CIK逆转耐顺铂人肺腺癌细胞对顺铂耐药与ERCC1的相关性

第３７卷第３期２０１４年６月遵义医学院学报

ＪｏｕｒｎａｌｏｆＺｕｎｙｉＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＶ０１．３７ＮＯ．３Ｊｕｎ．２０１４

临床医学研究ＣＩＫ逆转耐顺铂人肺腺癌－幺￥Ｂｆｉ对顺铂耐药与ＥＲＣＣｌ的相关性田昕，李宁，李冉（遵义医学院附属肿瘤医院胸部肿瘤科，贵州遵义５６３０９９）

［摘要］目的观察脐血来源的ＣＩＫ细胞对Ａ５４９／ＤＤＰ细胞的耐药逆转作用。并探讨ＣＩＫ逆转耐药机制是否与核苷酸切除修复交叉互补基因１（ｅｘｃｉｓｉｏｎｒｅｐａｉｒｃｒｏｓｓｃｏｍｐｌｅｎｍｎｔａｔｉｏｎｇｒｏｕｐ１，ＥＲＣＣｌ）的表达存在相关性。方法采集脐血单个核细胞经细胞因子体外诱导获得ＣＩＫ细胞（ｃｙｔｏｋｉｎｅｉｎｄｕｃｅｄｋｉｌｌｅｒｃｅｌｌｓ，ＣＩＫ），ＭＴＴ法检测顺铂（ｃｉｓｐｌａｔｉｎ，ＤＤＰ）对Ａ５４９细胞和Ａ５４９／ＤＤＰ细胞的体外杀伤作用，以及ＣＩＫ细胞与Ａ５４９／ＤＤＰ细胞共培养前后对ＤＤＰ敏感性的变化。Ｒｅａｌ—ｔｉｍｅＲＴ—ＰＣＲ

法检测Ａ５４９细胞、Ａ５４９／ＤＤＰ细胞以及ＣＩＫ干预后的Ａ５４９／ＤＤＰ细胞中ＥＲＣＣｌｍＲＮＡ的表达情况。Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ法检测Ａ５４９细胞、Ａ５４９／ＤＤＰ细胞以及ＣＩＫ干预后的Ａ５４９／ＤＤＰ细胞中ＥＲＣＣｌ蛋白的表达情况。结果Ａ５４９／ＤＤＰ细胞对ＤＤＰ耐药，耐药指数为２．３９１。ＣＩＫ细胞能逆转Ａ５４９／ＤＤＰ细胞对ＤＤＰ的耐药性，逆转倍数为３．９６７。Ｒｅａｌ—ｔｉｍｅＲＴ—ＰＣＲ、Ｗｅｓｔ—ｅｍｂｌｏｔ测得Ａ５４９／ＤＤＰ细胞中ＥＲＣＣｌｍＲＮＡ和蛋白表达量比Ａ５４９细胞高（Ｐ＜０．０５），ＣＩＫ细胞共培养前后Ａ５４９／ＤＤＰ细

胞中ＥＲＣＣｌｍＲＮＡ和蛋白表达量无明显变化。结论ＣＩＫ细胞能逆转Ａ５４９／ＤＤＰ细胞对ＤＤＰ的耐荮陛，其逆转耐药的机制与ＥＲＣＣｌ的表达无明显相关性。［关键词］肺癌；Ａ５４９细胞；Ｊ＇Ｆｉ４自；耐药逆转；ＣＩＫ细胞［中图法分类号］Ｒ７３４．２［文献标志码］Ａ［文章编号］１０００－２７１５（２０１４）０３－０３３８－０５

ＳｔｕｄｙｏｎｔｈｅｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎＥＲＣＣｌａｎｄｔｈｅｍｅｒｃｈａｎｉｓｍｓｕｎｄｅｒｌｙｉｎｇｃｙ—ｔｏｋｉｎｅｉｎｄｕｃｅｄｋｉｌｌｅｒｃｅｌｌｓ—．ｒｅｖｅｒｓｅｄｃｉｓｏｌａｔｉｎｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｉｎＡ５４９／ＤＤＰＣｅｌｌｓＴｉａｎＸｉｎ．丘Ｎｉｎｇ．丘Ｒａｎ

（ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＴｈｏｒａｃｉｃ，ＴｈｅＡｆｆｉｌｉａｔｅｄＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＺｕｎｙｉＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，ＺｕｎｙｉＧｕｉｚｈｏｕ５６３０９９，Ｃｈｉｎａ）［Ａｂｓｔｒａｃｔ］ＯｂｊｅｃｔｉｖｅＴｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆｃｏｒｄｂｌｏｏｄ—ｄｅｒｉｖｅｄｃｙｔｏｋｉｎｅ—ｉｎｄｕｃｅｄｋｉｌｌｅｒ（ＣＩＫ）ｃｅｌｌｓｏｎ

ｒｅｖｅｒｓｉｎｇｃｉｓｐｌａｔｉｎｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｉｎｔｈｅＤＤＰ——ｒｅｓｉｓｔａｎｔｈｕｍａｎｌｕｎｇａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａｃｅｌｌｌｉｎｅＡ５４９／ＤＤＰａｎｄｏｂｓｅｒｖｅ

ｗｈｅｔｈｅｒｔｈｅｒｅｗａｓｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎｔｈｅｓｅｅｆｆｅｃｔｓａｎｄｅｘｃｉｓｉｏｎ

ｒｅｐａｉｒｃｒｏｓｓｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎｇｒｏｕｐ

１（ＥＲＣＣｌ）

ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．ＭｅｔｈｏｄｓＴｈｅｓｉｎｇｌｅｕｍｂｉｌｉｃａｌｃｏｒｄｂｌｏｏｄｎｌｏｎｏｎｕｃｌｅａｒｃｅｌｌｗａｓｉｎｄｕｃｅｄｂｙｃｙｔｏｋｉｎｅｉｎｖｉｔｒｏｔｏｂｅ—ｃｏｍｅＣＩＫｃｅｌｌｓ．ＭＴＴａｓｓａｙｗａｓａｐｐｌｉｅｄｔｏｅｖａｌｕａｔｅｔｈｅｃｙｔｏｔｏｘｉｃａｃｔｉｖｉｔｙｏｆＤＤＰａｇａｉｎｓｔ

Ａ５４９／ＤＤＰｃｅｌｌｓａｎｄ

Ａ５４９ｃｅｌｌｓｉｎｖｉｔｒｏａｎｄｔｈｅｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙｏｆＡ５４９／ＤＤＰｃｅｌｌｓＣＩＫｔｏＤＤＰｂｅｆｏｒｅａｎｄａｆｔｅｒｔｈｅＣＯ—ｃｕｌｔｕｒｅｗｉｔｈＣＩＫ．ＴｈｅｍＲＮＡａｎｄｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｏｆＥＲＣＣｌｉｎＡ５４９ｃｅｌｌｓ，Ａ５４９／ＤＤＰｃｅｌｌｓａｎｄＡ５４９／ＤＤＰＣＯ—ｃｕｌｔｕｒｅｄｗｉｔｈＣＩＫｃｅｌｌｓｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙｒｅａｌ—ｔｉｍｅＲＴ—ＰＣＲａｎｄｗｅｓｔｅｎｌｂｌｏｔａｎａｌｙｓｉｓ．ＲｅｓｕｌｔｓＴｈｅＡ５４９／ＤＤＰｃｅｌｌｓｗａｓ

ｒｅｓｉｓｔａｎｔｔｏＤＤＰｗｉｔｈｔｈｅｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｉｎｄｅｘｏｆ２．３９１．ＣＩＫｃｅｌｌｓｄｅｃｒｅａｓｅｄｄｒｕｇｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｔｏｃｉｓｐｌａｔｉｎ

ｗｉｔｈｔｈｅ

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ｖｅｒｓａｌｆｏｌｄｏｆ３．９６７．ＴｈｅＥＲＣＣｌｍＲＮＡａｎｄｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｏｓｓｉｏｎｓｗｅｒｅｈｉｇｈｅｒｉｎＡ５４９／ＤＤＰｔｈａｎｔｈｏｓｅｉｎＡ５４９ｃｅｌｌｓ（Ｐ＜０．０５），ｗｈｅｒｅａｓｔｈｅｒｅｗａｓｎｏｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｏｆｔｈｅＥＲＣＣ１ｍＲＮＡａｎｄ

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Ａ５４９／ＤＤＰｂｅｆｏｒｅａｎｄａｆｔｅｒＡ５４９／ＤＤＰＣＯ—ｃｕｌｔｕｒｅｄｗｉｔｈＣＩＫｃｅｌｌｓ．ＣｏｎｃｌｕｓｉｏｎＣＩＫｃｏｕｌｄｒｅｖｅｒｓｅｔｈｅｒｅｓｉｓｔ—

ａｎｃｅｏｆＡ５４９／ＤＤＰｃｅｌｌｓｔｏＤＤＰａｎｄｔｈｅｒｅｗａｓｎｏｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎｔｈｅｍｅｃｈａｎｉｓｍｓａｎｄＥＲＣＣｌｅｘ—ｐｒｅｓｓｌｏｎ・［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］ｌｕｎｇｃａｎｃｅｒ；ｈｕｍａｎ

ｌｕｎｇａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａＡ５４９；ｃｉｓｐｌａｔｉｎ；ｒｅｖｅｒｓｉｎｇｄｒｕｇｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ；ｃｙｔｏｋｉｎｅ

ｉｎｄｕｃｅｄｋｉｌｌｅｒｒｅｌｌ

Ｓ

［基金项目］贵州省科技计划资助项目（ＮＯ：黔科合ＳＹ（２００９）３０５５）。［通信作者］李宁，女，教授，硕士生导师，研究方向：肿瘤化疗耐药的逆转，Ｅ・３３８・

万方数据３期田昕等・ＣＩＫ逆转耐顺铂人肺腺癌细胞对顺铂耐药与ＥＲＣＣｌ的相关性肺癌是全球最常见的恶性肿瘤，目前缺乏简单有效的早期检查方法，因此，约２／３的患者确诊时已经出现远处转移，无手术机会，化疗是其主要的治疗手段，化疗耐药是亟待解决的问题。肿瘤耐药是多因素参与的过程，其生物化学机制有很多，ＤＮＡ修复机制是目前研究较多的机制之一，核酸切除修复（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｅｘｃｉｓｉｏｎ１．ｅｐａｉｒ，ＮＳＥ）为ＤＮＡ修复的限速步骤，ＥＲＣＣｌ为ＮＥＳ中ＤＮＡ损伤识别和链问切割的关键基因，ＥＲＣＣｌ表达上调可致肿瘤细胞ＤＮＡ修复加快，导致耐药ｕＪ。细胞因子活化的杀伤细胞被认为是新一代肿瘤过继治疗的首选方案之一。近年来，有学者发现ＣＩＫ能逆转肿瘤耐药，其逆转耐药的机制涉及了多种蛋白质及通路的改变，ＥＲＣＣｌ作为介导耐药的重要基因，是否也能被ＣＩＫ所改变从而实现耐药的逆转，是我们需要思考的问题。因此，本研究通过在体外用ＣＩＫ作用于Ａ５４９／ＤＤＰ细胞．检测其ＥＲＣＣｌｍＲＮＡ及蛋白的表达情况，与未予ＣＩＫ干预组进行比较，明确ＣＩＫ对Ａ５４９／ＤＤＰ细胞耐药的逆转作用，并探讨这种逆转作用是否与ＥＲＣＣｌ有关。

表１基因引物序列

１材料与方法１．１主要实验材料１．１．１实验细胞Ａ５４９细胞和Ａ５４９／ＤＤＰ细胞购自中国医学科学院肿瘤细胞库。１．１．２主要试剂及仪器ｉＭａｒｋ“”ＭｉｃｒｏｐｌａｔｅＲｅａｄｅｒ、

ＭＩＮＩ电泳系统、ＣｈｅｍｉＤｏｓＸＲＳ电泳凝胶成像分析

系统，ＢＩＯ—ＲＡＤ公司；ＮＤ一２０００核酸蛋白测定仪，Ｔｈｅｍｌｏ公司；注射用顺铂（冻干型），齐鲁制药有限公司；ＭＴＴ，ｓｏｌａｒｂｉｏ公司；抗人ＣＤ３单克隆抗体、ＩＦＮ一吖、ＩＬ一２，ｓｉｇｍａ—ａｌｄｒｉｃｈ公司；ＩＬ一１０ｔ，ｐｒｏｓｐｅｃ公司；人淋巴细胞分离液，天津灏洋生物制品科技有限责任公司；ＲＮＡｉｓｏＰｌｕｓ、Ｒｅａｌ—ＴｉｍｅＲＴ

—ＰＣＲ反转录试剂盒，Ｔａｋａｒａ公司；ＥＲＣＣｌＲａｂｂｉｔ

Ａｎｔｉｂｏｄｙ，ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇ

Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ公司；ＲａｂｂｉｔＡｎ—

ｔｉ—ｂｅｔａＡｃｔｉｎＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｙ，Ｂｅｙｏｔｉｍｅ公司；

山羊抗兔ＩｇＧ／辣根酶标记，中杉金桥生物技术有限公司，ＢＣＡ蛋白浓度测定试剂盒、ＳＤＳ—ＰＡＧＥ凝胶配制试剂盒，Ｂｅｙｏｔｉｍｅ公司。ＰＣＲ引物，由ＴａＫａＲａ公司合成（见表１）。

１．２方法１．２．１Ａ５４９及Ａ５４９／ＤＤＰ细胞的培养Ａ５４９细胞及Ａ５４９／ＤＤＰ细胞均采用改良型ＲＰＭＩ一１６４０培养基，向其中加入胎牛血清及青链霉素配制的双抗，置于３７ｏＣ，５％ＣＯ：孵箱中培养。０．２５％胰蛋白酶消化传代。１．２．２ＣＩＫ细胞的诱导及培养于我院产科手术室无菌条件下采集脐血约５０ｍＬ，肝素抗凝，于超净台内将脐血缓慢加入到盛有人淋巴细胞分离液的离心管中，脐血与人淋巴细胞分离液的比例约为２：１，放入低速冷冻离心机中离心２０００ｒ／ｒａｉｎ，２５ｍｉｎ。然后吸取中问白膜层，加入５倍体积ＰＢＳ重悬细胞，１５００ｒ／ｒａｉｎ，１０ｍｉｎ，洗涤细胞，最后以含５％ＡＢ型血清的ＲＰＭＩ一１６４０培养液重悬细胞，调整细胞数，分装入培养瓶中，在第０天向其中加入ＩＦＮ一吖，使其终浓度为１０００Ｕ／ｍＬ，第１天加入抗人ＣＤ３单克隆抗体、ＩＬ一１０Ｌ、ＩＬ一２，使其终浓度分别为５ｔｘＬ／１０６个细胞、１００、３００Ｕ／ｍＬ。之后每３天更换新鲜培养液，同时补加ＩＬ一２，并调整细胞浓度。置于３７ｏＣ，５％ＣＯ，孵箱中培养，２周后收获细胞。１．２．３ＭＴＴ法检测耐药逆转倍数①取对数生长期的Ａ５４９／ＤＤＰ细胞，制成单细胞悬液，调整细胞浓度为１×１０４个／ｍＬ，以每孔１００¨Ｌ接种于９６孔培养板，置于３７ｏＣ，５％ＣＯ，培养箱中培养过夜。次日早上向其中加入ＣＩＫ细胞，效靶比分别为５：１；１０：１；２０：１；４０：１；８０：１，每组设６个复孔，同时设对照组和调零组（对照组不加ＣＩＫ细胞，加等体积培养液，调零组不接种细胞，余步骤与实验组相同）置３７ｏＣ，５％ＣＯ：培养箱中培养２４ｈ后，酶联免疫检

测仪０Ｄ４９０ｎｎｌ处测量各孔吸光度值，通过线性回归计算出ＩＣｌＯ值。②分别取对数生长期的Ａ５４９及Ａ５４９／ＤＤＰ细胞，制成单细胞悬液，调整细胞浓度为１×１０４个／ｍＬ，以每孔１００¨Ｌ接种于９６孔培．３３９．

万方数据