黑果枸杞色素最佳提取工艺研究
黑果枸杞原花青素生理功能及提取方法研究
黑果枸杞原花青素生理功能及提取方法研究马秀花1曹丽萍1肖明1袁2孙小凤2崔明明2(1.青海大学,农业农村部农产品质量安全风险评估实验室,西宁810016;2.青海大学农林科学院土壤肥料研究所,西宁810016)摘要:黑果枸杞中含量丰富的原花青素是一种有待开发的天然功能性因子。
本文介绍了黑果枸杞中原花青素的各项生理功能研究现状,并分析了当前常用的原花青素提取工艺,包括有机溶剂提取法和纤维素酶法的优缺点。
关键词:黑果枸杞;原花青素;生理功能;提取工艺;功能性产品基金项目:国家农产品质量安全风险评估项目计划(GJFP201801002)。
作者简介:马秀花(1992－),从事农产品质量安全风险评估研究。
E －mail :1624694187@ 。
肖明(1971－),副研究员,从事农产品质量安全风险评估研究。
E －mail :mhmdxiao@ (通讯作者)。
黑果枸杞(Murr )为茄科枸杞属的灌木植物,具有耐盐、耐碱、抗旱等特性,被称为植物中的“软黄金”,主要分布在我国陕西、宁夏、甘肃、青海、内蒙古、新疆、西藏等地区[1～3]。
黑果枸杞的果味甘甜,含有丰富的原花青素、多糖、花青素等功能性成分,是原花青素含量最高的植物[4～6]。
黑果枸杞原花青素主要存在于果实和种子中,由不同数量的儿茶素或表儿茶素及表儿茶素没食子酸,通过C 4－C 6或C 4－C 8缩合成不同聚合度的化合物,原花青素因聚合度、羟基的数量、位置等的不同其生物活性不同,具有清除自由基、抗脂质过氧化、抗辐射等生理功能[7～15]。
一、黑果枸杞原花青素的生理功能(一)抗氧化作用黑果枸杞原花青素的抗氧化能力主要用清除自由基的能力来判断[16]。
罗文娟等[17～19]通过研究黑果枸杞原花青素对小鼠衰老皮肤的抗氧化作用,发现黑果枸杞原花青素能够减轻紫外线照射对小鼠皮肤的氧化损伤,减轻炎症反应,延缓皮肤衰老。
朱乐玫[20]的研究结果表明,超过《食品营养标签管理规范》指定指标的不同剂量的反式脂肪酸(TFA )会导致SD 大鼠肝肾损伤,可利用黑果枸杞原花青素的抗氧化作用,对TFA 引起的肝肾损伤进行修复。
响应面法优化黑果枸杞色素的提取工艺
℃、 粗得 率为 ４ ５ ． １ ５ ．
关 键词 ： 黑果枸 杞 ；色素 ；响应 面分析 法 中图分 类号 ： Ｔ￥ ２ ０ ２ 文献 标志码 ： Ａ
Ｏｐｔ ｉ ｍｉ ｚ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ ｅ ｘ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎ ｃ ｏ ｎｄ ｉ ｔ ｉ ｏ ｎｓ ｏ ｆ ｐｉ ｇ ｍｅ ｎ ｔ ｆ ｒ ｏ ｍ Ｌｙ ｃ ｉ ｕ ｍ
２ ０ １ ５年 １ Ｏ月
文章编号 ： ｉ ｏ ｏ ｏ 一 ５ ８ １ １ （ ２ ０ １ ５ ） ０ ５ — ０ １ １ ０ — ０ ５
响 应 面 法 优 化 黑 果 枸 杞 色 素 的 提 取 工 艺
刘树 兴 ， 赵 广 蒙 ，杨 麒
（ 陕西科技大学 食品与生物工程学院 ， 陕 西 西 安 ７ １ ０ ０ ２ １ ）
ｏ ｌ ｏ ｇ ｙ ｂ ａ ｓ ｅ ｄ ｏ ｎ ｓ ｉ ｎ ｇ ｌ ｅ ｆ ａ ｃ ｔ ｏ ｒ ｉ ｎ ｖ ｅ ｓ ｔ ｉ ｇ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｓ ｆ ｏ ｒ ａ ｃ ｈ ｉ ｅ ｖ ｉ ｎ ｇ ｍａ ｘ ｉ ｍｕ ｎ ｔ ｈ ｅ ｐ ｉ ｇ ｍｅ ｎ ｔ ｅ ｘ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎ
黑果枸杞色素的提取工艺研究
１Ｕ Ｅｒ ｘ ｎ ｔａ － ｕ ｅ ｌ
蛐 唱Ｔｅ ｎ ￣ ｙ ｏ Ｐｇ ｎ ｅ ｕ ａ ｎ ｕ Ｗ ￣ ｅｈ ｏ ｆ ｉ ｔ ｆ ｙ ／ｎｒ ￣ ／ ｎ／ ｕｒ ｍｅ ｏ Ｌ ｔ ｕ ａ ｒ
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Ｏ５ Ｉ于 ５ Ｉ 容量 瓶 中 ， 蒸 馏水 定容 至 刻度 ， 匀 ， ．Ｉ １ ｌ ＯＩ １ ｌ 用 摇 以蒸 馏水 为空 白参 比 ， ９ ｍ处 测定 其 吸光度值 。 ３ ０ｎ １２４ 提 取条 件 的考 察 。选 用 ７ ％的 乙醇浸 提 ， 用 正 ．． ４ Ｊ ５ 采
表１ 正交试验 因素及水平
于盐碱土荒地 、 池地或路旁 ， 分布范围较广， 对盐渍土壤有很 强的适应性。根据《 晶珠本草》 记载， 黑果枸杞味甘、 性乎 ， 清
心热 ， 于治 疗 心 热 病 、 脏 病 、 经不 调 、 经 等 病 症 ＿。 用 心 月 停 ２ Ｊ 笔 者采用正交试 验设计选择 黑果枸 杞 色素提取 的优 化工 艺 ，
（． １新疆 生产建设兵团塔里木大学畜牧科技重点实验室 ， 新疆 阿拉 尔 ８３０ ；． ４ ３０２ 塔里木大学动物科技学院 ， 新疆阿拉尔 ８３０ ） ４３０
摘要 选 用 ７％ 乙醇作提 取溶 剂 ， ５ 采用 正交设计试 验 ， 究提 取温度 、 研 提取 时 间和料 液 比对黑 果枸杞 色素提取 条件 的 影响 。结果表 明 ， 黑果枸杞 色素提取 的优 化 工艺条件为 温度 ６ ， 问 ３ ｍｎ 料液 比 ｌ２。该条件 下 色素粗 品得率 为 ６ ２ ｏ℃ 时 ０ ｉ， ：０ ５６ ％。 关键词 黑果枸杞 ；色素 ； 取工 艺 提 中图分类号 Ｑ ４． ７７ ９９７ ． ７ 文献标 识码 Ａ 文章 编号 ０１ — ６ １ １７０ — １１ — ２ ６７ ６１（３ ）４ ０１１ ０ ２０
黑果枸杞花色苷提取工艺优化及抗氧化研究
2023年7月四川大学学报(自然科学版)J u l .2023第60卷 第4期J o u r n a l o f S i c h u a nU n i v e r s i t y (N a t u r a l S c i e n c eE d i t i o n )V o l .60 N o .4黑果枸杞花色苷提取工艺优化及抗氧化研究薛海瑞1,李国秀1,孙意冉1,王韬宇1,樊云芳2,唐 琳1(1.四川大学生命科学学院生物资源与生态环境教育部重点实验室,成都610065;2.宁夏农林科学院枸杞研究所,银川750000)摘 要:为探究黑果枸杞花色苷最佳提取工艺和抗氧化活性,采用超声酶辅助提取法、乙醇/硫酸铵双水相萃取法、乙醇/磷酸二氢钠双水相萃取法提取黑果枸杞花色苷,通过响应面优化提取工艺,并使用-B H P 诱导B R L3A 细胞建立抗氧化模型来探索黑果枸杞花色苷的氧化应激保护作用.结果表明,超声酶辅助提取得率为:(17.92±0.04)m g /g ;乙醇/硫酸铵双水相萃取得率为:(15.46±0.31)m g /g ;乙醇/磷酸二氢钠双水相萃取得率为:(15.02±0.19)m g /g.体外抗氧化实验表明,乙醇/硫酸铵双水相萃取的花色苷(L R N )抗氧化活性最强,纯化后的乙醇/硫酸铵双水相萃取的花色苷(L R N A )可通过减少细胞中R O S 的产生来缓解t -B H P 诱导的氧化损伤.综上所述,该工艺便捷、稳定可用于黑果枸杞花色苷的提取,同时证明了L R N 抗氧化活性最强.关键词:黑果枸杞;花色苷;响应面;抗氧化;活性氧;中图分类号:Q 949.95 文献标识码:A D O I :10.19907/j.0490-6756.2023.046004收稿日期:2022-10-21基金项目:宁夏回族自治区重点研发计划(2022B B F 0100103)作者简介:薛海瑞(1997-),男,山西省太原人,硕士研究生,主要研究领域为药用天然产物.通讯作者:唐琳:R e s e a r c ho no pt i m i z a t i o no f t h e e x t r a c t i o n p r o c e s s a n da n t i o x i d a n t a c t i v i t y o f a n t h o c ya n i n s f r o m M u r r .1,1,1,1,2,1(1.K e y L a b o r a t o r y o f B i o -R e s o u r c e a n dE c o -E n v i r o n m e n t o fM i n i s t r y ofE d u c a t i o n ,C o l l e g e o f L i f eS c i e n c e s ,S i c h u a nU n i v e r s i t y ,C h e n gd u 610065,C h i n a ;2.L y c i u mB a r b a r u m Re s e a r c h I n s t i t u t e ,N i n g x i aA c a d e m y o fA g r i c u l t u r a l a n dF o r e s t r y Sc i e n c e s ,Y i n c h u a n 750000,C h i n a )A b s t r a c t :T o i n v e s t i g a t e t h e o p t i m a l e x t r a c t i o n p r o c e s s a nd a n t i o x i d a n t a c t i v i t y o f a n t h o c ya n i n s o f M u r r .,t h e a n t h o c y a n i n s o f M u r r .w e r e e x t r a c t e db y ul t r a s o n i c e n -z y m e -a s s i s t e de x t r a c t i o n ,e t h a n o l /a m m o n i u ms u l f a t e a q u e o u s t w o -ph a s e e x t r a c t i o n ,e t h a n o l /s o d i u md i -h y d r o g e n p h o s p h a t e a q u e o u s t w o -p h a s e e x t r a c t i o n ,a n d t h e e x t r a c t i o n p r o c e s sw a s o p t i m i z e d b y r e s p o n s e s u r f a c em e t h o d o l o g y ,t h e a n t i o x i d a n tm o d e l o f B R L3Ac e l l s i n d u c e db y -B H Pw a s u s e d t o e x p l o r e t h e pr o t e c t i v e e f f e c t o f M u r r .a n t h o c ya n i n s o n o x i d a t i v e s t r e s s .T h e r e s u l t s s h o w e d t h a t t h e y i e l d o f u l t r a s o n i c e n z y m e a s s i s t e d e x t r a c t i o nw a s (17.92±0.04)m g /g ;t h e y i e l d o f e t h a n o l /a m m o -n i u ms u l f a t e a q u e o u s t w o -p h a s e e x t r a c t i o nw a s (15.46±0.31)m g /g;t h e e x t r a c t i o n y i e l do f e t h a n o l /s o d i u md i h y d r o g e n p h o s p h a t e a q u e o u s t w o -p h a s es y s t e m w a s (15.02±0.19)m g /g.T h e i nv i t r oa n -t i o x i d a n t e x p e r i m e n t s s h o w e d t h a t t h e a n t i o x i d a n t a c t i v i t y o f a n t h o c y a n i n s (L R N )e x t r a c t e db y E t O H /(N H 4)2S O 4a q u e o u s t w o -p h a s ee x t r a c t i o nw a s t h es t r o n g e s t ,p u r i f i e dE t O H /(N H 4)2S O 4a qu e o u s t w o -第60卷 四川大学学报(自然科学版) 第4期p h a s e e x t r a c t i o no fa n t h o c y a n i n s(L R N A)c a na l l e v i a t e-B H P-i n d u c e do x i d a t i v ed a m a g eb y r e d u c i n g R O S p r o d u c t i o n i n c e l l s.I n s u m m a r y,t h i s p r o c e s s i s c o n v e n i e n t a n d s t a b l e a n d c a nb eu s e d f o r t h e e x-t r a c t i o no f a n t h o c y a n i n s f r o m M u r r.A t t h e s a m e t i m e,i t a l s o p r o v e s t h a tL R Nh a s t h e s t r o n g e s t a n t i o x i d a n t a c t i v i t y.K e y w o r d s:M u r r.;A n t h o c y a n i n s;R e s p o n s e s u r f a c e;A n t i o x i d a n t;R O S1 引 言黑果枸杞(M u r r.)为茄科枸杞属植物,是我国西北地区特有的耐旱、耐碱、耐盐生灌木植物.其果实中含有丰富的花青素、类胡萝卜素、维生素等多种营养成分[1],关于黑果枸杞化学成分的研究目前主要有多糖类、黄酮类、花色苷类、生物碱类、精油和脂肪酸类,现代药学研究表明,黑果枸杞具有抗氧化、抗疲劳、降血糖、降血脂、保肝护肾、免疫调节[2-4].花色苷是黑果枸杞中重要的抗氧化活性成分,目前已知的黑果枸杞花色苷种类主要有:飞燕草素、矮牵牛素、矢车菊素、天竺葵素、芍药素等以及衍生的糖苷[5].前人对花色苷物质进行了大量的活性研究,包括抗氧化、降血脂、抗衰老、抗肿瘤、抑菌等活性研究,但当前对黑果枸杞花色苷提取工艺的研究不够全面,存在的问题主要是花色苷得率较低、目的物质失活、提取物杂质成分较多难以获取较高纯度花色苷、提取成本较高且污染较大等[6,7],如何高效经济的获取高纯度花色苷是研究重点.提取花色苷的常用方法主要有有机溶剂萃取法、超临界流体萃取法、微波提取法、超声波辅助提取法、生物酶辅助提取法等,随着生物学提取工艺的发展,现在单一的提取方法并不能满足对活性成分得率高、活性强的需求,双水相萃取法由于得率较高、经济环保、且有一定的纯化作用逐渐应用到花色苷的提取中[8].响应面作为一种优化提取的方法,它将提取实验中目的物质得率作为一个或多个因素(如料液比、乙醇浓度等)的函数,并通过图形将这种函数关系直观的体现出来,并提供最优的提取方案,此方法普遍应用于中药活性成分的提取工艺研究中[9].在本实验室以往的研究中对比了青海、甘肃、宁夏、新疆等地黑果枸杞花色苷的含量,其中青海省最高,所以本实验以青海省黑果枸杞为实验材料,通过超声酶辅助提取、乙醇/硫酸铵双水相萃取、乙醇/磷酸二氢钠双水相萃取提取黑果枸杞花色苷,并通过响应面对提取工艺进一步优化获取最佳提取工艺,为后续的工业提取提供理论参考.目前对双水相萃取得到的花色苷抗氧化能力研究较少,且针对黑果枸杞不同提取方法所得花色苷体外抗氧化能力对比研究的资料缺乏.因此本研究采用体外抗氧化及细胞实验探究不同提取方法得到的花色苷样品体外抗氧化效果以及对-B H P 诱导的正常大鼠肝细胞(B R L3A)氧化应激损伤的保护作用,为后续的机制研究提供参考资料.2 材料与方法2.1 材料与仪器以青海省的黑果枸杞为实验材料,经四川大学生命科学学院白洁副教授鉴定为茄科枸杞属黑果枸杞.纯化后超声酶辅助法花色苷(L R E A)、纯化后E t O N/(N H4)2S O4双水相萃取花色苷(L R N A)、纯化后E t O H/N a H2P O4双水相萃取花色苷(L R-P A)由本实验室提供.大鼠肝细胞系(B R L3A)为本实验室所冻存;乙醇、V C、磷酸二氢钠、硫酸铵、铁氰化钾、三氯乙酸、三氯化铁、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(B H T)等试剂均为分析纯(成都市科龙试剂化工厂);纤维素酶、果胶酶购买于成都瑞芬思公司;D ME M培养基、磷酸盐缓冲液(P B S)、胰蛋白酶均购于美国H y c l o n e公司,胎牛血清购于塞尔博克斯生物制品有限公司;D CF H-D A荧光探针购于南京建成生物工程研究所;D P P H和A B T S购于S i g m a-A l d r i c h中国公司;水为超纯水.M S半微量电子精密分析天平(瑞士M e t t l e r-T o l e d o公司);离心机H1850型(长沙湘仪离心机仪器有限公司);冷冻干燥机(宁波市鄞州仪器有限公司);p H 计(希玛科技有限公司);K H-300D B型数控超声波清洗器(昆山禾创超声仪器有限公司).2.2 方 法2.2.1 超声酶辅助提取单因素实验 固定各因素变量为酶添加量1.0m g/g、70%乙醇(v/v)、料液比25m L/g、温度45℃、p H3.0、时间30m i n;选择超声提取时间、液料比、乙醇浓度为个因素;时第4期 薛海瑞,等:黑果枸杞花色苷提取工艺优化及抗氧化研究 第60卷间(10m i n、20m i n、30m i n、40m i n、50m i n);液料比(15、20、25、30、35m L/g);乙醇浓度(50%、60%、70%、80%、90%),采用p H示差法测定花色苷含量[10],每组实验重复3次.2.2.2 双水相萃取单因素实验 固定各因素变量为24%乙醇、液料比25m L/g、温度45℃、p H3.0、时间30m i n、硫酸铵质量分数24%、磷酸二氢钠质量分数24%;选择乙醇质量分数、萃取时间、硫酸铵质量分数、磷酸二氢钠质量分数为4个因素;乙醇质量分数(20%、22%、24%、26%、28%);萃取时间(20m i n、30m i n、40m i n、50m i n、60m i n);硫酸铵质量分数(21%、22%、23%、24%、25%);磷酸二氢钠质量分数(20%、22%、24%、26%、28%),花色苷含量测定同2.2.1,每组实验重复3次.2.2.3 B o x-B e h n k e n法优化实验 根据单因素实验的实验结果选择提取时间-液料比-乙醇浓度、乙醇浓度-萃取时间-硫酸铵质量分数、乙醇浓度-萃取时间-磷酸二氢钠为超声辅助提取法(L R E)、乙醇/硫酸铵双水相萃取法(L R N)、乙醇/磷酸二氢钠双水相萃取法(L R P)的自变量,以花色苷含量作为响应值[11],花色苷含量测定同2.2.1,利用D e s i g n-E x p e r t8.0.6软件,根据B o x-B e h n k e n法设计三因素三水平的响应面,设计实验因素水平见表1~3.每组实验重复3次.表1 实验因素水平及编码T a b.1 E x p e r i m e n t a l f a c t o r l e v e l s a n d c o d i n g编码因素水平A液料比/(m L/g)B提取时间/m i nC乙醇浓度/%-1232565 0253070 1273575表2 实验因素水平及编码T a b.2 E x p e r i m e n t a l f a c t o r l e v e l s a n d c o d i n g编码因素水平A乙醇质量分数/%B萃取时间/m i n C硫酸铵质量分数/%-122302202435231264024 2.2.4 D P P H自由基清除实验 准确移取2m L 样品溶液(~m LD P P H乙醇溶液(0.1m o l/L),摇匀后,避光放置30m i n,以无水乙醇作空白对照,V C做阳性对照测517n m波长处吸光度,平行测定3次.D P-P H自由基清除率=[1-(-)/]×100%其中,代表实验组吸光度值,代表样品本底吸光度值,代表空白组吸光度值[12]棶表3 实验因素水平及编码T a b.3 E x p e r i m e n t a l f a c t o r l e v e l s a n d c o d i n g编码因素水平A乙醇质量分数/%B萃取时间/m i nC磷酸二氢钠质量分数/% -122302402435261264028 2.2.5 A B T S自由基清除实验 准确移取2m L 样品溶液(6.25~200μg/m L)至试管内,与A B T S 自由基溶液等体积混合,以无水乙醇作空白对照, V C做阳性对照,室温反应30m i n.用酶标仪测定734n m处的吸光值[13].A B T S自由基清除能力计算公式同“2.2.1”项.2.2.6 总还原力测定 先加入25μL不同浓度(6.25~200μg/m L)的样品溶液、B H T,25μL的无水乙醇,分别作为实验组、阳性对照组及空白组.每组再加入50μLP B S溶液(0.2m o l/L、p H6.6)和25μL1%的铁氰化钾水溶液,震荡摇匀,45℃孵育1h.最后加入50μL10%的三氯乙酸和60μL0.1%的三氯化铁,震荡摇匀,在700n m处用酶标仪测定各反应液的吸光值,总还原力的强弱与吸光值大小呈正比[14].2.2.7 细胞培养 大鼠肝细胞系B R L3A细胞用D ME M低糖培养基(培养基中含有1%青霉素-链霉素、10%胎牛血清)置于37℃细胞培养箱中培养,C O2浓度为5%.待细胞汇合度达到约80%~ 90%时,将细胞传代培养,然后取处于对数生长期的细胞进行后续实验.2.2.8 -B H P诱导B R L3A细胞损伤模型的建立 取处于对数生长期的B R L3A细胞,经胰酶消化后,用D M E M低糖培养基重悬为单细胞悬液,以4×104细胞/m L接种于96孔板中,每孔加100μL 细胞悬液,过夜培养,待细胞汇合度达到70%~ 80%后吸出培养基,进行后续实验.实验分组如下: (1)对照组:加入100μL无血清培养基继续培养;含不同浓度第60卷 四川大学学报(自然科学版) 第4期300、400、500、600、700、800和900μm o l/L)的无血清培养基.每组设置3个复孔,于细胞培养箱中培养2h后,吸去培养基,每孔加入100μL含10%C C K-8的无血清培养基,于细胞培养箱中避光孵育1h,用酶标仪测定各孔在450n m处的吸光值,细胞存活率用模型组/对照组×100%表示. 2.2.9 细胞毒性实验 细胞前期处理同2.2.8.实验分组如下:(1)对照组:加入100μL无血清培养基继续培养;(2)实验组:加入100μL含不同浓度花色苷样品(25~200μg/m L)的无血清培养基.每组设置3个复孔,于细胞培养箱中培养24h后,后续测定步骤同2.2.8,细胞存活率用实验组/对照组×100%表示.2.2.10 细胞保护实验 细胞前期处理同2.2.8.实验分组如下:(1)对照组:加入100μL无血清培养基继续培养,培养12h后,再加入100μL无血清培养基继续培养2h;(2)药物组:加入100μL 无血清培养基,培养12h后,再加入100μL含200μm o l/L-B H P的无血清培养基处理2h;(3)实验组:加入100μL含不同浓度花色苷样品(10~100μg/m L)的无血清培养基处理细胞12h,再加入100μL含200μm o l/L-B H P的无血清培养基处理2h.后续测定步骤同2.2.8,细胞存活率分别用药物组/对照组×100%和实验组/对照组×100%表示.2.2.11 活性氧检测 取处于对数生长期的B R L 3A细胞,以5×104细胞/m L接种于12孔板中,每孔加1m L细胞悬液.过夜培养后吸出培养基,P B S 清洗细胞2次.对照组和模型组加入500μL无血清培养基,实验组加入500μL含L R N、L R N A(60μg/m L)无血清培养基,在培养箱培养12h后,对照组继续加入500μL的无血清培养基,模型组和实验组均加入500μL含200μm o l/L-B H P的无血清培养基,继续培养2h后,吸去培养基,P B S清洗两次,对照组、模型组和实验组均加入500μL10μm o l/L的D C F H~D A探针,在37℃避光中染色30m i n用倒置荧光显微镜观察各组细胞荧光强度的变化.细胞培养操作同上,将细胞收集转移到流式专用管,用流式细胞仪检测细胞R O S含量变化情况,并用F l o w J o软件进行分析.2.2.12 细胞线粒体膜电位变化检测 取对数生长期的B R L3A细胞以5×104细胞/m L的密度接种于孔板,培养μL无血清培养基,实验组加入500μL60μg/m L 的L R N、L R N A预处理4h,再加入200μm o l/L-B H P损伤2h,吸走培养液,用500μLP B S漂洗2次,每孔加入500μLJ C-10染液,于室温避光孵育30m i n,吸走染液,用P B S洗去未结合的J C-10染液,每孔加入500μL无血清培养基,在倒置荧光显微镜下观察并拍照.细胞培养操作同上,将细胞收集转移到流式专用管,用流式细胞仪检测细胞线粒体膜电位变化情况,并用F l o w J o软件进行分析.3 结果与分析3.1 黑果枸杞花色苷提取单因素实验采用2.2.1所述方法,超声酶辅助提取法图1a~1c表明,乙醇浓度70%,提取时间为30m i n,液料比为25m L/g条件下花色苷的提取效果最好.在50%~90%浓度范围内,提取溶剂的极性由大变小,提取溶剂的渗透力由小变大.超声时间过短,不利于黑果枸杞细胞内花色苷的释放;时间过长,花色苷的分子结构会受到超声所产生的机械能量的破坏,降低花色苷的提取含量.液料比过低在一定的时间内不能完全溶解花色苷,所以在15~ 25m L/g范围内,花色苷的含量逐渐上升.乙醇/硫酸铵双水相萃取法图1d、1e和1f 表明,乙醇质量分数为24%,硫酸铵质量分数为23%,萃取时间30m i n时花色苷的提取含量达到最大.当乙醇质量分数为24%时体系极性刚好与黑果枸杞花色苷相近,极性过高过低都不利于花色苷的释放.硫酸铵质量分数过高,下相无机盐富集相争夺水分子相较上相乙醇溶液增强,导致上相乙醇富集相极性下降,花色苷是高极性物质,因此花色苷提取含量下降.随萃取时间的延长,花色苷含量逐渐上升,30 m i n后花色苷含量随时间的延长而逐渐减少.可能是较长的萃取时间伴随超声作用所产生的机械能量会使花色苷结构受到破坏,从而引起花色苷提取含量下降.乙醇/磷酸二氢钠双水相萃取法图1f、1g和1i 表明,乙醇质量分数为24%,磷酸二氢钠质量分数为26%,萃取时间在30m i n时花色苷含量最高.当硫酸铵质量分数超过26%时,花色苷的提取含量出现下降趋势,原理与E t O H/(N H4)2S O4双水相体系相似,但是花色苷含量最大值对应的无机盐质量分数不同,可能是因为磷酸二氢钠较硫酸铵更第4期薛海瑞,等:黑果枸杞花色苷提取工艺优化及抗氧化研究第60卷溶于水.萃取时间在30~40m i n 含量几乎没有变化,但随着萃取时间延长,40m i n 后花色苷含量有所下降,可能是因为萃取时间延长伴随超声产生的机械能量破坏花色苷结构,导致花色苷降解,从而使花色苷含量降低.图1 黑果枸杞花色苷提取单因素实验(a )提取溶剂浓度对花色苷含量的影响;(b )提取时间对花色苷含量的影响;(c )液料比对花色苷含量的影响;(d)乙醇质量分数对花色苷含量的影响;(e )硫酸铵质量分数对花色苷含量的影响;(f )萃取时间对花色苷含量的影响;(g)乙醇质量分数对花色苷含量的影响;(h )磷酸二氢钠质量分数对花色苷含量的影响;(i )萃取时间对花色苷含量的影响F i g .1 S i n g l e f a c t o r e x p e r i m e n t o n t h e e x t r a c t i o no f a n t h o c y a n i n s f r o m M u r r .(a )I n f l u e n c e o f e x t r a c t i o n s o l v e n t c o n c e n t r a t i o no n a n t h o c y a n i n c o n t e n t ;(b )i n f l u e n c e o f e x t r a c t i o n t i m e o n a n t h o c ya n i n c o n t e n t ;(c )i n f l u e n c e o f l i q u i d t o s o l i d r a t i o o n a n t h o c y a n i n c o n t e n t ;(d )i n f l u e n c e o f e t h a n o l m a s s f r a c t i o n o n a n t h o c y a n i n c o n t e n t ;(e )i n f l u e n c e o fm a s s f r a c t i o no f a m m o n i u ms u l f a t e o n a n t h o c y a n i n c o n t e n t ;(f )e f f e c t o f e x t r a c t i o n t i m e o n a n t h o c y a n i n c o n t e n t ;(g)e f f e c t o f e t h a n o lm a s s f r a c -t i o no n a n t h o c y a n i n c o n t e n t ;(h )i n f l u e n c e o fm a s s f r a c t i o n o f s o d i u md i h y d r o g e n p h o s p h a t e o n a n t h o c ya n i n c o n t e n t ;(i )i n f l u e n c e o f e x t r a c -t i o n t i m e o n a n t h o c ya n i n c o n t e n t 3.2 黑果枸杞花色苷提取工艺优化3.2.1 超声酶辅助提取工艺优化 实验方案设计及结果如表4,经D e s i g n -E x pe r t 8.0.6软件回归拟合,得到二次多项回归方程:花色苷含量(m g /g)=13.22+0.29+0.21+0.36-0.11-0.055+0.027-0.672-0.452+0.0002.由方程可知,表示方程所对应的曲线是开口向下的抛物线,抛物线的最高点为花色苷含量最大值点各提取因素对花色苷提取含量的影响程度可以由此方程中各单项系数绝对值的大小反映,值越大,影响程度越重要.各提取因素影响的重要程度为:(乙醇浓度)>(液料比)>(提取时间).由表5可知,0.01<<0.05代表模型差异显著;失拟项(=0.3207>0.05)不显著,表明模型能有效模拟实际情况;矫正2=0.8361能够说明花色苷含量的变化一次项影响显著,第60卷 四川大学学报(自然科学版) 第4期A、B影响不显著,交互项影响不显著,二次项2、2影响显著.说明此法对花色苷提取含量影响最大的因素是乙醇浓度.表4 响应面试验结果T a b.4 R e s u l t o f r e s p o n s e s u r f a c e t e s t序号液料比/(m L/g)提取时间/m i n乙醇浓度/%花色苷含量/(m g/g)实际值预测值100013.4613.47 2-10013.1213.19 300013.4613.47 40-1-113.1013.02 500013.5013.47 600013.4813.47 7-1-1-112.8612.87 8-11113.2313.11 9-10013.1213.16 1010013.3113.24 1111113.2013.19 1201113.2913.35 1300013.4713.47 1401113.1913.27 150-1-113.1413.08 1610013.2813.23 171-1-112.7912.91表5 回归模型方差分析T a b.5 V a r i a n c e a n a l y s i s o f r e g r e s s i o nm o d e l 方差来源平方和自由度均方值值显著性M o d e l5.0390.5610.070.0030* -液料比0.6710.6712.010.0105-提取时间0.3510.356.350.0398-乙醇浓度1.0611.0619.050.0033*0.05110.0510.910.37160.01210.0120.220.65493.025E-313.025E-30.0540.822221.8911.8934.020.0006*20.8410.8415.180.0059*20.00010.0000.0001.0000R e s i d u a l0.3970.056L a c ko f F i t0.2130.0711.610.3207P u r eE r r o r0.1840.044C o rT o t a l5.421620.9283校正20.8361*(0.01<<0.05),差异显著应用D e s i g n-E x p e r t8.0.6软件求解经过优化的回归方程得出,当提取温度为45℃,纤维素酶添加量为1.0m g/g时,超声酶辅助提取黑果枸杞花色苷的最佳工艺条件为:液料比25.07m L/g,提取时间30m i n,乙醇浓度75%.修正条件为:液料比25m L/g,提取时间30m i n,乙醇浓度75%.在此条件下提取得到的花色苷含量为(17.92±0.02) m g/g,与预测值基本相近,说明此响应面得出的最优条件是可行的.3.2.2 乙醇棷硫酸铵双水相萃取工艺优化 实验方案设计及结果如表6,经D e s i g n-E x p e r t8.0.6软件回归拟合,得到二次多项回归方程:花色苷含量(m g/g)=15.51+0.31+0.091-0.39+ 0.94-0.49+0.34-1.032-0.762-0.832.通过对、、项系数绝对值的大小比较,各提取因素影响的重要程度顺序为:(硫酸铵质量分数)>(乙醇质量分数)>(萃取时间).表6 响应面试验结果T a b.6 R e s u l t o f r e s p o n s e s u r f a c e t e s t序号乙醇质量分数/%萃取时间/m i n硫酸铵质量分数/%花色苷含量/(m g/g)实际值预测值101-114.2313.06 201114.0113.96 300015.6215.35 40-1112.9313.31 5-10-113.3213.24 610-114.6314.63 7-11012.3212.57 811015.113.06 900015.6115.51 10-10113.6413.34 111-1013.2613 1200015.7515.51 1300015.2315.51 140-1-114.5114.56 151011315.51 1600015.3415.51 17-1-1014.2314.26由表7可知,<0.01代表模型差异极显著;0.01<<0.05代表模型差异显著;失拟项(=>第4期 薛海瑞,等:黑果枸杞花色苷提取工艺优化及抗氧化研究 第60卷况;矫正2=0.9410能够说明94.1%花色苷含量的变化.一次项影响极显著,影响显著,影响显著,交互项影响中、极显著,显著,二次项2、2、2影响极显著.在E t O H/(N H4)2 S O4双水相萃取花色苷中,每个提取因素都对花色苷的提取含量有显著影响.表7 回归模型方差分析T a b.7 V a r i a n c e a n a l y s i s o f r e g r e s s i o nm o d e l方差来源平方和自由度均方值值显著性M o d e l17.8891.9929.33<0.0001** -乙醇质量分数/%0.7710.7711.350.0119* -萃取时间/m i n0.06710.0670.980.3544-硫酸铵质量分数/%1.2111.2117.850.0039**3.5213.5251.910.0002**0.9510.9514.040.0072**0.4610.466.830.0348*24.4514.4565.64<0.0001**22.412.435.440.0006**22.9412.9443.350.0003**R e s i d u a l0.4770.068L a c ko f F i t0.2930.0962.050.25P u r eE r r o r0.1940.047C o rT o t a l18.351620.9742校正20.9410*(0.01<<0.05),差异显著.**(<0.01),差异极显著.应用D e s i g n-E x p e r t8.0.6软件求解经过优化的回归方程得出,响应面预测最佳方案为乙醇质量分数为24.61%,萃取时间35.92m i n,硫酸铵质量分数22.72%,预测黑果枸杞花色苷的提取含量为15.62m g/g.根据实验条件修正方案为乙醇质量分数为25%,萃取时间36m i n,硫酸铵质量分数为23%,在此条件下得到的花色苷含量为(15.46±0.31)m g/g,实际结果与预测值基本相符,说明了模型很好地预测了实际情况,响应面得到的最优条件是可行的.3.2.3 乙醇棷磷酸二氢钠双水相萃取工艺优化 实验方案设计及结果如表8,经D e s i g n-E x p e r t 8.0.6软件回归拟合,得到二次多项回归方程:花色苷含量(m g/g)=15+0.15+0.58+0.42-0.20-0.075+0.25-0.652-0.932-0.722.通过对、、项系数绝对值的大小比较,各因素影响的重要程度顺序为:(萃取时间)> (磷酸二氢钠质量分数)>(乙醇质量分数).表8 响应面试验结果T a b.8 R e s u l t o f r e s p o n s e s u r f a c e t e s t序号A乙醇质量分数/%B萃取时间/m i nC磷酸二氢钠质量分数/%花色苷含量/(m g/g)实际值预测值110-113.3213.43 201-113.2313.26 311014.113.95 400014.96155-10114.113.24 601114.5614.60 700015.14158-11013.9814.05 90-1112.9912.95 1010114.0214.12 111-1013.2613.19 12-10-113.112.99 1300014.8915 140001515 15-1-1012.3612.51 1600015.0215 170-1-112.6512.61表9 回归模型方差分析T a b.9 V a r i a n c e a n a l y s i s o f r e g r e s s i o nm o d e l方差来源平方和自由度均方值值显著性M o d e l13.0991.4571.38<0.0001** -乙醇质量分数/%0.1710.178.260.0239* -萃取时间/m i n2.6612.66130.4<0.0001** -磷酸二氢钠质量分数/%1.4211.4269.68<0.0001**0.1510.157.470.0292*0.02210.0221.10.32820.2510.2512.030.0104*21.7811.7887.26<0.0001**23.6213.62177.7<0.0001**22.1712.17106.33<0.0001**R e s i d u a l0.1470.02L a c ko f F i t0.1130.0364.310.0959P u r eE r r o r0.03448.42E-3C o rT o t a l13.231620.9892校正20.9754*(0.01<<0.05),差异显著;**(<0.01),差异极显著由表9可知,0.01<<0.05代表模型差异显著;<0.01代表模型差异极显著;失拟项(= >第60卷四川大学学报(自然科学版)第4期情况;矫正2=0.9754能够说明97.54%花色苷含量的变化.在E t O H /N a H 2P O 4双水相萃取花色苷中,每个提取因素都对花色苷的提取含量有显著影响.应用D e s i g n -E x p e r t 8.0.6软件求解经过优化的回归方程得出,最佳方案为乙醇质量分数24.08%,萃取时间为36.77m i n ,磷酸二氢钠质量分数为26.71%.为实验方便修正为乙醇质量分数24%,萃取时间为37m i n ,磷酸二氢钠质量分数为27%,在此条件下提取花色苷含量为(15.02±0.19)m g /g,说明响应面很好的预测了实际情况,得出的最优条件是可行的.3.3 黑果枸杞花色苷体外抗氧化活性结果采用2.2.1所述方法,结果如图2a 、2b 和2c所示,在6.25~200μg/m L 范围内,黑果枸杞花色苷L R N 、L R P 、L R E 对D P P H 自由基清除效果呈浓度依赖效应,不同提取方法的清除能力强弱顺序为:L R N >L R P >L R E .在6.25~200μg /m L 范围内,黑果枸杞花色苷L R N 、L R P 、L R E 均浓度依赖性对A B T S 有清除作用,不同提取方法的清除能力强弱顺序为:L R N >L R P >L R E .在6.25~200μg /m L 浓度范围内,黑果枸杞花色苷L R N 、L R P 、L R E 均浓度依赖性地反映了总还原能力的强弱,不同提取方法总还原能力强弱顺序为:L R N >L R P >L R E .采用斜率K 值来反映不同花色苷样品的总还原能力,斜率值越大,表明总还原能力越强,如表10所示.不同花色苷样品的I C 50值见表10.图2 不同提取方法黑果枸杞花色苷体外抗氧化能力(a )不同提取方法花色苷的D P P H 清除能力;(b )不同提取方法花色苷的A B T S 清除能力;(c)不同提取方法花色苷的总还原能力F i g .2 I nv i t r o a n t i o x i d a n t c a p a c i t y o f a n t h o c y a n i n s f r o m L y c i u mr u t h e n i c u m M u r r .u s i n g di f f e r e n t e x t r a c t i o nm e t h o d s (a )D P P Hs c a v e n g i n g a b i l i t y o f a n t h o c y a n i n s e x t r a c t e d b y d i f f e r e n tm e t h o d s ;(b )A B T S s c a v e n g i n g a b i l i t y o f a n t h o c y a n i n s e x t r a c t e d b yd i f fe r e n tm e t h o d s ;(c )T o t a l r e d u c i n g c a p a c i t y of a n t h o c y a n i n s e x t r a c t e db y di f f e r e n tm e t h o d s 表10 不同花色苷样品的抗氧化能力T a b .10 A n t i o x i d a n tc a p a c i t y o fd i f f e r e n ta n t h o c ya n i n s s a m pl e s 花色苷样品I C 50/(μg /m L )D P P H A B T S总还原力斜率值L R E 186.909±2.469178.843±1.6730.0007L R N 82.886±1.67374.723±0.1730.0017L R P 120.733±2.02388.282±0.7540.0010V C 5.695±0.0616.083±0.046B H T0.0031注:数据表示为平均值±标准差(=3),空白处表示未检测3.4 -B H P 诱导B R L3A 细胞损伤模型的建立本实验采用不同处理浓度-B H P (200、300、400、500、600、700、800和900μm o l /L )处理2h 来建立B R L3A 细胞损伤模型,由图3可知,-B H P浓度为200μm o l /L 时,细胞存活率与对照组相比显著下降,为26%左右;确定本实验中-B H P 对B R L3A 细胞最佳损伤浓度和时间为200μm o l /L 和2h .3.5 黑果枸杞花色苷对B R L3A 细胞毒性实验和保护作用由图4a 和4b 可知,在25~200μg/m L 浓度范围内,花色苷样品对B R L3A 细胞基本无毒副作用,此浓度范围可用于后续的实验研究.由图4c 和4d 可知,-B H P 损伤之后细胞存活率下降到44%,在10~100μg /m L 浓度范围内,L R E A 、L R N A 、L R P A 、L R E 、L R N 、L R P 细胞存活率最高分别恢复到71%、78%、72%、46%、81%和51%.当花色苷浓度小于60μg/m L 时,L R E A 、L R N A 、L R P A 、L R N 对B R L3A 细胞的保护作用均呈浓度依赖效应,花色苷浓度为60μg/m L 时对损伤细胞的保护效果最好当花色苷浓度大于第4期薛海瑞,等:黑果枸杞花色苷提取工艺优化及抗氧化研究第60卷图3 200~900μm o l /L 的-B H P 处理B R L3A 细胞2h对细胞活力的影响**<0.01,与对照组相比F i g.3 E f f e c t so f 2ht r e a t m e n tw i t h200~900μm o l /L -B H Po nB R L3Ac e l l v i a b i l i t y**<0.01,c o m p a r e dw i t h t h e c o n t r o l g r o u pL R N A 、L R P A 、L R N 花色苷对细胞的保护效果逐渐降低.L R E 、L R P 在10~100μg/m L 浓度范围内没有显著细胞保护作用.综上,在后续实验中,选用60μg/m L 继续探究不同花色苷样品的细胞保护作用.3.6 黑果枸杞花色苷对-B H P 诱导损伤的B R L 3A 细胞内活性氧的清除作用利用D C F H -D A 荧光探针,通过倒置荧光显微镜观察R O S 的生成,荧光强度与细胞内R O S 积累量呈现正相关.由图5荧光图以及流式量化结果分析可知,与对照组相比,模型组荧光强度显著增加,而L R N 、L R N A 花色苷处理组细胞的活性氧积累量显著降低,清除R O S 效果优于L R P 、L R -P A 、L R E 、L R E A ,说明L R N 、L R N A 、L R E A 、L R -P A 都能有效减缓-B H P 诱导的B R L3A 细胞内R O S 生成.流式结果图5c 表明L R N 、L R N A 清除RO S 效果较好,后续选择L R N 、L R N A 进行细胞膜损伤实验分析.图4 不同提取方法的花色苷对B R L3A 细胞基本无毒性并且对-B H P 诱导的损伤具有保护作用(a )纯化后不同方法提取花色苷对B R L3A 细胞的毒性作用;(b )未纯化不同方法提取花色苷对B R L3A 细胞的毒性作用;(c)纯化后不同方法提取花色苷对B R L3A 细胞的保护作用;(d )未纯化不同方法提取花色苷对B R L3A 细胞的保护作用;**<0.05,与对照组和-B H P处理组相比F i g .4 A n t h o c y a n i n s e x t r a c t e du s i n g d i f f e r e n tm e t h o d s a r e b a s i c a l l y no n -t o x i c t oB R L3Ac e l l s a n dh a v e a p r o t e c t i v e e f f e c t o n -B H P i n d u c e dd a m a ge (a )T o x i c i t y of a n t h o c y a n i n s e x t r a c t e d b y d i f f e r e n tm e t h o d s a f t e r p u r i f i c a t i o n o n B R L 3Ac e l l s ;(b )T o x i c i t y o f a n t h o c y a n i n s e x t r a c t e d b yd i f -fe r e n tm e t h o d sw i t h o u t p u r if i c a t i o n o nB R L3Ac e l l s ;(c )P r o t e c t i v e e f f e c t o f p u r i f i e d a n t h o c y a n i n s e x t r a c t e d b y di f f e r e n tm e t h o d s o nB R L 3Ac e l l s ;(d )P r o t e c t i v e e f f e c t o f p u r i f i e d a n t h o c y a n i n s e x t r a c t e d b y d i f f e r e n tm e t h o d s o nB R L3Ac e l l s ;**<0.05,c o m p a r e dw i t h t h e c o n t r o l g r o u p an d -B H P t r e a t m e n t g r o u p第60卷 四川大学学报(自然科学版) 第4期图5 细胞内活性氧水平检测(a)荧光显微镜观察R O S的生成(100×);(b)流式细胞仪分析细胞内R O S的生成;(c)流式细胞结果定量分析##<0.01与对照相比,**<0.01模型相比F i g.5 D e t e r m i n a t i o no f I n t r a c e l l u l a rR O SL e v e l s(a)R O S g e n e r a t i o nw a sv i s u a l i z e db y a f l u o r e s c e n c em i c r o s c o p e(100×);(b)R O S g e n e r a t i o nw a sd e t e c t e db y f l o wc y t o m e t e r;(c) Q u a n t i t a t i v e a n a l y s i s o f t h e f l o wc y t o m e t r y r e s u l t s##<0.01v e r s u s c o n t r o l,**<0.01v e r s u sm o d e l3.7 黑果枸杞花色苷对-B H P诱导的B R L3A线粒体损伤的保护作用本实验利用J C-10荧光探针,通过倒置荧光显微镜和流式细胞仪观察线粒体的损伤程度.由图6a 可知模型组绿色荧光明显,说明线粒体膜电位下降,细胞膜受损,加药处理后可以观察到绿色荧光显著降低红色荧光显著增强,说明L R N、L R N A对线粒体具有保护作用,结合流式结果图6b、6c可知L R N、L R N A对-B H P诱导的细胞凋亡和线粒体损伤具有明显的保护作用.4 讨 论本研究采用单因素实验和响应面分析对不同提取方法进行了工艺优化,对比了不同方法提取得到的黑果枸杞花色苷的体外抗氧化活性.传统提取方法辅助手段单一且提取效率不高,本课题组采用超声波与纤维素酶两种手段辅助提取花色苷,得率更高.采用双水相萃取,与传统方法相比可以实现主要成分的纯化,条件更加温和,且不容易导致目的物质变性[15].通过响应面,优化了提取工艺,从而获得了黑果枸杞花色苷的最佳提取得率,为进一步的工业提取提供了基础资料.体外抗氧化实验(D P P H、A B T S自由基清除实验、总还原力测定实验),可以直接反应被检测物质的抗氧化活性,可以作为初步的体外抗氧化活性筛选.经过三种体外抗氧化实验研究,不同提取方法取得的花色苷体外抗氧化能力强弱的顺序为: L R N>L R P>L R E,说明双水相萃取的花色苷活性更强.在细胞实验中,使用-B H P建立了B R L3A 细胞损伤模型,通过检测细胞活力、R O S水平、细胞线粒体膜电位变化,探究不同花色苷样品对-。
枸杞色素的提取工艺研究
浸提3次，每次2 h。
3次，每次2 h，色素得率较高。该项研究也为枸杞色素
断深化，愈来愈多的研究表明，人工合成色素在不同程 的特征吸收波长。
度上存在着毒性[1]，因此开发安全无毒、稳定性好、具有 2.2 枸杞色素提取的单因素试验
保健功能的天然植物色素成为近年来食品工业的一个 2.2.1 乙醇浓度
发展方向。
取1 g枸杞粉6份，分别加入50 %、60 %、70 %、80 %、
浓度。 2）浸提温度较高时容易使浸提剂乙醇挥发，故在
浸提过程中采用循环水冷却装置，将挥发的乙醇冷却
图5表明，浸提次数增加，浸提液的吸光度略有增 后回流。
加，而且第3次浸提所得浸提液颜色较浅，浸提液浓缩
3）由于较高温度下浸提时间延长会破坏色素的稳
量较大，综合考虑浸提过程不宜超过3次。
定性，因此浸提时间和浸提次数的选择需同时考虑其
Product Corporation，Zhongwei 755001，Ningxia，China） Abstract: The extraction conditions of Lycium pigment was studied with the ethanol solvent. Based on the single factor tests the optimum extraction conditions were obtained by orthogonal test. The ultraviolet-visible spectrum showed that the absorption peak of the ethanol -pigment -solution exists at 395 nm. The optimum extraction condition was performed at 80 ℃ with 3 times（each for 2 hours）by the 1 g/20 mL 60 ％ ethanol solvent． Key words: Lycium；pigment；extraction
枸杞色素提取工艺的研究
作者：胡文明 胡文明
实验内容
本文以市售枸杞干果为原料，挑拣优质者 经过漂洗除杂，浸泡过夜除多糖。烘干粉碎 过40目筛为实验原料。研究了枸杞色素的提 取。实验采用有机溶剂 有机溶剂提取枸杞子中的色素。 有机溶剂 通过单因素变化和正交试验确定了枸杞色素 在本实验中最适的提取工艺参数。
实验方法
枸杞色素最大吸收波长的测定 将枸杞色素用石油醚溶解并稀释，用石油 醚作对照，在紫外分光光度计上波长由 380nm至500nm每隔5nm测定一次吸光度值。 最终确定枸杞色素的最大吸收波长为455nm。 并以此最大波长为定值测定后续试验的吸光 度值。
⑴提取剂的选择 分别称取1克枸杞，各加5ml的乙醇、丙酮、 乙醚、石油醚、在40℃下提取1小时，取相 同体积的提取液稀释，以相应的提取剂为参 比，在455nm下测吸光度，比较提取效果。 选取适宜的溶剂。
_果胶酶提取黑果枸杞花青素的工艺优化
Optimization of extraction technology of anthocyanin from Lycium ruthenicum by pectinase
2 3 2， * LI Cai－ xia1 ， ， SONG Hai2 ， ， JIAO Yang1 ， GAO Hai－ ning1 ，
果胶酶提取黑果枸杞花青素的工艺优化
1， 2 2， 3 1 1， 2， * 李彩霞 ， 宋 海 ， 焦 杨 ， 高海宁 （ 1. 河西学院农业与生物技术学院， 甘肃张掖 734000 ； 2. 甘肃省高校河西走廊特色资源利用省级重点实验室 ， 甘肃张掖 734000 ； 3. 河西学院化学化工学院， 甘肃张掖 734000 ）
表 1 Box－Behnken 实验因素水平表 Table 1 Factors and level value of Box－Behnken analysis 因素 X1 酶添加量（ mg /100 g） X2 酶解时间（ h） X3 酶解温度（ ℃ ）
1.2.5
－1 60 0.5 30
水平 0 70 1 40
1.2
1.2.1
实验方法
X2 、 X3 表示， 度作为考察因素， 分别以 X1 、 并以 + 1 、 0、 －1 进行编码， 因素编码及水平见表 1 。
黑果枸杞果汁的制备及总花青素的提取 将 冷冻的黑果枸杞果实在 4 ℃ 环境下解冻， 置于高速 组织捣碎匀浆机中匀浆， 充分混匀后将果浆分装冷 。 1 g 藏备用 准确称取 果浆于 150 mL 的三角瓶中， 加入 体 积 分 数 80% 的 酸 性 乙 醇 （ 含 0.1% HCl ）
要： 研究果胶酶提取黑果枸杞花青素的工艺。在单因素实验的基础上， 利用响应曲面法优化果胶酶提取黑果枸杞 花青素的工艺条件。结果表明， 果胶酶提取黑果枸杞花青素的最佳条件为： 酶添加量 70 mg /100 g、 酶解温度 41 ℃ 、 酶 1.0 h ， ， 63.70% ， 215.31 mg /100 g ， 解时间 在此条件下 实验测得黑果枸杞花青素提取率为 提取量为 鲜果 与实验预测值 63.01% 相符， 且与未加果胶酶样品相比（ 20.28% ） ， 说明响应面优化的酶法提取工艺 花青素的提取率增加了 43.42% ， 摘 有利于提高黑果枸杞花青素提取率。 关键词： 黑果枸杞， 果胶酶， 花青素， 响应面
枸杞色素提取工艺论文
枸杞色素的提取工艺研究[摘要] 利用有机溶剂浸提枸杞中的色素,通过正交设计试验确定了提取枸杞色素的最佳工艺条件。
结果表明，枸杞色素提取的最佳工艺条件为温度60℃,时间60min，料液比1:6。
该条件下浸提率为95.7%，提取效果较好。
[关键词] 枸杞子；色素；提取工艺食用天然色素不仅没有毒性，有的还有一定的营养，甚至一定的药理作用。
目前人们使用的食用色素有天然食用色素和合成食用色素两大类。
天然色素来自天然产物，主要由植物组织中提取，也包括来自动物和微生物的一些色素。
枸杞为茄科枸杞属植物的果实，它在祖国的传统医学中具有重要的地位，其药用价值备受历代医家的推崇[1]。
本文采用正交试验设计，选择枸杞色素提取的优化工艺，旨在为枸杞色素的提取及开发提供参考。
一、材料与方法1.材料枸杞果实为晒干的宁夏枸杞。
取成熟、无虫害的果实放在通风处凉干，去核取皮，粉碎，80目筛过筛获得枸杞细粉。
2.仪器与设备仪器：uv-2000紫外可见分光光度计（莱伯泰科有限公司）；dhg-9140a电热恒温鼓风干燥箱（上海一恒科技有限公司）；恒温水浴锅。
试剂：甲醇、95%乙醇、正丁醇和乙酸乙酯均为分析纯，水为二次水。
3.试验方法（1）色素测定方法将约0.2g枸杞粉末用95%的乙醇溶解，在50℃下恒温水浴,浸提3次，过滤，合并滤液，用95%乙醇定容至50ml容量瓶中。
用95%的乙醇作对照，在紫外分光光度计上从波长200nm开始至380nm，每递增2nm测其吸光度，以波长为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制曲线，确定枸杞色素最大吸收波长。
（2）浸提率的计算称取约1g枸杞用95%的乙醇充分浸提，至提取液无色为止，合并滤液，量其体积，吸取提取液用相应的溶剂稀释，在最大吸收波长下测吸光度值。
把此测定值作为完全提取的测量值，其他条件下的测定值与之相比，得到该条件下的浸提率。
（3）提取溶剂的选择[3]分别称取约0.5g干燥枸杞粉末4份于100ml的提取瓶中，分别加入甲醇、95%乙醇、正丁醇、乙酸乙酯各20ml。
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黑果枸杞色素最佳提取工艺研究
目的研究黑果枸杞色素的最佳提取工艺条件。
方法通过单因素和多因素正交试验，对影响提取物中色素含量的各因素进行了研究。
结果影响黑果枸杞色素提取率的因素大小依次为：固液比>溶剂比>浸提温度>浸提时间。
黑果枸杞色素的最佳提取工艺条件为5%盐酸和85%乙醇混合溶剂做浸提剂，溶剂比1∶1，提取温度70 ℃，提取时间4 h，固液比1∶20。
结论优选的工艺稳定可行。
标签：黑果枸杞；色素；提取；正交试验
黑果枸杞（Lycium ruthenicum Murr）为茄科（Solanaceae）枸杞属（Lycium L.）植物，药用部位为干燥的果实。
黑果枸杞分布于我国西北地区，具有补肾益精、养肝明目、补血安神、生津止渴、润肺止咳等功效[1]。
黑果枸杞含有人体必须的脂肪酸和8种人体必须的氨基酸，还有一定量的维生素C[2]。
其成熟浆果富含紫红色素，是一种珍稀的天然花色苷类色素资源，该色素含量达387.9 mg/100 g[3]，对环境无污染，有望成为化妆品、制药、饮料和食品的着色剂，具有很高的开发利用价值和前景[4]。
现代药物学研究认为，枸杞色素是枸杞中的重要生物活性成分之一，主要包括类胡萝卜素和少量叶黄素及其他有色物质[5]。
有关黑果枸杞各因素最佳提取工艺的研究报道较少，本研究通过单因素试验优选了最佳提取溶剂，同时研究了黑果枸杞色素提取过程中温度、时间、溶剂配比、料液配比等多种因子对提取率的影响，旨在选择各个影响因素的最佳提取条件，确定最佳的提取工艺参数，为黑果枸杞色素的开发利用提供理论和技术支撑。
1 仪器与试药
752型紫外可见分光光度计（上海色谱仪器有限公司），粉碎机，电子分析天平，恒温水浴锅，50 mL量筒，25 mL具塞试管，60 mm口径漏斗等。
黑果枸杞（购于兰州复兴厚中药材有限公司，经甘肃农业大学中草药系陈垣教授鉴定为黑果枸杞Lycium ruthenicum Murr）的干燥成熟果皮，粉碎成40目后备用。
无水乙醇、正丁醇、浓盐酸、氢氧化钠、乙酸乙酯、丙酮（均为分析纯）。
2 方法
2.1 色素含量测定
黑果枸杞色素的乙醇提取溶液在紫外-可见最大吸收波长545 nm[6]处测定吸光度3次，取平均值，根据比尔定律A=εlC （A为吸光度，ε为吸收系数，C 为样品浓度，l为光程即比色皿厚度）可知吸光度与色素浓度成正比，所以，可用吸光度直接表示色素浓度或含量大小。
2.2 色素提取单因素试验
2.2.1 提取溶剂的选择准确称取0.5 g黑果枸杞干粉9份于25 mL具塞试管中，以不同溶剂做提取剂进行试验，选取最佳的提取溶剂。
各以1∶20的料液比加入蒸馏水、无水乙醇、5%盐酸、盐酸+乙醇混合液、正丁醇、氢氧化钠、乙酸乙酯、丙酮溶液在50 ℃恒温水浴锅内浸提2 h，过滤留上清液定容在最大吸收波长545 nm处测其吸光度值。
2.2.2 浸提时间的选择准确称取0.5 g黑果枸杞干粉5份分别装于25 mL具塞试管中，然后各加入10 mL 5%盐酸和85%乙醇混合液（1∶1混合），置恒温水浴锅中，在60 ℃下浸提1、2、3、4、5 h，冷却至室温后过滤，定容至50 mL，用752分光光度计在最大吸收波长545 nm处测其吸光度值。
2.2.3 浸提温度的选择准确称取0.5 g黑果枸杞干粉5份分别装于25 mL具塞试管中，然后各加入10 mL的5%盐酸和85%乙醇混合液（1∶1混合），置恒温水浴锅中，分别在40、50、60、70、80 ℃下浸提4 h冷却至室温后过滤，定容至50 mL，用752分光光度计在最大吸收波长下测其浸提液的吸光度值。
2.2.4 固液配比的选择准确称取0.5 g黑果枸杞干粉5份分别装于25 mL具塞试管中，然后分别与5%盐酸和85%乙醇的混合液（1∶1混合）按1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50混合，在70 ℃的恒温水浴锅中浸提4 h冷却至室温后过滤，定容至50 mL，用752分光光度计在最大吸收波长下测其吸光度值。
2.2.5 溶剂配比的选择准确称取0.5 g黑果枸杞干粉5份分别装于25 mL具塞试管中，然后分别按1∶1、1∶2、1∶4、1∶8、1∶10的溶剂配比加入5%盐酸和85%乙醇的混合液10 mL，在70 ℃的恒温水浴锅中浸提4 h冷却至室温后过滤，定容至50 mL，用752分光光度计在最大吸收波长下测其吸光度值。
2.3 色素提取多因素综合正交试验
以单因素试验所得的提取温度、提取时间、固液配比、溶剂配比4个因素，每因素4个水平进行正交试验设计[7]，见表1。
将所得的滤液定容到50 mL，在最大吸收波长545 nm处测其浸提液的吸光度，以确定最佳提取条件。
3 结果与分析
3.1 单因素试验结果
3.1.1 不同浸提溶剂对黑果枸杞色素吸光度的影响由试验结果可知，在非极性的有机溶剂中，浸提液中色素含量极少，乙酸乙酯浸提液中色素含量最低，因此，不适宜用非极性有机溶剂做浸提剂。
而在乙醇等极性溶剂中，浸提液中色素含量逐渐增加，5%盐酸和85%乙醇的混合溶剂浸提液中色素含量最多，花色苷类色素在酸性条件下比较稳定，所以选取5%盐酸和85%乙醇的混合溶剂做浸提剂。
3.1.2 不同浸提时间对黑果枸杞色素吸光度的影响由试验结果可知，浸提时间在1～4 h内，浸出液中色素含量随浸提时间延长而增加，当浸提时间超过4 h 以上，浸出物的色素含量不会随着时间的增加而大幅增长，而是呈逐渐下降趋势。
因此，最佳浸提时间为4 h。
3.1.3 不同浸提温度对黑果枸杞色素吸光度的影响由试验结果可知，在浸提温度为40～70 ℃内，浸提色素含量成逐渐上升趋势，其中在70 ℃时效果最好。
温度高于70 ℃时急剧下降，由于乙醇的沸点为78.3 ℃，温度过高乙醇会逐渐蒸发，所以80 ℃为上限，最佳浸提温度为70 ℃。
3.1.4 不同固液配比对黑果枸杞色素吸光度的影响由试验得知，色素浸出液的吸光度在固液配比为1∶20时最大，而从1∶20到1∶50之间急剧下降并逐渐趋于平衡状态，说明浸提剂过多并不利于色素的提取，因此选择固液配比1∶20为宜。
3.1.5 不同溶剂配比对黑果枸杞色素吸光度的影响由试验可知，随着5%盐酸-85%乙醇溶剂配比的增加，浸出液中色素含量逐渐降低，当容积配比超过1∶10时，逐渐趋于平衡状态。
随着5%盐酸-85%乙醇溶剂配比的增加，浸提溶剂的酸性越来越小，浸提液中色素含量与浸提溶剂的酸性程度有关，花色苷类色素在酸性条件下比较稳定，因此选取5%盐酸-85%乙醇为1∶1的溶剂配比为宜。
3.2 多因子对提取效果的综合影响
选取提取温度、提取时间、固液配比、溶剂配比4个因素，每个因素4个水平进行正交试验，采用L16（45）正交表，共组成16个处理组合，各处理重复3次，取其平均值进行数据计算。
按正交法设计的各试验号将提取液中色素的试验数据见表2，方差分析见表3。
从表3可以看出，各因素对色素提取率的影响由大到小依次为固液配比>溶剂配比>提取时间>提取温度，其中固液配比和溶剂配比是影响色素提取率的显著因子，而提取温度、提取时间是非显著因子。
4 讨论
浸提时间、浸提温度、固液配比、溶剂配比等因素对黑果枸杞的色素提取均有影响，各因素对黑果枸杞色素提取效果的影响程度依次为固液配比>溶剂配比>浸提时间>浸提温度。
从黑果枸杞果实中提取色素的最佳工艺条件为：以5%盐酸和85%乙醇的混合溶剂做浸提剂，溶剂配比1∶1，提取温度70 ℃，提取时间4 h，固液比1∶20为提取黑果枸杞色素的最适宜条件。
黑果枸杞的果汁颜色鲜艳、稳定性好、着色力强、资源丰富[8]，加工工艺简单，适于入药，又可食用，是国内急需的理想食用天然花色苷，可取代人工合成的偶氮色素，广泛应用于药品、食品以及化妆品中。
因此，开发利用黑果枸杞
色素具有重要的现实意义。
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