黄曲霉毒素检测
食品中黄曲霉毒素的检测2
黄曲霉毒素的检测
检测标准
其它
(1)WHO/FAO标准。国家卫生组（WHO）世界粮农组织 所属的食品法典委员（CAC）推荐食品、饲料中黄曲霉 毒素最大允许量标准为总量（B1+B2+G1+G2） 15ug/kg 牛奶中M1的最大允许量为0.5ug/kg
3.黄曲霉毒素B1标准应用液I（1ug/mL）：吸取1.0mL 10ug/mL的黄曲霉毒素B1标准贮备液于10mL容量瓶中，加苯乙腈混合溶液定容。
4.黄曲霉毒素B1标准应用液II（0.2ug/mL）：吸取1.0mL 1ug/mL的黄曲霉毒素B1标准应用液I于5mL容量瓶中，加苯-乙 腈混合溶液定容。
2.结构
B1
B2
G1
G2
M1
M2
黄曲霉毒素的性质
在紫外线下，黄曲霉毒素B1，B2发蓝色荧光，黄 曲霉毒素G1，G2发绿色荧光.
黄曲霉毒素的相对分子量为312-346.难溶于水， 易溶于油、甲醇、丙酮和氯仿等有机溶剂，但不溶 于石油醚、己烷和乙醚中.
一般在中性溶液中较稳定，但在强酸性溶液中稍有 分解，在pH9-10的强碱溶液中分解迅速.
黄曲霉毒素的种类及其结构
1.种类 黄曲霉毒素在紫外线照射下能产生荧光，根据
荧光颜色不同，将其分为B族（蓝色荧光）和G 族（绿色荧光）两大类及其衍生物 ，主要有 B1,B2,G1,G2以及B1的代谢产物M1和M2。 B1是最危险的致癌物，经常在玉米，花生，棉 花种子及一些干果中常能检测到，M1和M2 主 要存在于牛奶中 。
线上用微量注射器滴加样液和标准液 第一点：10uL 0.04ug/mL AFT B1 标液 第二点：20uL样液 第三点：20uL 样液 + 10uL 0.04ug/mL AFT B1 标液 第四点：20uL 样液 + 10uL 0.2ug/mL AFT B1 标液
黄曲霉的检测方法
黄曲霉的检测方法黄曲霉是一种常见的真菌，它能够在多种环境中生存并繁殖，包括食物、土壤和空气中。
黄曲霉产生的黄曲霉毒素对人体健康有一定的威胁，因此对黄曲霉的检测非常重要。
下面将介绍几种常用的黄曲霉检测方法。
1. 气相色谱法：气相色谱法是一种常用的检测黄曲霉毒素的方法。
该方法将样品中的黄曲霉毒素提取出来，然后使用气相色谱仪进行分析。
由于不同的黄曲霉毒素具有不同的化学性质，所以可以通过检测毒素的特定化合物来确定样品中是否存在黄曲霉毒素。
2. 高效液相色谱法：高效液相色谱法也是一种常用的检测黄曲霉毒素的方法。
该方法将样品中的黄曲霉毒素提取出来，然后使用高效液相色谱仪进行分析。
与气相色谱法相比，高效液相色谱法对样品的处理过程相对简单，分离效果较好。
3. 免疫学方法：免疫学方法是一种常用的检测黄曲霉的方法。
该方法使用特异性抗体与样品中的黄曲霉结合，然后通过标记物的信号来检测黄曲霉的存在。
常见的免疫学方法包括酶联免疫吸附试验（ELISA）和免疫荧光法。
免疫学方法具有操作简单、灵敏度高的特点，可以用于大规模的样品检测。
4. PCR法：PCR（聚合酶链式反应）是一种常用的检测黄曲霉的方法。
该方法利用黄曲霉的DNA进行扩增，并通过特定的引物和探针进行检测。
PCR法具有高灵敏度、高特异性和高快速性的特点，可以快速检测出样品中的黄曲霉。
5. 传统培养法：传统培养法是一种直接检测黄曲霉的方法。
该方法将样品培养在含有特定营养物质的培养基上，然后通过观察菌落形态、颜色和特点来确定是否存在黄曲霉。
尽管传统培养法操作相对简单，但其结果需要较长时间才能得到。
除了以上提到的方法，还有其他一些新兴的检测黄曲霉的方法，如纳米技术、蛋白质质谱法等。
这些方法在样品处理、快速性、灵敏度和特异性等方面都有所改进和突破，可以更好地用于黄曲霉的检测。
总之，对于黄曲霉的检测，可以选择适合的方法进行，根据需要和实际情况选择不同的方法。
不同的方法有其优缺点，需要根据实际应用需求进行选择。
《黄曲霉毒素检测》课件
2017：规定了食品中黄曲霉毒素 M1和M2的液相色谱-串联质谱测 定方法。
欧盟标准
EC 450/2009
规定了食品中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的限量要求和检 测方法。
EC 152/2013
规定了食品中黄曲霉毒素M1和M2的限量要求和检测方法。
中国标准
GB 5009.22-2016
致癌性
黄曲霉毒素是一种强烈的 致癌物质，可导致肝癌、 胃癌、肠癌等癌症的发生 。
急性中毒
摄入大量黄曲霉毒素可引 起急性中毒，出现恶心、 呕吐、腹痛等症状。
慢性影响
长期摄入低量的黄曲霉毒 素也可能对健康造成潜在 危害，如影响肝脏功能、 降低免疫力等。
02
黄曲霉毒素检测方法
薄层色谱法
总结词
一种经典、常用的黄曲霉毒素检测方法。
预防疾病是保障人类健康的重要途径，而黄曲霉毒素检测是预防疾病的重要手段 之一。加强黄曲霉毒素检测，有助于降低疾病的发生率，提高人民的健康水平。
维护人类健康
人类健康是社会发展的重要基石，而黄曲霉毒素检测是维 护人类健康的重要手段之一。通过检测，可以及时发现食 品中黄曲霉毒素的污染情况，采取有效措施防止其进入市 场，保护消费者的健康权益。
国际化
推动黄曲霉毒素检测方法的国际标准 化，加强国际间的交流与合作，促进 检测技术的发展和创新。
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荧光光度法利用荧光物质与目标化合物的特异性结合反应，通过荧光信号的检测和分析，对目标化合物进行定性 和定量分析。该方法可用于黄曲霉毒素的定量分析，具有高灵敏度、高选择性等优点，但需要特定的荧光物质和 操作技术。
03
黄曲霉毒素检测标准
黄曲霉毒素检测方法
黄曲霉毒素检测方法
一、黄曲霉毒素检测方法二、黄曲霉毒素的临床特征三、黄曲霉毒素中毒的急救措施
黄曲霉毒素检测方法1、生物鉴定法可检测黄曲霉素
其特点是待检样品不需很纯,主要用于定性,共有10种:抑菌试验;对微生物遗传因子影响试验;细菌发光试验;荧光反应;组织培养检测法;鸡胚试验;鸭胚试验;鳟鱼试验;植物试验;饲喂实验动物试验。
生物鉴定法是利用AFT能影响微生物、水生动物、家禽等生物体的细胞代谢,来鉴定AFT的存在。
其方法专一性差,灵敏度低,一般只作为化学分析法的佐证。
2、化学分析法可检测黄曲霉素
最常用的为薄层层析法(TLC),适用于粮食及其制品、调味品等AFB1的检测,主要是半定量。
利用AFB1具有荧光性的特点,提取和浓缩样品中的AFB1,用单向或双向展开法在薄层上分离后,在365nm紫外光照射下产生蓝紫色荧光,根据在薄层上显示荧光的最低检出量定量,其灵敏度为5μg/kg。
由于薄层层析法测定AFB1不是很专一,因此样品中其他荧光物质的干扰造成测定误差。
3、仪器分析法可检测黄曲霉素
高效液相色谱法(HPLC)是20世纪70年代初发展起来的一种以液体为流行相的新型色谱技术。
是分离分析各种AFT的好方法,如配以荧光检测器,则该法具有灵敏度高、分离能力强、特异性好、测定结果准确可靠等优点。
在国外己广泛地用于食品中AFT的测定。
但由于食物样品成分复杂,在进行液相色谱分离分析前,需对样品作彻底有效的净化处理。
常用的净化方法是柱色谱法,该法操作繁琐,且需使用大量有机溶剂。
饲料中黄曲霉毒素含量检测实验注意事项
饲料中黄曲霉毒素含量检测实验注意事项
1. 在进行饲料中黄曲霉毒素含量检测实验前，需要确保实验室环境清洁，并进行必要的消毒措施，以防止实验过程中的污染。
2. 提前准备好所有实验所需的试剂和设备，并检查其是否符合规定的要求和标准，确保实验的准确性和可靠性。
3. 在进行实验操作之前，要对样品进行必要的预处理，如研磨、溶解等，以获得准确的测试结果。
4. 在操作过程中，需要严格控制实验条件，如温度、湿度和
pH等，以保证实验的一致性和可重复性。
5. 在进行样品提取和净化时，要注意使用合适的试剂和方法，避免对待测物质造成干扰或破坏。
6. 在进行检测时，要按照检测方法的要求和操作步骤进行操作，确保操作的正确性和一致性。
7. 实验过程中要做好实验记录，包括实验条件、操作步骤、实验结果等，以备后续的数据分析和结果判定。
8. 尽量避免长时间暴露在样品和试剂等可能含有毒性的物质中，确保实验操作的安全性。
9. 实验结束后，要及时清理实验现场和设备，妥善处理实验废弃物，以保持实验室的整洁和环境的安全。
10. 在整个实验过程中，要严格遵守实验室安全规定，如佩戴实验手套、护目镜等个人防护设备，避免发生意外事故。
黄曲霉毒素的检测及防控
酶联免疫法
原理：利用抗原抗体反应并由酶催化底 物产生颜色进行定量的分析方法 优点： 1、操作简便、成本较低 2、有些商品化的试剂盒检测限能达到 1ppb 缺点：有假阳性的存在
黄曲霉毒素的毒理作用
黄曲霉毒素是潜在的肝脏毒素。当大剂量摄入 这些毒素时可能是致命的。亚致死剂量会导致慢 性中毒，而低剂量的长期接触则会致癌，特别是 导致肝癌。通常，动物幼仔比成年动物更加容易 遭受黄曲霉毒素的毒害。 黄曲霉毒素引起了人们对健康最强烈的关注， 是因为其广泛分布于一些食物诸如花生、坚果、 牛奶、玉米中，同时也是人类潜在的致癌原。
均匀分布（如蛋白质） 不均匀分布（黄曲霉毒素）
所谓“ppb”
1，000，000，000中的1分子 32年中的1秒 地球至月球总距离中的40cm 22公斤沙子中的1粒 3.5车厢中的1粒玉米
检测误差 Errors in Analysis
100%总误差
88%采样误差
10%制样误差 2%检测误差
集装箱
组织国内能力验证活动 4
Date: 2006(on going) Analyse: Aflatoxin Analysis in Peanut paste Sponsor: CNAS Round: CANS T0339
Attended Laboratory
Number : 74
黄曲霉毒素的产生
黄曲霉毒素主要由黄曲霉和寄生曲霉等 在代谢过程中产生。 黄曲霉毒素产生的条件：菌株的产毒能 力、适宜的湿度（80%-90%相对湿度和基 质的含水量）、温度（24-30度）、氧气 （1%以上）、培养时间、机械损伤、昆 虫损害等。
黄曲霉毒素检测标准方法汇总
流动相的梯度变化表（GBT 5009.23-2006 食品中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的测定）
标准方法检出限（GBT 23212-2008）
次氯酸钠溶液（消毒用）：
取100g漂白粉，加入500ml水，搅拌均匀。
另将80g工业用碳酸钠（Na2CO3·10H2O）溶于500ml温水中，再将两液混合、搅拌、澄清后过滤。
此滤液含次氯酸浓度约为25g/L。
若用漂粉精制备，则碳酸钠的量可以加倍。
所得溶液的浓度约为50g/L。
污染的玻璃仪器用10g/L次氯酸钠溶液浸泡半天或用50g/L次氯酸钠溶液浸泡片刻后，即可达到去毒效果。
（GBT 5009.22-2003 食品中黄曲霉毒素B1的测定）
AFT B1标准溶液配制
1 仪器校正，测定重铬酸钾溶液的摩尔消光系数，以求出使用仪器的校正因素f
2 标准溶液配制，配制AFT B1标准溶液，用紫外分光光度计测此溶液最大吸收峰的波长及该波长的吸光度值，计算AFT B1标准液浓度，后用苯-乙腈混合液调到标准液为10.0ug/ml，并用分光光度计核对浓度。
（GBT 5009.22-2003 食品中黄曲霉毒素B1的测定）。
黄曲霉毒素检测方法国标
黄曲霉毒素检测方法国标
黄曲霉毒素检测方法国标是指按照中国国家标准制定的黄曲霉毒素检测方法。
目前，中国国家标准中规定的黄曲霉毒素检测方法主要有两种：液相色谱-质谱联用法和酶联免疫吸附测定法。
这两种方法都是目前应用较广泛且效果较好的检测方法。
液相色谱-质谱联用法是一种高灵敏度、高选择性的方法，能够同时检测多种黄曲霉毒素，包括黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2等。
该方法通过液相色谱分离，再通过质谱联用技术进行鉴定和定量，具有高精确度和准确性。
酶联免疫吸附测定法是一种简便快速的检测方法，该方法通过将黄曲霉毒素与特异性抗体结合，然后通过酶标记的二抗或底物发生染色反应来检测黄曲霉毒素的存在。
该方法速度快、操作简便，适用于快速筛查和初步定量。
需要强调的是，具体的黄曲霉毒素检测方法国标可能会因地区和标准的变化而有所差异，建议使用时查阅当地的相关标准或咨询专业机构进行确定。
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高效液相色谱法(HPLC)
以C18柱为固定相,以水+异丙醇+乙腈(80 +12+8) 为流动相,用荧光检测器进行检测,其激发波长365 nm, 发射波长450 nm,以保留时间定性，峰面积定量，这 些基本参数大致相同，但在流动相的选用上却差异较 大。样品用甲醇和水混合液进行萃取,随后进行衍生化 处理,处理后溶解于流动相,进行液相色谱测定。
衍生方法
可分为柱前衍生法和柱后衍生法。对黄曲霉 毒素衍生的目的主要是为了增加测定时的荧 光强度，柱前衍生法主要有三氟乙酸和稀盐 酸法，柱后衍生法主要有溴法和碘法。柱后 衍生需增加泵、校后反应器和控温箱等装量。 在实践中以柱前衍生较多，因柱前衍生法容 易推广，且大多采用三氟乙酸衍生，并在衍 生前后分别用氮气或直接吹气挥干。
黄曲霉素检测
黄曲霉毒素介绍
黄曲霉毒素(aflatoxin，简称为AF)是到目前为止发 现的毒性最大的真菌毒素。 它可通过多种途径污染食品和饲料，直接或间接 进入人类食物链，威胁人类健康和生命安全，对人体 及动物内脏器官尤其是肝脏损害严重，该毒素是黄曲 霉和寄生曲霉中产毒菌株的代谢产物，普遍存在于霉 变的粮食及粮食制品中。黄曲霉毒素十分耐热，加热 至230℃才能被完全破坏，因此一般烹饪加工也不易 消除。
中国食品中黄曲霉毒素的限量标准
标准
GB2761-81
食品种类
玉米、花生仁、花生油
最大限量
20μg/kg
大米、其他食用油
其他粮食豆类、发酵食品
10μg/kg
5μg/kg
婴儿代乳食品
GB9676-88 牛乳及其制品
不得检出
0.5μg/kg
生物鉴定法
免疫分析法
检测方法
化学分析法
仪器分析法
黄曲霉毒素的检测方法
黄曲霉毒素危害的预防
1、防霉：最好的预防方法是防止粮食等食物 的霉变。黄曲霉菌产毒要求的温度为 12℃~42℃，最适温度为25.7℃~32℃。 2、去毒：黄曲霉毒素耐热，B1的分解温度 为268℃左右 黄曲霉毒素多存在食物的表 面，最简单的方法就是直接丢弃明显生霉、 破损的粮食，不要食用。
目前，测定食品中的黄曲霉毒素的方法有：薄层层析法、液相色谱法、放 射免疫分析法、酶联免疫法、亲和层析法、微柱筛选法、金标试纸法等。 这些方法或多或少都具有如下不足之处： （1）、在操作过程中，需要使用剧毒的黄曲霉毒素M1作为标定标准物， 对操作人员造成巨大的沾 污危险，而且黄曲霉毒素M1标准物质购买十分困难。 （2）、操作过程烦琐、复杂、时间长，劳动强度大。 （3）、仪器设备昂贵、笨重、操作复杂，难以实现现场快速分析。 （4）、灵敏度较差，重复性很难得到满意结果。
薄层色谱法（TLC）
其原理是:样品经提取、浓缩、薄层分离后,在 365 nm波长的紫外光照射下,黄曲霉毒素B1、 B2产生紫色荧光,G1、G2产生绿色荧光,然后 根据其在薄层板上显示的荧光的最低检出量 来定量。 优点是:所用的试剂、设备简单,费用低廉,容 易掌握,适用大量样品的分离、筛选,一般的实 验室均可开展,属于定性和半定量的功能。
金标试纸法
金标试纸法是利用单克隆抗体而设计的固相免疫分析法,可一 步式检测AFT。一步式AFT快速检测纸法可在5~10 min完成对样 品中AFB1的定性测定,具有简单、快速、灵敏度高等特点,无须仪 器设备配合测定,检测既可在实验室中进行,也可在农场、饲料混 合车间等进行实地测定,对黄曲霉毒素定性检测准确度在85 %以 上,灵敏度为4 ng/mL ,可测出样品中20 ng/g的黄曲霉毒素[10]。 Sun Xiu lan等合成一种对AFB1具有特异性的抗体金标探针,该纳 米金标探针用于免疫色谱法对AFB1分析,完成一个样品分析所需 要的时间少于10 min,比ELISA少6~10 min,在标准品的对照下,最 低检测限可达2.5ng/mL
耐热性强
在一般的烹调加工温度下，黄曲霉毒素被破 坏的很少；即使是 200℃高温加热，也不能 完全正确破坏。一般黄曲霉毒素的裂解温度 为280℃，黄曲霉毒素为止发现的黄曲霉毒素主要有4种：即 B1、B2、C1、G2，其中B1被认为是主要的有 毒物质，有2种这些毒素的代谢产物M1和M2。 其中黄曲霉毒素B1主要存在于农产品，动物饲 料，中药等产品中；黄曲霉毒素M1是动物摄入 黄曲霉毒素B1后在体内经羟基化代谢的产物， 一部分从尿和乳汁排出，一部分存在于动物的 可食部分，如乳、肝、蛋类、肾、血和肌肉中， 其中以乳最为常见。 黄曲霉毒素M1的毒性和致癌性与黄曲霉毒 素B1的基本相似。由于牛乳及其制品是人类、 特别是婴儿的主要食品，所以其危害性更大。
免疫亲和柱法(IAC-AFLATEST)
为了开发一种简单、快速、灵敏、准确的分析方法,美国VICAM(维康) 公司与哈佛大学、麻省理工学院、约翰－霍普金斯大学、AOAC、FDA、 FGIS、美国农业部等著名大学和政府机构通力合作，发明研制了一系列以 单克隆免疫亲和柱为分离手段，用荧光计、紫外灯作为检测工具的分析方 法。该项技术有一下特点： 1、认证机构广泛，通用性强 2、分析速度快，一个样品只需10－15分钟，其他传统的方法要做到定量 分析需要几小时至几天的时间。 3、灵敏度高，测定范围广泛（0－ 300ppb）,用荧光计可以测定0.1ppb的黄曲霉毒素M1，用HPLC可以检测 出10ppt的黄曲霉毒素M1。 4、采用单克隆免疫技术，可以特效性地将黄曲霉毒素和其他真菌毒素分 离出来，分离效率和回收率高，正确性和可靠性强。 5、仪器轻便容易携带，自动化程度高，操作简单，直接读出测试结果， 对实验操作人员要求不高，可以在小型实验场所使用。 6、不需要剧毒的黄曲霉毒素和其他真菌毒素标准物来标定，所以在整个 实验过程中，绝对安全可靠。
酶联免疫吸附法(ELISA)
是抗原(抗体)吸附剂和用酶标记的抗体(抗原) 与标本中的待测物(抗原和抗体)起特异的免疫 学反应，用测定酶活力的方法来增加测定的 敏感度。大致采用两种方式检测黄曲霉毒素， 一种是用双抗体夹心法，另一种是用竞争法。
微柱法
测定黄曲霉毒素，是利用微柱管内的硅镁型 吸附剂吸附黄曲霉毒素并在365 nm紫外光下 显示荧光，其强度与一定浓度的黄曲霉毒素 含量成正比关系，由此可简略定量黄曲霉毒 素。
黄曲霉毒素分布范围广
黄曲霉毒素存在于土壤、动植物、各种坚果（特 别是花生和核桃中）中。日常检验发现在大豆、谷物、 玉米、通心粉、调味品、牛奶、奶制品、食用油等制 品中也经常发现黄曲霉毒素（其中以花生和玉米污染 最严重）。
毒性极强
黄曲霉毒素进入人体后主要经消化道吸 收，大部分分布 在肝脏、肾脏。因此主要引 发肝癌、胃癌等，还可以诱发骨癌、肾癌、 直肠癌、乳腺癌、卵巢癌等。黄曲霉毒素如 不连续摄入，一般不在体内积蓄。一次摄入 后约1周将大部分排出。只有严重霉变的粮食 才可能会含有大量毒素，导致急性毒性。
生物鉴定法
利用 AFT 能影响微生物、水生动物及家禽等生物 体的细胞代谢, 来鉴定 AFT 的存在, 其特点是待检 样品不需很纯, 主要用于定性鉴定, 包括: ① 抑菌试 验; ② 对微生物遗传因子影响试验; ③ 细菌发光试 验; ④ 荧光反应; ⑤ 组织培养检测法; ⑥ 鸡胚试验; ⑦ 鸭胚试验; ⑧ 鳟鱼试验; ⑨植物试验; ⑩ 饲喂实验 动物试验。这些方法专一性差, 灵敏度低, 一般只作 为化学分析法的佐证。
最新国标方法“免疫亲和柱法”较好的解决了上面的不足，该 种方法可以采用配套的荧光仪进行检测，也可以和高效液相色 谱法结合，解决标准物污染和操作过程繁复等问题。同时该种 方法有着较好的权威性和通用性，且为国外多个组织认可，被 列为标准方法，如： 美国公职分析化学家协会（AOAC） 美国农业部联邦谷物检测中心（FGIS） 国际纯粹与应用化 学协会（IUPAC） 美国食品药品行政署（US-FDA） 美国农业部（USDA） 同时在国内被认证的机构： 中国出入境检验检疫局（CIQ）、 中华人民共和国国家标准（GB）