优选第二章发酵工业微生物菌种制备原理和技术
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发酵工艺 第2章 发酵工业微生物菌种制备原理和技术
微生物菌种保藏机构名称和缩写
中国 缩写
ACCC
SH IA CCGMC AS-IV
CAF
IFFI
ID IV CIVBP
名称 中国农业微生物菌种保藏管理中 心 上海市农业科学院食用菌研究所 中国医学科学院抗菌素研究所 普通微生物菌种保藏管理中心 中国科学院武汉病毒研究所 中国林业科学院菌种保藏管理中 心 轻工业部食品发酵工业科学研究 所 中国医学科学院皮肤病研究所 中国医学科学院病毒研究所 中国兽医药品监察所
最常用的工业微生物
放线菌
– 链霉菌属 – 小单孢菌属 – 地中海诺卡氏菌 – 米苏里游动放线菌
藻类
藻类包括数种不同类以光 合作用产生能量的生物。 它们一般被认为是简单的 植物，并且一些藻类与比 较高等的植物有关。虽然 其它藻类看似从蓝绿藻得 到光合作用的能力，但是 在演化上有独立的分支。 所有藻类缺乏真的根、茎、 叶和其它可在高等植物上 发现的组织构造。藻类与 细菌和原生动物不同之处， 是藻类产生能量的方式为 光合自营性 ；琼脂（棕 藻）
国外重要菌种保藏机构
1、ATCC：美国模式培养物（菌）保藏中心 2、NRRL：美国农业部北方开发利用研究部 3、CSH：美国冷泉港研究所 4、IAM：日本东京大学应用微生物研究所 5、IFO：日本发酵研究所（大阪） 6、NCTC：英国国立标准菌种收藏所 7、CBS：荷兰真菌中心保藏所
三、生产中常用菌种的分离、选 育（screening ）
（一）微生物菌种的分离 四步骤： 样品采集 增值培养 纯种分离 生产性能的测定
1.施加选择压力分离法
施加选择性压力分离法
主要是利用不同种类的微生物其生长繁殖对环境和营 养的要求不同，如温度、pH、渗透压、氧气、碳源、 氮源等，人为控制这些条件，使之利于某类或某种微 生物生长，而不利于其他种类微生物的生存，以达到 使目的菌种占优势．而得以快速分离纯化的目的。如 可以控制培养时的氧，可将好氧微生物和厌氧微生物 分开；通过控制温度，可将嗜热微生物和非嗜热微生 物分开；控制pH，可将嗜酸、嗜碱微生物分离等。在 分离培养基中也可以加入不同的抗生素或试剂来增加 选择性。如在分离放线菌和细菌时，可加入抗真菌抗 生素；分离真菌时，可加入抗细菌药物。
发酵工程第二章发酵工业菌种
④抑菌圈法 抑菌圈法所用的工具菌是一些抗生素的敏 感菌。将待检菌涂布于含高浓度的工具菌的平板培养基 上进行培养，若被检菌能分泌某些抑制工具菌生长的物 质，如抗生素等，就会在被检菌的菌落周围形成工具菌 不能生长的抑菌圈，从而使被检菌很容易被鉴别出来。 采用抑菌圈法，不仅能筛选抗生素，还能筛选某些酶类。 例如，Meevootison等提出一套利用抑菌圈筛选青霉素 酰化酶产生菌的方法。工具菌是一种对6-氨基青霉烷酸 敏感而对苄青霉素有抗性的黏性沙雷氏菌，这种菌只有 当苄青霉素尚未被别种微生物的青霉素酰化酶转化为6氨基青霉烷酸时才能生长。将工具菌与苄青霉素混合于 平板培养基中，然后将待检菌涂布于平板上，进行培养， 周围出现抑菌圈的菌落就是青霉素酰化酶产生菌。
③生长圈法 生长圈法所用的工具菌是一些营 养缺陷型菌株。将待检菌涂布于含高浓度的工 具菌并缺少工具菌所需营养物的平板培养基上， 进行培养，若某菌株能合成工具菌所需营养物， 在该菌株的菌落周围就会形成一个浑浊的生长 圈。 例如，用嘌呤缺陷型大肠杆菌作为工具菌，与 不含嘌呤的培养基混合倒平板，在平板培养基 上涂布含菌样品并恒温培养，周围出现生长圈 的菌落即为嘌呤产生菌。
养后，在数量上占优势。
分离：利用分离技术得到纯种。 菌种的筛选： 通过常规生产性能测定，进一步筛选产物合成能
力较高的菌株。
发酵性能测定：进行生产性能测定。这些特性包括形态、培养
特征、营养要求、生理生化特性、发酵周期、产品品种和产量、 耐受最高温度、生长和发酵最适温度、最适pH值、提取工艺等。
菌种保藏
等。
第二节 发酵工业菌种的分离筛选
菌种的来源
根据资料直接向有科研单位、高等院校、工厂或菌种 保藏部门索取或购买；
《发酵工程》课程教学大纲
《发酵工程》课程教学大纲课程名称：发酵工程课程类别：专业选修课适用专业：食品科学与工程考核方式：考察总学时、学分： 32 学时、2 学分一、课程教学目的发酵工程是整个生物技术的核心，是工业微生物实现试验室与工厂化生产的具体操作，是生物技术在生产实践中应用的原理及方法的一局部，是基因工程及酶工程等生物技术工业化的过程与方法。
因此，通过对《发酵工程》的学习，不仅把握发酵工程原理及发酵优化把握过程，而且对系统了解生物技术及其工业化应用都具有深远的意义。
另外，通过《发酵工程》试验及发酵工程各论的了解，不仅能够把握发酵工艺操作从小试到放大的具体过程及反响过程把握方法，而且进一步了解了目前发酵行业的具体产品生产工艺，从理论到方法学会发酵工程这一门技术，对发酵生产能够进展指导与分析。
二、课程教学要求通过本课程的教学，应使学生把握发酵工程学的根本学问和根本技能，了解现代生物工程技术的进展与应用状况，具备确定的微生物生产工程技能。
通过本课程的学习，使学生深刻理解发酵工程的微生物学原理，结实把握发酵工业菌种的筛选、驯化、培育与保藏，好氧、厌氧发酵工艺的调控与治理，了解发酵产品提取与精制的原理、流程及常见发酵产品的生产过程。
三、先修课程食品微生物学、生物化学。
四、课程教学重、难点重点：发酵工程的概念、特点；工业微生物菌种的退化、复壮与保藏；工业上常用作碳源、氮源的原料；淀粉水解糖的制备方法；微生物对培育基中的碳源代谢；酒精发酵机制；好氧发酵罐构造和功能；温度、 pH 和泡沫对发酵过程的影响；不同时间及染菌程度对发酵的影响；种子、空气、培育基和设备染菌及防治；细胞裂开方法及裂开率的测定；盐析法分别发酵产物。
难点：影响种子培育的因素和种子质量的把握；发酵生产的前体物质和促进剂、抑制剂有机酸发酵机制；染菌的检查推断及缘由分析；离子交换法原理和离子交换树指的构造与分类，膜和膜分别的根本理论。
五、课程教学方法与教学手段多媒体教学,课堂讲授与实践相结合。
【发酵工艺学总论】第二章_工业发酵菌种
代表微生物类型 革兰氏阳性球菌
高产培养基设计的几个原则
制备一系列的培养基，其中有各种类型的养分成为 生长限制因素； 使用一聚合或复合形式的生长限制养分； 避免使用容易同化的碳源或氮源，防止分解代谢物 阻遏； 确定含有所需的辅因子（Co2+,Mg2+,Mn2+,Fe2+）； 使用pH缓冲剂以减少pH变化； 前体、促进剂及抑制剂的采用。
酶发酵生产常用的微生物
微生物
枯草芽孢杆菌 大肠杆菌 黑曲霉 米曲霉 青霉 木霉 根霉
生产的酶类
α -淀粉酶、蛋白酶、β -葡聚糖酶、碱性磷酸酶等 谷氨酸脱羧酶、天冬氨酸酶、DNA聚合酶、DNA连接酶等 糖化酶、 α -淀粉酶、酸性蛋白酶、果胶酶、葡萄糖氧化酶、过氧化氢 酶、核糖核酸酶、脂肪酶、纤维素酶等 糖化酶和蛋白酶、氨基酰化酶、磷酸二酯酶、果胶酶等 葡萄糖氧化酶、果胶酶、纤维素酶、磷酸二酯酶、脂肪酶、凝乳酶、核 酸酶等 纤维素酶等 糖化酶、 α -淀粉酶、转化酶、酸性蛋白酶、核糖核酸酶、脂肪酶、果 胶酶、纤维素酶等
样品的预处理
目的：提高分离效率 方法：
物理方法：热处理（减菌）；膜过滤法（浓缩）； 离心法（浓缩） 化学方法：通过在培养基中添加某些化学成分来增加特
定微生物的数量。
几丁质——放线菌；CaCO3——嗜碱性放线菌
诱饵法
石蜡、花粉、蛇皮、毛发等
分离方法的选择
根据目的菌有无选择性特征来选择分离方法 菌种的营养特征独特 选择性分离 生长特征独特 无选择性特征 根据产物的特征进行 随机分离
增加混合菌群中所需菌株数量的一种技术 技术特点：给混合菌群提供一些有利于目的菌株生长 或不利于目的菌以外的其他菌型生长的条件 培养方式 分批培养方式：以最大比生长速率 （μmax）筛选， 存在选择压力的控制、移种时间和次数等问题 连续培养方式：以比生长速率（ μ）筛选
2发酵工业菌种制备原理和技术(2)(精)
作为种子扩大培养的方法： ① 表面培养法 ② 固体培养法 ③液体培养法（三角瓶摇床震荡或转式培养）； ④载体培养法
24
固体培养法（曲法培养）
浅盘固体培养 深层固体培养
25
优点：
（1）酶活力高。 （2）生产过程中无菌程度要求不很严格。 （3）对于固体发酵，由于产物浓度大，易于分离，可以 有效的降低产品分离成本。
NICPB 卫生部药品生物制品监察所
IV
CIVBP
中国医学科学院病毒研究所
中国兽医药品监察所
CVCC
YM
兽医微生物菌种保藏管理中心
云南省微生物研究所
10
国外重要菌种保藏机构
1、ATCC：美国模式培养物（菌）保藏中心
2、NRRL：美国农业部北方开发利用研究部
3、CSH：美国冷泉港研究所
4、IAM：日本东京大学应用微生物研究所
9
微生物菌种保藏机构名称和缩写
中 国 缩写 ACCC SH IA CCGMC AS-IV CAF IFFI ID 名称 中国农业微生物菌种保藏管理中心 上海市农业科学院食用菌研究所 中国医学科学院抗菌素研究所 普通微生物菌种保藏管理中心 中国科学院武汉病毒研究所 中国林业科学院菌种保藏管理中心 轻工业部食品发酵工业科学研究所 中国医学科学院皮肤病研究所 缩写 ISF CACC SIA AS CFCC CICC CMCC 名称 中国农业科学院土壤肥料研究 所 抗菌素菌种保藏管理中心 四川抗菌素工业研究所 中国科学院微生物研究所 林业微生物菌种保藏管理中心 工业微生物菌种保藏管理中心 医学微生物菌种保藏管理中心
22
（5）接种量
移入种子的体积 接种量＝ ————————— 接种后培养液的体积
第二章发酵工业常用微生物及其培养
河内根霉 [R. tonkinensis Vuille-min]
结节根霉 [R. nodonus Nannyslowski]
甘薯根霉 [R. batas Nakazawa]
小麦曲根霉 [R. tritici Saito] 代氏根霉 [R. delemar (Boidin) Wehemer et
Haannzawa]
• 初级阶段——自然选育
• 发展阶段——代谢控制育种 （近代）
• 高级阶段——从诱发基因突变转向基因 重组，定向育种
第二章 发酵工业常用微生物及培养
4
§2 常用的工业微生物菌种
• 微生物在工业上的用途：
－直接利用微生物菌体 －利用其代谢产物 －利用它的酶
第二章 发酵工业常用微生物及培养
5
一、霉菌（Mould）
乳酸、反丁烯二酸，能转化甾族化合物， 耐高温(45℃能生长)
9.无根根霉 [R. arrhizus Fischer]
功能：能产生乳酸、反丁烯二酸、丁烯二酸， 脂肪酶，能对甾族化合物骨架C-6β、C-11α 起羟化作用
第二章 发酵工业常用微生物及培养
22
少根根霉（低倍镜见假根）
第二章 发酵工业常用微生物及培养
第二章 发酵工业常用微生物 及其培养
•发酵工业对微生物菌种的要求 •常用的工业微生物菌种 •微生物菌种选育和优化技术 •菌种的培养（培养基的设计与优化）
第二章 发酵工业常用微生物及培养
1
• 发酵工业以微生物的生命活动为基础
原核细胞型微生物－细菌、
衣原体、立克次氏体、
•
原核生物界
支原体、螺旋体、蓝绿 藻、放线菌
第二章 发酵工业常用微生物及培养
18
例如：胆固醇
发酵工程(2)第二章 工业微生物菌种的选育与扩大培养
孢子丝盘卷成球形孢囊，内形成孢酵母菌
单细胞真核，主 分布于含糖质较多的 偏酸性环境中，如水 果、蔬菜、花蜜和植 物叶子上，以及果园 土壤中。
1、酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)
又称啤酒酵母。细胞多为圆形、 卵形，能产生子囊孢子。能发酵 葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和半乳糖 等多种糖类，但不发酵乳糖和蜜 二糖。
5、白地霉 ( Geotrichum candidum )
➢ 节孢子单个或连接成链。
➢ 白地霉菌体蛋白营养价值很高，可供食用和饲 料用，也可用来提取核酸，在废料废水的利用上很 用价值。
6、产黄头孢霉 ( Cephalosporium chrysogen ) 头孢霉素、先锋霉素
3、游动放线菌属 （Actinoplanes）
➢ 一般不形成气生菌丝，孢子球形，有时端生1-40 根鞭毛，能运动。 ➢ 济南游动放线菌生产创新霉素(creatmycin; 1964).
4、诺卡氏菌属 (Norcadia)
➢ 菌落较小，边缘多呈树根 毛状。 ➢ 生产利福霉素、蚊霉素等
5、孢囊链霉菌属 (Streptosporangium)
4、青霉 ( Penicillum )
产黄青霉 ( Penicillum chrysogenum ) 生产青霉素，也可用来生产葡萄
糖氧化酶、葡萄糖酸、柠檬酸和抗坏 血酸。
娄地青霉 ( Penicillum roqueforti ) 属不对称青霉组，具有分解油
脂和蛋白质的能力，用于制造干酪； 该菌孢子能将甘油三酯氧化为甲基 酮。
第二章 工业微生物菌种的选育与扩大培养
第一节 发酵工业常用微生物 第二节 菌种来源 第三节 菌种选育 第四节 种子扩大培养 第五节 菌种保藏
单细胞真核，主 分布于含糖质较多的 偏酸性环境中，如水 果、蔬菜、花蜜和植 物叶子上，以及果园 土壤中。
1、酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)
又称啤酒酵母。细胞多为圆形、 卵形，能产生子囊孢子。能发酵 葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和半乳糖 等多种糖类，但不发酵乳糖和蜜 二糖。
5、白地霉 ( Geotrichum candidum )
➢ 节孢子单个或连接成链。
➢ 白地霉菌体蛋白营养价值很高，可供食用和饲 料用，也可用来提取核酸，在废料废水的利用上很 用价值。
6、产黄头孢霉 ( Cephalosporium chrysogen ) 头孢霉素、先锋霉素
3、游动放线菌属 （Actinoplanes）
➢ 一般不形成气生菌丝，孢子球形，有时端生1-40 根鞭毛，能运动。 ➢ 济南游动放线菌生产创新霉素(creatmycin; 1964).
4、诺卡氏菌属 (Norcadia)
➢ 菌落较小，边缘多呈树根 毛状。 ➢ 生产利福霉素、蚊霉素等
5、孢囊链霉菌属 (Streptosporangium)
4、青霉 ( Penicillum )
产黄青霉 ( Penicillum chrysogenum ) 生产青霉素，也可用来生产葡萄
糖氧化酶、葡萄糖酸、柠檬酸和抗坏 血酸。
娄地青霉 ( Penicillum roqueforti ) 属不对称青霉组，具有分解油
脂和蛋白质的能力，用于制造干酪； 该菌孢子能将甘油三酯氧化为甲基 酮。
第二章 工业微生物菌种的选育与扩大培养
第一节 发酵工业常用微生物 第二节 菌种来源 第三节 菌种选育 第四节 种子扩大培养 第五节 菌种保藏
第二章 微生物菌种选育
第二章 微生物菌种选育
• 优良的菌种是发酵工业的基础和关键，是 显著改善和提高产品种类、产量以及质量 的先决条件。 • 菌种选育，就是要利用微生物的遗传变异 的特性，采用各种手段，改变菌种的遗传 性状，使其符合工业生产的需要。
本章主要内容
• 第一节 微生物发酵工业的菌种类型及来源 • 第二节 微生物发酵高产菌种选育 • 第三节 菌种的退化和菌种保藏
土样的采集方法
使预被分解的物质成为唯一的碳源或氮源 pH7.0～7.5适于细菌和放线菌，pH4.5 ～6适于霉 菌和酵母 40℃利于放线菌孢子萌发，却不利于细菌生长 限制通入氧气使厌氧菌数量增加
采用平板划线法和稀 通过压力（高温、高压、抗生素）使非目的的 释法，以时间为变量， 类群比例减少 进行纯种分离
从一些发酵制品中分离目的菌株，如酒醪中 分离淀粉酶或糖化酶的产生菌，从酱油中分 离蛋白酶产生菌，从噬菌体污染的发酵液中 分离抗噬菌体的发酵菌株等。
三、菌种微生物的选择性分离
• 菌株的分离和筛选分为以下几步：
采 样 富 集 分 离 筛 选
各种生境下的土壤是 微生物菌种最全面的 来源 人为控制条件使所期 待的目的菌种占据优 势
是单产高的营养缺陷型突变菌株或调节突变菌株或野生菌株，最 好还是抗噬菌体能力强的菌株
菌种纯粹，不易变异退化，以保证稳定性
菌种不是病原菌，不产生任何有害的生物活性物质和毒素（包括 抗生素、激素、毒素等），以保证安全
类型：包括细菌、酵母菌、霉菌和放线菌等类群，还有担子菌及藻类等
一、工业发酵常见的微生物种类
担子菌就是人们常说的菇类（mushroom）微生物。
担子菌资源的利用正引起人们的重视，如多糖、 橡胶物质和抗癌药物的研发。
6、藻类（alga）
• 优良的菌种是发酵工业的基础和关键，是 显著改善和提高产品种类、产量以及质量 的先决条件。 • 菌种选育，就是要利用微生物的遗传变异 的特性，采用各种手段，改变菌种的遗传 性状，使其符合工业生产的需要。
本章主要内容
• 第一节 微生物发酵工业的菌种类型及来源 • 第二节 微生物发酵高产菌种选育 • 第三节 菌种的退化和菌种保藏
土样的采集方法
使预被分解的物质成为唯一的碳源或氮源 pH7.0～7.5适于细菌和放线菌，pH4.5 ～6适于霉 菌和酵母 40℃利于放线菌孢子萌发，却不利于细菌生长 限制通入氧气使厌氧菌数量增加
采用平板划线法和稀 通过压力（高温、高压、抗生素）使非目的的 释法，以时间为变量， 类群比例减少 进行纯种分离
从一些发酵制品中分离目的菌株，如酒醪中 分离淀粉酶或糖化酶的产生菌，从酱油中分 离蛋白酶产生菌，从噬菌体污染的发酵液中 分离抗噬菌体的发酵菌株等。
三、菌种微生物的选择性分离
• 菌株的分离和筛选分为以下几步：
采 样 富 集 分 离 筛 选
各种生境下的土壤是 微生物菌种最全面的 来源 人为控制条件使所期 待的目的菌种占据优 势
是单产高的营养缺陷型突变菌株或调节突变菌株或野生菌株，最 好还是抗噬菌体能力强的菌株
菌种纯粹，不易变异退化，以保证稳定性
菌种不是病原菌，不产生任何有害的生物活性物质和毒素（包括 抗生素、激素、毒素等），以保证安全
类型：包括细菌、酵母菌、霉菌和放线菌等类群，还有担子菌及藻类等
一、工业发酵常见的微生物种类
担子菌就是人们常说的菇类（mushroom）微生物。
担子菌资源的利用正引起人们的重视，如多糖、 橡胶物质和抗癌药物的研发。
6、藻类（alga）
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或调节突变株或野生突变株； 5、抗噬菌体和杂菌能力强，不易被感染； 6、菌种纯粹，遗传性状稳定（不易变异退化），以保证发酵生产和产品
质量的稳定性。 7、菌体不是病源菌，不产生任何有害的生物活性物质和毒素。
三、发酵工业用菌种的分离与筛选
（一）微生物菌种分离
1、工业用菌种的来源 ：
有科研单位、高等院校、工厂或菌种保藏部门索取或 购买；
收集到的样品，如含目标菌株较多，可直接进行分离。如果 样品含目标菌种很少，就要设法增加该菌的数量，进行增殖 (富集)培养。
富集培养就是给混合菌群提供一些有利于所需菌株生长或不 利于其它菌型生长的条件，以促使目标菌株大量繁殖，从而 有利于分离它们。
定义：利用不同种类的微生物其生长繁殖对环境和营养要求 的不同，如碳、氮源、pH、温度、渗透压、需氧等生理因素 等，认为控制这些条件，使之利于某类或某种微生物生长， 而不利于其它种类微生物的生存，以达到使目的菌种占优势， 而得以快速分离纯化的目的。
培养后，在数量上占优势。 分离：利用分离技术得到纯种。 发酵性能测定：进行生产性能测定。这些特性包括形态、
培养特征、营养要求、生理生化特性、发酵周期、产品品 种和产量、耐受最高温度、生长和发酵最适温度、最适pH 值、提取工艺等。
菌种筛选主要步骤
调查研究及查阅充分的资 料
设计实验方案
确定采集样品的生态环境
菌种纯化是指在特定环境中只让1种来自同一祖先的微生物群 体生存的技术。
菌株分离、筛选虽为两个环节，但却不能绝然分开，因为分 离中的一些措施本身就具有筛选作用。工业微生物产生菌的 筛选一般包括两大部分：一是从自然界分离所需要的菌株， 二是把分离到的野生型菌株进一步纯化并进行代谢产物鉴别。
3、分离思路
高温酶产生菌：温度较高的南方，或温泉、火山爆发 处及北方的堆肥中采集样品；
低温酶产生菌：寒冷的地方，如南北极地区、冰窖、 深海中采样；
耐压菌：海洋底部采样。 耐高渗透压酵母菌：通常到甜果、蜜饯或甘蔗渣堆积
处采样。如有人曾在花蜜中分离到一株能耐30%高糖的 耐高渗透压的酵母菌。
（3）含微生物样品的富集培养（优化的过程） ----施加选择性压力分离法
从大自然中分离筛选新的微生物菌种。 经过诱变的菌株； 通过DNA重组的工程菌； 原生质体融合菌株。
2、菌株分离（separation）和筛选（screening）定义
分离和筛选就是将一个混杂着各种微生物的样品通过分离技 术区分开，并按照实际要求和菌株的特性采Байду номын сангаас迅速、准确、 有效的方法对他们进行分离、筛选，进而得到所需微生物的 过程。
新菌种的分离是要从混杂的各类微生物中依照生产的 要求、菌种的特性，采用各种筛选方法，快速、准确 地把所需要的菌种挑选出来。
实验室或生产用菌种若不慎污染了杂菌，也必须重新 进行分离纯化。
有了优良的菌种，还要有合适的工艺条件和合理先进 的设备与之配合。
4、新种分离与筛选的步骤
定方案：首先要查阅资料，了解所需菌种的生长培养特性。 采样：有针对性地采集样品。 增殖：人为地通过控制养分或培养条件，使所需菌种增殖
（2） 根据微生物生理特点采样
A、根据微生物营养类型（局部环境） 每种微生物对碳\氮源的需求不一样，分布也有差 异。研究表明，微生物的营养需求和代谢类型与其 生长环境有着很大的相关性。如： 纤维素酶产生菌：森林土； 蛋白酶和脂肪酶的产生菌：肉类加工厂附近和饭店 排水沟的污水、污泥中； 蛋白酶、糖化酶的菌株：在面粉加工厂、糕点厂、 酒厂及淀粉加工厂等场所；
以糖质为原料的酵母菌：通常到蜂蜜、蜜饯、甜果及 含糖浓度高的植物汁液中采样。
果胶酶产生菌：柑橘、草莓及山芋等果蔬样品的腐烂 部分及果园土；
筛选代谢合成某种化合物的微生物：从大量使用、生 产或处理这种化合物的工厂附近采集样品；
利用碳氢化合物为碳源的菌株：在油田附近的土壤。
筛选一些具有特殊性质的微生物时，需根据该微生物独特 的生理特性到相应的地点采样（极端环境）。如：
从自然界筛选
B、采样季节：以温度适中，雨量不多的秋初为好。
C、采土方式：在选好适当地点后，用小铲子除去表土， 取离地面5-15cm处的土约10g，盛入清洁的牛皮纸袋或 塑料袋中，扎好，标记，记录采样时间、地点、环境 条件等，以备查考。为了使土样中微生物的数量和类 型尽少变化，宜将样品逐步分批寄回，以便及时分离。
优选第二章发酵工业微 生物菌种制备原理和技 术
二、发酵工业生产对菌种的要求
1、能在易得、价廉的原料制成的培养基上迅速生长，且代谢产物产量高。 2、可以在要求不高、易于控制的培养条件下迅速生长和发酵； 3、生长速度快，发酵周期较短。发酵周期短的优点在于感染杂菌的机会
减少；提高设备的利用率。 4、满足代谢控制的要求：根据代谢控制要求，选择单产高的营养缺陷型
采
样
确定特定的增殖条件
增殖培养
确定特殊的选择培养基及可能的 定性或半定量快速检出法
平板分离
原种斜面 确定发酵培养基础条件
筛选
初筛（1株1瓶）
复筛（1株3～5瓶） 结合初步工艺条件摸索
再复筛（1株3～5瓶）
3～5株
单株纯种分离 生产性能试验、毒性试
菌种验鉴定
（1）采样
A、采样途径 向菌种保藏机构索取有关的菌株，从中筛选所需菌株。 由自然界采集样品，如土壤、水、动植物体等，从中进 行分离筛选。总体来讲土壤样品的含菌量最多。一般园 田土和耕作过的沼泽土中，以细菌和放线菌为主；富含 碳水化合物的土壤和沼泽地中，酵母和霉菌较多，如一 些野果生长区和果园内。 从一些发酵制品中分离目的菌株，如从酱油中分离蛋白 酶产生菌，从酒醪中分离淀粉酶或糖化酶的产生菌等。
B、控制培养条件 通过它们对pH、温度及通气量等其他一些条件的特 殊要求加以控制培养，达到有效的分离目的。如： 细菌、放线菌的生长繁殖一般要求偏碱（7.0～ 7.5），霉菌和酵母菌要求偏酸（4.5～6）。 筛选极端微生物时，需针对其特殊的生理特性， 设计适宜的培养条件，达到富集的目的。
A、控制培养基的营养成分 在分离该类菌株之前，可在增殖培养基中人为加入相 应的底物作惟一碳源或氮源。如： 筛选纤维素酶产生菌时，以纤维素作为唯一碳源进 行增殖培养； 分离耐高渗酵母菌：首先要到含糖分高的花蜜、糖 质中去取样。富集培养基为5%～6%的麦牙汁，30%～ 40%葡萄糖，pH3～4，在20～25℃温度下进行培养， 可以达到富集的目的。
质量的稳定性。 7、菌体不是病源菌，不产生任何有害的生物活性物质和毒素。
三、发酵工业用菌种的分离与筛选
（一）微生物菌种分离
1、工业用菌种的来源 ：
有科研单位、高等院校、工厂或菌种保藏部门索取或 购买；
收集到的样品，如含目标菌株较多，可直接进行分离。如果 样品含目标菌种很少，就要设法增加该菌的数量，进行增殖 (富集)培养。
富集培养就是给混合菌群提供一些有利于所需菌株生长或不 利于其它菌型生长的条件，以促使目标菌株大量繁殖，从而 有利于分离它们。
定义：利用不同种类的微生物其生长繁殖对环境和营养要求 的不同，如碳、氮源、pH、温度、渗透压、需氧等生理因素 等，认为控制这些条件，使之利于某类或某种微生物生长， 而不利于其它种类微生物的生存，以达到使目的菌种占优势， 而得以快速分离纯化的目的。
培养后，在数量上占优势。 分离：利用分离技术得到纯种。 发酵性能测定：进行生产性能测定。这些特性包括形态、
培养特征、营养要求、生理生化特性、发酵周期、产品品 种和产量、耐受最高温度、生长和发酵最适温度、最适pH 值、提取工艺等。
菌种筛选主要步骤
调查研究及查阅充分的资 料
设计实验方案
确定采集样品的生态环境
菌种纯化是指在特定环境中只让1种来自同一祖先的微生物群 体生存的技术。
菌株分离、筛选虽为两个环节，但却不能绝然分开，因为分 离中的一些措施本身就具有筛选作用。工业微生物产生菌的 筛选一般包括两大部分：一是从自然界分离所需要的菌株， 二是把分离到的野生型菌株进一步纯化并进行代谢产物鉴别。
3、分离思路
高温酶产生菌：温度较高的南方，或温泉、火山爆发 处及北方的堆肥中采集样品；
低温酶产生菌：寒冷的地方，如南北极地区、冰窖、 深海中采样；
耐压菌：海洋底部采样。 耐高渗透压酵母菌：通常到甜果、蜜饯或甘蔗渣堆积
处采样。如有人曾在花蜜中分离到一株能耐30%高糖的 耐高渗透压的酵母菌。
（3）含微生物样品的富集培养（优化的过程） ----施加选择性压力分离法
从大自然中分离筛选新的微生物菌种。 经过诱变的菌株； 通过DNA重组的工程菌； 原生质体融合菌株。
2、菌株分离（separation）和筛选（screening）定义
分离和筛选就是将一个混杂着各种微生物的样品通过分离技 术区分开，并按照实际要求和菌株的特性采Байду номын сангаас迅速、准确、 有效的方法对他们进行分离、筛选，进而得到所需微生物的 过程。
新菌种的分离是要从混杂的各类微生物中依照生产的 要求、菌种的特性，采用各种筛选方法，快速、准确 地把所需要的菌种挑选出来。
实验室或生产用菌种若不慎污染了杂菌，也必须重新 进行分离纯化。
有了优良的菌种，还要有合适的工艺条件和合理先进 的设备与之配合。
4、新种分离与筛选的步骤
定方案：首先要查阅资料，了解所需菌种的生长培养特性。 采样：有针对性地采集样品。 增殖：人为地通过控制养分或培养条件，使所需菌种增殖
（2） 根据微生物生理特点采样
A、根据微生物营养类型（局部环境） 每种微生物对碳\氮源的需求不一样，分布也有差 异。研究表明，微生物的营养需求和代谢类型与其 生长环境有着很大的相关性。如： 纤维素酶产生菌：森林土； 蛋白酶和脂肪酶的产生菌：肉类加工厂附近和饭店 排水沟的污水、污泥中； 蛋白酶、糖化酶的菌株：在面粉加工厂、糕点厂、 酒厂及淀粉加工厂等场所；
以糖质为原料的酵母菌：通常到蜂蜜、蜜饯、甜果及 含糖浓度高的植物汁液中采样。
果胶酶产生菌：柑橘、草莓及山芋等果蔬样品的腐烂 部分及果园土；
筛选代谢合成某种化合物的微生物：从大量使用、生 产或处理这种化合物的工厂附近采集样品；
利用碳氢化合物为碳源的菌株：在油田附近的土壤。
筛选一些具有特殊性质的微生物时，需根据该微生物独特 的生理特性到相应的地点采样（极端环境）。如：
从自然界筛选
B、采样季节：以温度适中，雨量不多的秋初为好。
C、采土方式：在选好适当地点后，用小铲子除去表土， 取离地面5-15cm处的土约10g，盛入清洁的牛皮纸袋或 塑料袋中，扎好，标记，记录采样时间、地点、环境 条件等，以备查考。为了使土样中微生物的数量和类 型尽少变化，宜将样品逐步分批寄回，以便及时分离。
优选第二章发酵工业微 生物菌种制备原理和技 术
二、发酵工业生产对菌种的要求
1、能在易得、价廉的原料制成的培养基上迅速生长，且代谢产物产量高。 2、可以在要求不高、易于控制的培养条件下迅速生长和发酵； 3、生长速度快，发酵周期较短。发酵周期短的优点在于感染杂菌的机会
减少；提高设备的利用率。 4、满足代谢控制的要求：根据代谢控制要求，选择单产高的营养缺陷型
采
样
确定特定的增殖条件
增殖培养
确定特殊的选择培养基及可能的 定性或半定量快速检出法
平板分离
原种斜面 确定发酵培养基础条件
筛选
初筛（1株1瓶）
复筛（1株3～5瓶） 结合初步工艺条件摸索
再复筛（1株3～5瓶）
3～5株
单株纯种分离 生产性能试验、毒性试
菌种验鉴定
（1）采样
A、采样途径 向菌种保藏机构索取有关的菌株，从中筛选所需菌株。 由自然界采集样品，如土壤、水、动植物体等，从中进 行分离筛选。总体来讲土壤样品的含菌量最多。一般园 田土和耕作过的沼泽土中，以细菌和放线菌为主；富含 碳水化合物的土壤和沼泽地中，酵母和霉菌较多，如一 些野果生长区和果园内。 从一些发酵制品中分离目的菌株，如从酱油中分离蛋白 酶产生菌，从酒醪中分离淀粉酶或糖化酶的产生菌等。
B、控制培养条件 通过它们对pH、温度及通气量等其他一些条件的特 殊要求加以控制培养，达到有效的分离目的。如： 细菌、放线菌的生长繁殖一般要求偏碱（7.0～ 7.5），霉菌和酵母菌要求偏酸（4.5～6）。 筛选极端微生物时，需针对其特殊的生理特性， 设计适宜的培养条件，达到富集的目的。
A、控制培养基的营养成分 在分离该类菌株之前，可在增殖培养基中人为加入相 应的底物作惟一碳源或氮源。如： 筛选纤维素酶产生菌时，以纤维素作为唯一碳源进 行增殖培养； 分离耐高渗酵母菌：首先要到含糖分高的花蜜、糖 质中去取样。富集培养基为5%～6%的麦牙汁，30%～ 40%葡萄糖，pH3～4，在20～25℃温度下进行培养， 可以达到富集的目的。