第05章 酶的工业提取

有机溶剂之所以能使酶沉淀析出。主要是由于有机溶剂 的存在会使溶液的介电常数降低。例如，20℃时水的介 电常数为80，而82％乙醇水溶液的介电常数为40。溶液 的介电常数降低，就使溶质分子间的静电引力增大，互 相吸引而易于凝集，同时，对于具有水膜的分子来说， 有机溶剂与水互相作用，使溶质分子表面的水膜破坏， 也使其溶解度降低而沉淀析出。 常用于酶的沉淀分离的有机溶剂有乙醇、丙酮、异丙醇、甲醇等
5.2.5离心分离
离心分离是借助于离心机旋转所产生的离心力，使不同大 小、不同密度的物质分离的技术过程。 在离心分离时，要根据欲分离物质以及杂质的颗粒大小、 密度和特性的不同，选择适当的离心机、离心方法和离心条 件。
常速离心机又称为低速离心机, 其最大转速在8000 r/min以内，相对离心 力（RCF）在1×104 g 以下，在酶的分离纯化过程中，主要用于细胞、细 胞碎片和培养基残渣等固形物的分离。也用于酶的结晶等较大颗粒的分离。 高速离心机的最大转速为（1～2.5）×104 r/min ，相对离心力达到 1×104～ 1×105 g ，在酶的分离中主要用于沉淀、细胞碎片和细胞器等的分离。为了 防止高速离心过程中,温度升高而造成酶的变性失活,有些高速离心机装设有 冷冻装置,谓之高速冷冻离心机。 超速离心机的最大转速达 (2.5～12)×104 r/min，相对离心力可以高达 5×105 g甚至更高。超速离心主要用于DNA、RNA、蛋白质等生物大分子以及细胞器、 病毒等的分离纯化；样品纯度的检测；沉降系数和相对分子质量的测定等。
层析方法
分离依据
吸附层析
分配层析 离子交换层 析 凝胶层析 亲和层析 层析聚焦
利用吸附剂对不同物质的吸附力不同而使混合 物中各组分分离
利用各组分在两相中的分配系数不同，而使各 组分分离 利用离子交换剂上的可解离基团（活性基团） 对各种离子的亲和力不同而达到分离目的 以各种多孔凝胶为固定相，利用流动相中所含 各种组分的相对分子质量不同而达到物质分离 利用生物分子与配基之间所具有的专一而又可 逆的亲和力，使生物分子分离纯化 将酶等两性物质的等电点特性与离子交换层析 的特性结合在一起，实现组分分离
目录
5.1.1酶分离纯化的基本原则
1.防止酶变性失效 （1）一般在低温下进行 （2）控制pH不要过酸、过碱 （3）尽量减少泡沫 （4）防止重金属、有机溶剂引起酶变性，防止微生物污 染和蛋白酶水解。 2.选择有效的纯化方式 （1）在不破坏待纯化酶的限度内，使用各种“激烈” 手 段。 （2）使用亲和剂进行纯化。 3.酶活性测定贯穿纯化过程始终。
温度差破碎法 压力差破碎法 超声波破碎法 有机溶剂： 甲苯、丙酮 丁醇、氯仿 表面活性剂： Triton、Tween 自溶法 外加酶制剂法
本章 目录
化学破碎
通过各种化学试剂对细胞 膜的作用，而使细胞破碎
酶促破碎
通过细胞本身的酶系或外 加酶制剂的催化作用，使 细胞外层结构受到破坏， 而达到细胞破碎
5.2.3 酶的提取
5.3.1 膜分离
借助于一定孔径的高分子薄膜，将不同大小、不同形状和不同特性 的物质颗粒或分子进行分离的技术称为膜分离技术。膜分离所使用的薄 膜主要是由丙烯腈、醋酸纤维素、赛璐玢以及尼龙等高分子聚合物制成 的高分子膜。有时也可以采用动物膜等。膜分离过程中，薄膜的作用是 选择性地让小于其孔径的物质颗粒或分子通过，而把大于其孔径的颗粒 截留。膜的孔径有多种规格可供使用时选择。
5.2.6 萃取分离
萃取分离是利用物质在两相中的溶解度不同 而使其分离的技术。萃取分离中的两相一般 为互不相溶的两个液相。有时也可采用其它 流体。
按照两相的组成不同，萃取可以分为：
有机溶剂萃取
双水相萃取 超临界萃取 反胶束萃取
5.3酶的精制（细分离）
5.3.1 膜分离
5.3.2 层析分离
5.3.3 电泳分离
吸附层析通常采用柱 型装置，将吸附剂装 在吸附柱中，装置成 吸附层析柱。
在洗脱时，层析柱内 不断发生解吸、吸附、 再解吸、再吸附的过 程。
分配层析
分配系数是指一种溶质在两种互不相溶的溶剂中溶解达到平衡 时，该溶质在两项溶剂中的浓度的比值。在层析条件确定后， 层析系数是一常数。
在分配层析中，通常采用一种多孔性固体支持 物（如滤纸、硅藻土、纤维素等）吸着一种溶 剂为固定相，这种溶剂在层析过程中始终固定 在多孔支持物上。另一种与固定相溶剂互不相 溶的溶剂可沿着固定相流动，称为流动相。当 某溶质在流动相的带动流经固定相时，该溶质 在两相之间进行连续的动态分配。
1～20 (10,000-40,000)
纳滤 NF
反渗 透 RO
>1 (100～1000)
(>100)
压力差， <1000kPa
压力差， >1000kPa
优先吸附、 表面电位
优先吸附、 溶解扩散
四种常用膜分离过程的截留特性
5.3.1层析分离
层析技术，亦称色谱技术，是一种物理的分离方法。它是利 用混合物中各组分的物理化学性质的差别，使各组分以不同 程度分布在两个相中，其中一个相为固定的(称为固定相)， 另一个相则流过此固定相(称为流动相)并使各组分以不同速 度移动，从而达到分离。
本章 目录
5.2.4 沉淀分离
沉淀分离是通过改变某些条件或添加某种物质，使酶的溶解 度降低，而从溶液中沉淀析出，与其它溶质分离的技术过程。
沉淀分离方法 盐析沉淀法 分离原理 利用不同蛋白质在不同的盐浓度条件下溶解度不同的特性，通 过在酶液中添加一定浓度的中性盐，使酶或杂质从溶液中析出 沉淀，从而使酶与杂质分离 利用两性电解质在等电点时溶解度最低，以及不同的两性电解 质有不同的等电点这一特性，通过调节溶液的pH值，使酶或杂 质沉淀析出，从而使酶与杂质分离 利用酶与其它杂质在有机溶剂中的溶解度不同，通过添加一定 量的某种有机溶剂，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分 离
等电点沉淀法
有机溶剂沉淀法
复合沉淀法
选择性变性沉淀 法
在酶液中加入某些物质，使它与酶形成复合物而沉淀下来，从 而使酶与杂质分离
选择一定的条件使酶液中存在的某些杂质变性沉淀，而不影响 所需的酶，从而使酶与杂质分离
在盐浓度达到某 一界限后，酶的 溶解度随盐浓度 升高而降低，这 称为盐析现象。
在蛋白质的盐析中，通常采用的中性盐有硫酸铵、硫酸钠、硫酸钾、硫酸镁、 氯化钠和磷酸钠等。其中以硫酸铵最为常用。这是由于硫酸铵在水中的溶解度大而 且温度系数小，不影响酶的活性，分离效果好，而且价廉易得。然而用硫酸铵进行 盐析时，缓冲能力较差，而且铵离子的存在会干扰蛋白质的测定，所以有时也用其 它中性盐进行盐析。在盐析时，溶液中硫酸铵的浓度通常以饱和度表示。
第五章 酶的分离纯化
Contents of chapter 5
Go Go Go Go
1、酶的提取与分离纯化技术路线 2、酶的粗分离 3、酶的精制 4、酶的浓缩、干燥、结晶
细胞结构与酶分布
5.1 酶的提取、分离纯化技术路线
细胞破碎 动物、植物或微生物细胞 发酵液
酶提取
酶分离纯化
酶浓缩
酶贮存 离心，过滤，沉淀，层析，电 泳，萃取，结晶等。
5.2.1 发酵液预处理
1.发酵液相对纯化
2.发酵液固液分离
1.发酵液相对纯化
（1）无机离子的去除
（2）杂蛋白的去除
（3）色素及其他物质的去除
（1）无机离子的去除
钙离子——草酸 镁离子——三聚磷酸钠 铁离子——黄血盐
（2）杂蛋白的去除
1）沉淀法——pH、盐析 2）变性法——加热、极端pH、有机溶剂 3）凝聚和絮凝——电解质、有机絮凝剂 4）吸附法——吸附剂
提高温度，降低溶液粘度、增加扩散面积、縮短扩散距离，增大浓 度差等都有利于提高酶分子的扩散速度，从而增大提取效果。
为了提高酶的提取率并防止酶的变性失活，在提取过程中还要注 意控制好温度、pH值等提取条件。
酶的主要提取方法
提取方法 盐溶液提取 使用的溶剂或溶液 提取对象 0.02～0.5mol/L的盐溶液 用于提取在低浓度盐溶液中溶解度 较大的酶
JY92-II D超声波 细胞粉碎机 高 压 细 胞 破 碎 机
1）机械破碎
2）物理破碎
3）化学破碎 4）酶解破碎
DY89-I型 电动玻璃匀浆机
细 胞 破 碎 珠
细胞破碎方法及其原理
机械破碎 通过机械运动产生的剪切 力，使组织、细胞破碎。 捣碎法 研磨法 匀浆法
物理破碎
通过各种物理因素的作用， 使组织、细胞的外层结构破 坏，而使细胞破碎。
酶分离纯化过程
酶的纯化过程，约可分为三ein): 采样 → 均质 打破细胞 → 抽出全蛋白，多使用盐析沉淀法； 可以粗略去除蛋白质以外的物质。
(2) 部分纯化 (partially purified): 使用各种 柱层析法。均质酶 (homogeneous): 目标酶的进 一步精制纯化，可用制备式电泳或高效液相色谱。 (3)浓缩与干燥 （concentration and desiccation）使酶与溶剂分离的过程，使用蒸发、 冷冻干燥等方法。 本章
酶的提取是指在一定的条件下，用适当的溶剂或溶液处理含 酶原料，使酶充分溶解到溶剂或溶液中的过程。也称为酶的 抽提。 酶提取时首先应根据酶的结构和溶解性质，选择适当的溶剂。 一般说来，极性物质易溶于极性溶剂中，非极性物质易溶于 非极性的有机溶剂中，酸性物质易溶于碱性溶剂中，碱性物 质易溶于酸性溶剂中。 酶都能溶解于水，通常可用水或稀酸、稀碱、稀盐溶液等进 行提取，有些酶与脂质结合或含有较多的非极性基团，则可 用有机溶剂提取。
（3）色素及其他物质的去除
活性炭 离子交换树脂、离子交换纤维 大孔吸附树脂 专用脱色树脂
2.发酵液固液分离
——过滤
过滤是借助于过滤介质将不同大小、不同形状的物 质分离的技术过程。
提高过滤性能的方法 絮凝和凝聚 稀释 助滤剂——不可压缩的多孔微粒