黄曲霉毒素检验方法
黄曲霉毒素国标检测方法
黄曲霉毒素国标检测方法
黄曲霉毒素（AF）是一种由黄曲霉属真菌产生的有毒代谢产物。
它们被广泛分布在食品、饲料和环境中，可能对人类和动物健康造成危害。
因此，对黄曲霉毒素的快速、准确检测成为了保障公众健康的关键。
国家标准委员会制定了黄曲霉毒素国标检测方法，以保证各个检验机构的检测质量和结果一致性。
1. 检测样品的制备
样品制备过程是检测过程的关键步骤。
样品必须被精确称量和混合，以确保最终检测结果的准确性和可重复性。
样品预处理的方法通常包括研磨、切碎、混合和抽样等步骤，具体方法取决于样品的特性，如水分含量、粘度和粒度分布等。
2. 样品提取
样品提取过程中，黄曲霉毒素从样品中被提取到适当的溶剂中。
提取的选择取决于样品的特性和黄曲霉毒素的特性。
一些常见的提取方法包括回收萃取、固相萃取和羧甲基纤维素柱萃取等。
3. 分离和净化
为了获得最终准确的结果，必须分离并净化提取的样品。
对于黄曲霉毒素的分离和纯化方法主要有和阳离子交换树脂和固相萃取等方法。
检测黄曲霉毒素的方法主要包括色谱检测法、酶联免疫检测法、毛细管电泳等方法。
其中酶联免疫检测法已成为广泛使用的检测方法之一。
该方法以特异性抗体为基础，利用抗原抗体相互作用，快速、敏感地检测黄曲霉毒素。
总的来说，黄曲霉毒素国标检测方法是一系列高效准确的方法，可以帮助检验机构检测食品或饲料中的黄曲霉毒素，保证公众健康。
黄曲霉毒素实验设计
ELISA试验精密度评价
2.精密度评价的内容：批内、批间、日内、 日间和总不精密度（日内＋日间） 批内：在相同条件下对同一标本在尽可 能短的时间内进行多次重复测定 3.精密度评价实验 对稳定样品（低、中、高三个水平）重 复20次测定A，计算A的均值、s、S2和CV
ELISA试验临界值确定
1.临界值 实验结果处于（阴、阳性）分界点时的 样品中分析物浓度值 1.1当样品中分析物浓度处于临界值时，用 定性试验对样品进行多次重复检测，将产 生50%的阳性结果和50%的阴性结果
ELISA试验精密度评价
1.精密度
在相同条件下，对同一样品多次测量， 每次测量结果之间的接近程度 1.1不能用数字表示 1.2可数字表示的是其反义概念：不精密度 用标准差（s）或变异系数（CV）表示
ELISA试验精密度评价
1.精密度 1.3分析过程重复性的指标 1.4每个标本只做一次检验就发出结果 报告的重要误差（随机误差）来源 1.5临床上希望同一标本的多次检测结 果的精密度好，以减小随机误差
ELISA试验临界值确定
2.确立实验方法的临界值 2.1对已知浓度阳性样品进行系列稀释 2.2对各稀释度样品进行多次重复检测
2.3阴性和阳性结果各占50%的样品中 分析物浓度即为实验方法的临界值
实ห้องสมุดไป่ตู้设计的内容
1.实验原理 2.实验材料：仪器、试剂、耗材、标本等 3.实验方法：文条或表格（详细、具体） 4.实验结果判断 5.实验结果计算及统计学处理 6.室内质量控制 7.注意事项 8.影响因素
酶联免疫法(ELISA)检测饲料中黄曲霉毒素B1
１５ ｍＬ分 液漏 斗 中 ， 入 ２ Ｌ三氯 甲烷 ， 塞 ２ 加 ０ｍ 加
轻摇 ３ｒｉ， 置 分层 。放 出下 层 三氯 甲烷 层 ， ｎ静 ａ 经 盛 有约 ５ ｇ 先用 三氯 甲烷湿 润 的无水 硫酸钠 过 预
滤 器 于 １０ ｍ ０ Ｌ蒸 发 皿 中 。再 加 ５ ｍＬ三 氯 甲烷
恒 温培 养箱 、 量移 液器 、ｕ ： ｅ型 酶标 微 Ｓ ｎｓ Ｒ ｅ
仪（ 天美）涡漩 式振荡 器 。 上海 、
一
１— ８
维普资讯
江西 饲料
２ ｏ 第 ６期 ｏ ６年
于分 液 漏 斗 中 。 复振 摇 提 取 ， 重 三氯 甲烷 层 一 并 滤 于 蒸 发 皿 中 。最 后 用 少 量 三 氯 甲烷 洗 涤 过 滤 器， 洗液 并 于蒸发 皿 中 ，５ ６ ℃水 浴通 风挥 干 。挥 干 冷 却后 ， 准确 加入 １． ｍＬ甲醇 水（： ， ００ １１ 将蒸 发 皿 ） 中的凝 结物 充分 溶解 。
１ 方法原 理
架 。每瓶酶标抗 原 中准确 加入 １ Ｌ酶标抗 原稀 ．ｍ ５ 释液 。 充分溶解 ， 配成 实验用酶标抗 原溶 液 ，— ２８℃ 保存 。浓缩洗涤液用 ３０ｍＬ ０ 蒸馏水配制成洗涤液。
３ 样 品的制 备
３１ 一般 饲料 ．
称 取 ５０ ｇ样 品 于 １０ ． ０ ｍＬ具 塞 三 角 瓶 中 ， 准 确 加 入 ２． ｍ ５ Ｌ甲醇 水（：） 液 ， 荡 １ ｎ ０ １１溶 振 ５ｍｉ，
甲醇 、 蒸馏 水 、 氯 甲烷 、 三 无水 硫 酸钠 、 曲 黄 霉毒 素 Ｂ 测试 盒 。 ｌ
黄曲霉毒素 Ｂ 测试盒的组成 ：包被抗体 的 ｌ
反应 板 、 品稀释 液 、 Ｆ 样 Ａ Ｂ标 准溶液 （ ．，．， ， ， ０１０５ １５
2010版药典黄曲霉毒素检验法
实用标准文案2010版药典黄曲霉毒素检验法（文字版）附录Ⅸ V 黄曲霉毒素测定法本法系用高效液相色谱法(附录ⅥD)侧定药材饮片剂制剂中的黄曲霉毒素(以黄曲霉毒B1、黄曲霉毒索B2、黄曲霉毒素G1和黄曲霉毒素G2总量计），除另有规定外，按下列方法测定。
色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-乙腈-水(10：18：42)为流动相，流速每分钟0.8ml；采用柱后衍生法检测。
衍生溶液为0.05%的碘溶液（取碘0.5g，加人甲醇100ml使溶解，用谁稀释至1000ml制成），衍生化泵流速每挣钟0.3ml 衍生化温度70℃；以荧光检测器检测，激发波长λex=360nm(或365nm），发射波长λem=450nm。
两个相邻色谱峰的分离度应大于1.5。
混合对照品溶液的制备精密量取黄曲霉毒素混和标准品（黄曲霉毒B1、黄曲霉毒索B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2标示浓度分别为1.0ug/ml、0.3ug/ml、1.0ug/ml、0.3ug/ml）0.5ml，置10ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，作为储备液。
精密量取储备液1ml，置25ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，即得。
供试品溶液的制备取供试品粉末约15g（过二号筛），精密称定，加氯化钠3g，置于均质瓶中，精密加入70%甲醇溶液75ml，高速搅拌2分钟（搅拌速度大于11000转/分钟），离心5分钟（离心速度2500转/分钟），精密量取上清液15ml，置50ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜（0.45um）滤过，量取续滤液20.0ml，通过免疫亲和柱（AflaT-est@P），流速每分钟3ml，用水20ml洗脱，洗脱液弃去，使空气进入柱子，将水挤出柱子，再用适量甲醇洗脱，收集洗脱液，置2ml量瓶中，并用甲醇稀释至刻度，摇匀。
即得。
测定法分别精密吸取上述混和对照品溶液5ul、10ul、15ul、20ul、25ul，诸如液相色谱仪，测定峰面积，以峰面积为纵坐标，进样量为横坐标，绘制标准曲线，另精密吸取上述供试品溶液20-25ul，注入液相色谱仪，测定峰面积，从标准曲线上读出供试品中相当于黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒索B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2的量，计算，即得。
糕点-黄曲霉毒素B1 的测定-薄层层析法
准确称取 1～1.2mg 黄曲霉毒素 B1 标准品，先加入 2mL 乙腈溶解，再用苯稀释定容至 100mL， 其浓度约为 10¦Ìg/mL，此标准溶液应通过紫外分光光度法测定其纯度，并以溶剂调整其浓度为 10¦Ìg/mL，避光，置于 4℃冰箱中保存。 3.9 黄曲霉毒素标准使用液，0.04¦Ìg/mL
3
将薄层板边缘附着的吸附剂刮净，在距薄层板下端 3cm 的基线上用微量注射器或血色素吸 管滴加样液。一块板可滴加 4 个点，点距边缘和间距约为 1cm，点直径约为 3mm。在同一板上滴 加点的大小应一致，滴加时可用吹风机用冷风边吹边加。滴加样式如下：
第一点：10μL 黄曲霉毒素 B1 标准使用液(0.04¦Ìg/mL).。 第二点：20μL 样液。 第三点：20μL 样液＋10μL 0.04¦Ìg/mL 黄曲霉毒素 B1 标准使用液。 第四点：20μL 样液＋10μL 0.2¦Ìg/mL 黄曲霉毒素 B1 标准使用液。 6.2.2 展开与观察 在展开槽内加 10mL 无水乙醚，预展 12cm，取出挥干。再于另一展开槽内加 10mL 丙酮－ 三氯甲烷混合液（8＋92），展开 10～12cm，取出。在紫外光下观察结果，方法如下。 由于样液点上加滴黄曲霉毒素 B1 标准使用液，可使黄曲霉毒素 B1 标准点与样液中的黄曲霉 毒素 B1 荧光点重叠。如样液为阴性,薄层板上的第三点中黄曲霉毒素 B1 为 0.0004¦Ìg，可用作检查 在样液内黄曲霉毒素 B1 最低检出量是否正常出现；如为阳性，则起定性作用。薄层板上的第四 点中黄曲霉毒素 B1 为 0.002¦Ìg，主要起定位作用。
饲料中黄曲霉毒素B1的检测
中国果菜质量控制黄曲霉毒素B1（AFB1）是二氢呋喃氧杂萘邻酮衍生物，含有一个双呋喃环和一个氧杂萘邻酮，是已知的化学物质中致癌性最强的一种。
AFB1污染的物质包括食品中的花生、玉米、稻谷、小麦、花生油等农产品及其加工产品；且以南方高温、高湿地区受污染最为严重。
黄曲霉毒素无臭、无味、无色，在饲料中及其稳定，对家禽、家畜的健康威胁极大，作为饲料强制性卫生监控指标，目前有半定量薄层色谱法[1]、免疫亲和柱净化———高效液相色谱法[2]、免疫亲和荧光光度法[3]、酶联免疫吸附法[4]。
高效液相色谱法虽然灵敏度高，但是样品前处理繁琐，操作复杂；薄层色谱法虽然简便，但是灵敏度差，因此研究能够准确、快速检测饲料中AFB1的检测方法是十分必要且具有现实意义的。
1实验部分1.1材料与试剂甲酸，优级纯；乙腈，色谱纯；超纯水；饲料中黄曲霉毒素B1的检测刘超景赞（乐山市食品药品检验检测中心，四川乐山614000）摘要:采用高效液相色谱串联质谱法对饲料中黄曲霉毒素B1进行检测。
建立了以Inertsil ODS-3为液相色谱柱，以0.1%甲酸水、乙腈（0.1%甲酸）为流动相，质谱使用电喷雾离子源，正离子扫描，以313.0/285.0为定量离子对的LC-MS/MS 检测方法。
结果表明：该方法所测得的黄曲霉毒素B1在0~100.0ng/mL 内具有良好线性，检出限为2.8μg/kg ，加标回收率在93.3%~98.3%。
该方法适合饲料中黄曲霉毒素B1的分析检测。
与传统的薄层色谱、高效液相色谱法相比较，该方法具有分析速度快、操作方便、重现性好、灵敏度高等特点。
关键词:饲料；黄曲霉毒素B1；液质联用中图分类号:TS207文献标志码:A文章编号:1008-1038(2015)12-0025-03Detection of AFB1in FeedLIU ChaoJING Zan(Leshan Food and Drug Inspection and Testing Center,LeShan 614000,China)Abstract:We tested aflatoxin B1in feed with LC -MS/MS method.A method was developed with novel HPLC columnInertsil ODS -3,Mobile phase was 0.1%methanoic acid water,0.1%methanoic acid acetonitrile,combined with MS,which used positive ion scanning,and quantification ion pair was 313.0/285.0.A good linear in 0~100.0ng/mL.detection limit was 2.8μg/kg.Adding standard recovery was 93.3%~98.3%.This method has advantages of being fast,easy,reproducible and relatively sensitive compared with TLC and HPLC.Key words:Feed;AFB1;LC-MS/MS收稿日期:2015-06-26作者简介:刘超（1984—），男，助理工程师，研究方向为食品安全25. All Rights Reserved.中国果菜质量控制AFB1标准品（2μg/mL，农业部环境保护科研所）。
(KJ201709)液体乳中黄曲霉毒素M1的快速检测胶体金免疫层析法
附件3液体乳中黄曲霉毒素M1的快速检测胶体金免疫层析法（KJ201709）1范围本方法规定了牛奶、羊奶、牦牛奶等液体乳中黄曲霉毒素M1的胶体金免疫层析快速检测方法。
本方法适用于生鲜乳、巴氏杀菌乳、灭菌乳中黄曲霉毒素M1的快速测定。
2原理本方法采用竞争抑制免疫层析原理。
样品中的黄曲霉毒素M1与胶体金标记的特异性抗体结合，抑制抗体和试纸条或检测卡中检测线（T线）上抗原的结合，从而导致检测线颜色深浅的变化。
通过检测线与控制线（C线）颜色深浅比较，对样品中黄曲霉毒素M1进行定性判定。
3试剂和材料除另有规定外，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的二级水。
3.1试剂甲醇。
3.2参考物质黄曲霉毒素M1参考物质的中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、相对分子质量见表1，纯度≥90%。
表1 黄曲霉毒素M1参考物质中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、相对分子质量注：或等同可溯源物质。
3.3标准溶液的配制3.3.1黄曲霉毒素M1标准储备液（100 μg/mL）：精密称取适量黄曲霉毒素M1标准品（3.2），置于10 mL容量瓶中，用甲醇（3.1）溶解并稀释至刻度，摇匀，制成浓度为100 μg/mL的黄曲霉毒素M1标准储备液；或可直接购买黄曲霉毒素M1标准储备液。
-20℃避光保存备用，有效期3个月。
—1—3.3.2黄曲霉毒素M1标准中间液（100 ng/mL）：精密量取黄曲霉毒素M1标准储备液（100 μg/mL）（3.3.1）0.1 mL，置于100 mL容量瓶中，用甲醇（3.1）稀释至刻度，摇匀，制成浓度为100 ng/mL 的黄曲霉毒素M1标准中间液。
临用新制。
3.4材料黄曲霉毒素M1胶体金免疫层析试剂盒，适用基质为液体乳。
3.4.1金标微孔（含胶体金标记的特异性抗体）。
3.4.2试纸条或检测卡。
4仪器和设备4.1移液器：100 µL、200 µL和500 µL。
高效液相色谱法检测农产品中黄曲霉毒素B1的含量
分析检测高效液相色谱法检测农产品中黄曲霉毒素B1的含量韩 宇（四川省甘孜藏族自治州食品药品检验所，四川康定 626000）摘 要：目的：建立高效液相色谱法联合免疫磁固相萃取法测定农产品食品中黄曲霉毒素B1（Aflatoxin B1，AFB1）含量的分析方法。
方法：采用70%乙腈溶液提取花生、玉米、大豆、小麦、豌豆和绿豆样品中的AFB1，然后利用免疫磁珠净化、萃取和富集提取液中的AFB1，采用高效液相色谱法进行定量分析。
结果：方法的检出限为0.03～0.92 μg·kg-1，回收率为79.52%～97.53%。
利用该方法对市场上购买的20份花生、玉米、大豆、小麦、豌豆、绿豆样品中的AFB1进行检测，除了玉米和绿豆中未检测出AFB1外，其余实验样品中均检测出一定含量的AFB1。
结论：该方法简便、快速、准确，适用于复杂样品中黄曲霉毒素B1的测定。
关键词：高效液相色谱法；免疫磁固相萃取；黄曲霉毒素B1Determination of Aspergillus Flavus B1 in Agricultural Products by High-Performance Liquid ChromatographyHAN Yu(Ganzi Tibetan Autonomous Prefecture Institute for Food and Drug Control, Kangding 626000, China)Abstract: Objective: To establish a method for the determination of Aflatoxin B1 (AFB1) in agricultural products by high performance liquid chromatography combined with immunomagnetic solid phase extraction. Method: AFB1 was extracted from samples of peanuts, corn, soybeans, wheat, peas, and mung beans using a 70% acetonitrile solution, and then AFB1 was purified, extracted and enriched by immunomagnetic beads, and quantitative analysis was performed by HPLC. Result: The limits of detection were 0.03～0.92 μg·kg-1, and the recoveries were 79.52%～97.53%. AFB1 in 20 samples of peanut, corn, soybean, wheat, pea and mung bean purchased from the market was detected by this method. AFB1 content was detected in all the other samples except corn and mung bean. Conclusion: The method is simple, rapid, accurate and suitable for the determination of aflatoxin B1 in complex samples.Keywords: high-performance liquid chromatography; immunomagnetic solid-phase extraction; aspergillus flavus B1黄曲霉毒素是一种由黄曲霉菌产生的有毒代谢产物，在自然界中分布广泛，在粮食和饲料等农产品中广泛存在。
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一、目的
规范实验室检验方法。
二、内容
（一）试验准备
1、标定荧光计。
（1）、将仪器后的电源开关打开。
（2）、按SELECTTEST键，直至显示出AflaTest，按ENTER。
（3）、荧光计显示：START CALBRATION…OPEN THE LID
INSERT RED VIAL
打开仪器盖，将红色的真菌毒素标定管放入。
一定要确认标定管是
否已放到了仪器的底部。
（4）、仪器显示：HIGHCAL 22PPB
如果这个值正好是所选分析方法规定的设定值，请按ENTER键。
否则，从键盘上所规定的设定值，确认准确无误后，按ENTER键。
（5）、仪器显示：READING HIGH CAL…SA VING HIGH INENSTTY
OPEN THE LID
INSERT GREEN VIAL
打开仪器盖取出红色的标定管，插入绿色的真菌毒素标定管。
一定
要确认标定管是否已充分插入仪器的底部。
（6）、仪器显示：LOW CAL 1.0PPB
如果这个值正好是所选分析方法规定的设定值,请按ENTER键.否则,从
键盘上所规定的设定值,确认准确无误后,按ENTER键。
（7）、仪器显示：READING LIW CAL…SA VING HIGH INTENSITJY 接着显示：OPEN THE LID
INSERT GREEN VIAL
打开仪器盖取出绿色的标定管。
（8）、仪器显示：VICAM V1.3 READY
按SELECT TEST键,仪器显示: AFLATEST, 按ENTER键。
（9）、仪器显示：START RUN TEST OPEN THE LID （10）、插入黄色的真菌毒素标定管，其读数应该在分析方法的测定范围内。
（11）、荧光屏计标定工作完毕，可经进行样品分析了。
荧光计每
周需要标定一次。
如果需要重新标定，请按STOP键，再按OPIONS 键，直至仪器显示：CALIBRATE TEST
然后按ENTER键，仪器显示：AFLATEST
如果不是这样，按SELECT TEST键，直至仪器显示：AFLATEST，
按
ENTER键。
然后，按照上面所述操作步骤进行。
如果进行样品分析，按SELECT TEST键，直至仪器显示：AFLATEST键。
2、配制AflaTest显色液（一天配制一次）。
3、配制甲醇/水（60：40体积比）溶液（每周配制一次，或根据需要
配制）。
4、试剂空白试验（1ml甲醇+1ml显色液置于测试管中），荧光计读数
应为0。
5、纯水空白试验（2ml纯水置于测试管中），荧光计读数应为0。
（二）样品提取
1、称取25克磨细的样品，5克氯化钠，置于搅拌杯中。
2、加入125ml甲醇/水（60：40）溶液。
3、盖上搅拌杯的盖子，高速成搅拌1分钟。
4、取下盖子，将提取物到入折叠滤纸上，滤液收集于干净的容器中。
（三）提取物的稀释
1、移取20ml上步的滤液，置于干净的容器中。
、
2、用20ml纯水将滤液稀释，混匀。
3、将上步稀释液通过玻璃纤维滤纸过滤，滤液收集于玻璃注射器筒中，量取10ml。
（四）分离柱色谱操作
1、将上步10 ml滤液（10ml=1.0g的样品）,以1-2滴/秒的流速全部通过AflaTest-P亲和柱,直到空气进入到亲和柱中。
2、将10 ml纯水以2滴/秒的流速通过亲和柱中。
3、将7.2步再重新操作一次, 直到空气进入到亲和柱中。
4、用1ml色谱级甲醇以1-2滴/秒的流速淋洗亲和柱，将所有样品淋洗液收ml玻璃试管中。
5、将1ml AflaTest显色液加到测试管的淋洗液中，混匀后，将测试管置于已标定好了的荧光计中。
60秒后，读数。
（五）、如果要结束试验，按STOP键。