发酵条件的优化为了提高真菌发酵生产紫杉醇的产量，需要对发酵条件进行优化。
抗癌药物紫杉醇的制备、抗癌机理和应用前景
抗癌药物紫杉醇的制备、抗癌机理和应用前景摘要紫杉醇具有显著的抗癌活性和独特的作用机理，现主要用于治疗晚期乳腺癌和卵巢癌等。
紫杉醇分子结构复杂，具有特殊的三环[6+8+6]碳架和桥头双键以及众多的含氧取代基，其全合成引起国内外许多有机化学家的兴趣。
本文简述紫杉醇的制备、抗癌机理和不良反应。
关键词紫杉醇制备抗癌机理不良反应紫杉醇（Taxol）是从短叶红豆杉树皮中分离得到的一种四环二萜化合物。
1992年12月29日美国FDA正式批准紫杉醇作为治疗晚期卵巢癌的新抗癌药物。
由于该药疗效确切、副作用小，在美国上市后销售情况一直很好，并保持着20％以上的年销售增长率。
2000年该药的销售额已超过10亿美元。
紫杉醇被当今世界上公认为广谱、活性最强的抗癌药物，尤其是对子宫癌、卵巢癌、乳腺癌具有特殊的疗效，它的问世被誉为20世纪90年代国际上抗癌药三大成就之一[1]。
美国FDA已原则上同意其他国家及厂家生产紫杉醇制剂并可以作为通用名药上市，这就打破了美国施贵宝公司对该药的垄断生产。
这一决定意味着紫杉醇制剂价格将大幅下降，从而有利于广大肿瘤患者服用。
然而由于这种天然化合物资源极其有限，严重的限制了其研究和应用的进度。
同时尖锐的供需矛盾也在医学、化学和植物组织培养领域的科学家中引起了一场非同寻常的广泛研究，以增加这种化合物的来源和寻找高效、低毒、来源丰富的紫杉醇类似物。
经过40多年努力，已经取得了可喜的进展。
1紫杉醇的制备1.1天然红豆杉植物提取[2，3]紫杉醇的直接来源是从天然植物红豆杉树皮、树叶中提取。
但并不是所有品种的红豆杉树均含有紫杉醇，而且不同种类的红豆杉紫杉醇含量的多少差别非常明显。
红豆杉属植物共11种，我国有4种及1种变种，它们分别是云南红豆杉、西藏红豆杉（又名喜马拉雅红豆杉）、中国红豆杉、东北红豆杉、南方红豆杉（又名美丽红豆杉）。
紫杉醇在不同植物来源以及植物体不同部位的含量与提取分离有着直接关系。
Vidensek对东北红豆杉幼苗以及成树的不同部位中的紫杉醇含量作了分析，结果表明，成树紫杉醇的含量高低依次为：树皮>树叶>树根>树干>种子>心材。
紫杉醇发酵生产工艺
微生物发酵生产紫杉醇产品介绍及社会价值：紫杉醇是一种二萜类衍生物，是当前公认的广谱、活性强的抗癌药物之一⋯。
紫杉醇最早是wanj等于1971年从短枝红豆杉(7Ikusbreviifolia)树皮中分离得到的。
随后，schiff等证实紫杉醇具有独特的抗癌机制。
随着紫杉醇的临床应用，对其研究也逐渐深入，其主要抗癌机制为抑制肿瘤细胞的微管(Microtllbules)合成，以阻断细胞分裂，致使肿瘤体积逐渐缩小；紫杉醇还可诱导细胞凋亡，另外还有类似脂多糖(IPS)的作用，可调节机体的免疫功能。
目前国际市场上的紫杉醇仍依靠从红豆杉树皮提取及半合成，迄今为止尚未见有第三种形式形成大规模工业化生产的报道。
紫杉醇的工业生产受到了原料和技术两方面的制约，短期内难以突破。
为了解决红豆杉资源短缺与紫杉醇需求量的日益增加的矛盾，人们对生产紫杉醇进行了多方面的研究，包括化学全合成、红豆杉细胞培养及微生物发酵。
微生物发酵法生产紫杉醇因具有明显优势，其研究和开发越来越受到国内外研究学者的广泛关注。
这里提出一种运用基因工程，代谢工程，发酵工程结合的方法生产紫杉醇，该法首先将杉醇纯合成基因克隆至大肠杆菌，让其高产紫杉二烯，再把它流加至高产紫杉醇酵母的发酵罐中，运用代谢工程手段生产紫杉醇。
创新点：运用克隆方法，将合成紫杉二烯的代谢过程酶的结构基因，以及调控系列克隆至大肠杆菌，让其表达，此过程刚被Parayil Kumaran Ajikumar及其同事实现，而运用代谢工程手段让高产紫杉醇酵母利用紫杉二烯这个前体高产紫杉醇，这是没尝试但可行的。
国内外研究：1、分离菌种：最早stierle和strobel等在短叶红豆杉的枝条上分离到一种内生真菌，能够产生紫杉醇，定名为安德列亚霉。
此后，各国学者纷纷开展产紫杉醇内生真菌的分离工作，陆续从西藏红豆杉、云南红豆杉、东北红豆杉、欧洲红豆杉、中国红豆杉中分离到产紫杉醇的内生真菌，其宿主植物几乎涉及红豆杉属的各个种。
广谱抗癌药物紫杉醇概述
表了这 一成 果。紫杉醇的相对分 子质量为 ８３ ９ 熔点 ５．，
２３ 一 １℃ ， １℃ ２ ６ 具有高度亲脂性 ， 不溶 于水 ， 是近 １ Ｏ年
来发现 的一 种最有 希望 的抗癌 药物 ， 可广泛 用 于各种 肿瘤 的治疗 。
由于紫杉 醇独特 的抗癌 机制 ， 普通 抗癌 药 物无 对
能为力 的某些 晚期 肿瘤有 良好 的疗效 ， 并且对 于多种
临床 恶 性 肿 瘤 疗 效 显 著 ， 国 食 品 与 药 物 管 理 局 美
（ Ｄ ） １９ Ｆ Ａ 于 ９ ２年 ｌ ２月正 式批 准紫 杉醇 用 于临床 ， 其
英文名为 Ｐ ｃ ｔ ｅ， ａｌａ ｌ商品名为 Ｔｘｌ泰素 ＬＪ ｉｘ ａｏ， ｌ。 ２ 紫杉醇的药用价值及抗癌机理
３ 紫杉醇的获得方法
最初用于治疗 的紫 杉醇都 来源 于太平 洋红 豆 杉 ， 治疗 一个病人需要 ６棵百年树龄 的红 豆杉。为减少对 野生红豆杉资源 的破坏 ， 人们 寻求 多种途 径获 得紫杉
醇。
３ １ 从 红豆杉植 物 中提 取 ．
红 豆杉属 植 物共 １ 种 ， １
合作 ， 通过 Ｘ 一射线 分析 确定 了该 活 性成 分 的化 学 结
癌症研究所认 为是 近 １ ２ ５～ ０年来 肿 瘤化 疗 的最 重要
的进 展 之一 。
１ 紫杉醇的发现 早在 １６ ９ ３年 ， 国化 学家 瓦尼 （ ｎ． Ｃ） 美 Ｗａ ｉＭ． 和沃
尔 （ ｌ Ｍ． ） ｗａ ． Ｅ 从一 种生长 在美 国西 部大 森林 中 的太 １ 平洋杉 的树皮 和木材 中分离 到紫 杉醇粗 提物 ， 在筛 选 实验 中， 瓦尼和 沃尔发 现紫杉 醇粗提 物对 离体 培养 的 鼠肿瘤细胞 有 很 高活 性 ， 开 始分 离 这 种 活性 成 分。 并 由于该活性成分 在植 物 中含量极 低 ， 到 １７ 直 ９ １年 ， 他 们才 同杜克大学的化 学教授 姆克法 尔 （ ｃ ｈｉ Ａ Ｔ Ｍ Ｐａ． ． ） ｌ
微生物发酵法生产抗癌药物紫杉醇
• （2）由于发酵条件的限制，单位培养液中 紫杉醇的含量低
三 提高内生菌紫杉醇的产量的方法
（一）改良菌种
1. 利用常规的诱变改良菌种
2. 利用原生质体融合改良菌种 3. 利用基因工程构建工程菌
分离紫杉醇合成代谢酶类和获得它们的 cDNA 克隆，将已经构建的携 带紫杉醇合成途径关键酶基因的真菌表达载体转入高产紫杉醇内生真菌中， 获得高产紫杉醇工程菌株
高效液相色谱( HPLC)
• HPLC 是最常用的、较为有效的分析检测方 法。HPLC 不仅可以测定紫杉醇含量, 而且 还能追踪分离紫杉醇。
• 色谱条件：惠普1100系列，采用XDB-C18色谱柱 (4.6mm×250 mm，5μm)，流动相为甲醇与水混 合物(V甲醇:V水=65:35)，柱温为25℃，波长为 227 nm，流速1.0 mL/min，进样量10μL。用紫杉 醇标准品做对照。
一、紫杉醇的概况和作用机制
二.微生物发酵法生产紫杉醇的技术路线 三.提高内生菌紫杉醇的产量的方法
一、紫杉醇的概况和作用机制
红 豆 杉 树
紫杉醇（Paclitaxel,商品名Taxol）的概述：
1963年美国化学家瓦尼（M.C. Wani）和沃尔（Monre E. Wall） 首次从一种生长在美国西部大森林中称谓太平洋杉（Pacific Yew） 树皮和木材中分离到了紫杉醇的粗提物。
可通过诱变育种等手段来提高菌种性能以提高紫杉醇产量2由于发酵条件的限制单位培养液中紫杉醇的含量低利用基因工程构建工程菌分离紫杉醇合成代谢酶类和获得它们的cdna克隆将已经构建的携带紫杉醇合成途径关键酶基因的真菌表达载体转入高产紫杉醇内生真菌中获得高产紫杉醇工程菌株二优化发酵条件1
紫杉醇类抗肿瘤药物简介讲课文档
药理作用
❖ 研究证明[3]其抗癌活性成分为紫杉烷类二萜及其生物碱 ❖ 新型抗微管药物，通过促进微管蛋白聚合，抑制解聚，保持
微管蛋白稳定，抑制细胞有丝分裂。
❖ 体外实验证明紫杉醇具有显著的放射增敏作用，可能是使细胞中止
于对放疗敏感的G2和M期。
，33:15-44
第五页，共35页。
独特作用机制
紫杉醇类抗肿瘤药物简介
第一页，共35页。
紫杉醇类抗肿瘤药物
紫杉醇 多西他赛
紫杉醇脂质体
白蛋白结合型紫杉醇
第二页，共35页。
年代 1958 1967 1968 1971 1979 1983 1985 1991 1992
紫杉醇研发过程
进 展[1] NCI开始大规模植物药研发筛选 发现紫杉醇抗癌活性 从红豆杉中分离出紫杉醇 完成结构鉴定 发表作用机制 临床Ⅰ试验 临床II期 临床III期 FDA批准上市
O
Ph3
C6H5 O
18
AcO
10 11
9
O19
OH
C6H5
Ph2
N H
2'
3' 1' O OH
12
13 15 14 1
HO
2
17
16
H
8 3
7
H
4
6 5
20
O
Ph1 C6H5 O AcO
O
Paclitaxel (Taxol)
[2]Wani M, Taylor H, Wall M et al . Plant antitumor agents VI The isolation and structure of taxol , a novel antileukemic and antitumor agent from Taxus brevifolia . J Am Chem Soc ,1971,93 : 2325 -2327
抗癌药物紫杉醇的研究进展ppt课件
聚甲基丙烯酸的共聚物 2
聚谷氨酸、聚天冬氨酸衍 3 生物
4
5
O C 6 H 5 O 1 8 A c 1 1 O 1 0 9 O 1 9 O R 2 C 6 H 5 H N 3 ' O 2 ' R 1 1 ' O 1 H 2 1 O 3 1 4 1 1 5 2 1 1 7 H 6 3 8 H 4 7 2 5 6 0 O
半合成 以10-DABⅢ和Baccatin
Ⅲ作为半合成原料获得紫 杉醇
新方法用10-DAT
优点：1、原料枝叶含量丰富、 提取相 对容易，充分利用再生资源
2、产率高 3、最具实用价值可以工业化生产 4、获取紫杉醇构效关系信息，进
行结构改造
缺点：合成过程相对复杂 （11步化学转化和7步分离）
药源问题解决办法（三）
参考文献
Ramesh Panchagnula, Pharmaceutical Aspects of Paclitaxel, International Journal of Pharmaceutics.1998(172)1-15.
Oberlies NH, Kroll DJ Camptothecin and Taxol:Historic achievemetns in natural products research,Journal of Natural Products,2004 67 (2): 129-135 FEB
药效问题解决
——紫杉醇药物输送体系
脂质体
药物包封于磷脂、胆固醇等类脂质中 靶向给药新剂型
药质体：药物通过共价键与脂质结合
提高靶向性，增加稳定性
环糊精包合
提高药物的稳定性、生物相容性
大分子结合物给药系统