I667-01黄曲霉毒素测定法一部检验标准操作规程
黄曲霉毒素国标检测方法
黄曲霉毒素国标检测方法
黄曲霉毒素（AF）是一种由黄曲霉属真菌产生的有毒代谢产物。
它们被广泛分布在食品、饲料和环境中，可能对人类和动物健康造成危害。
因此，对黄曲霉毒素的快速、准确检测成为了保障公众健康的关键。
国家标准委员会制定了黄曲霉毒素国标检测方法，以保证各个检验机构的检测质量和结果一致性。
1. 检测样品的制备
样品制备过程是检测过程的关键步骤。
样品必须被精确称量和混合，以确保最终检测结果的准确性和可重复性。
样品预处理的方法通常包括研磨、切碎、混合和抽样等步骤，具体方法取决于样品的特性，如水分含量、粘度和粒度分布等。
2. 样品提取
样品提取过程中，黄曲霉毒素从样品中被提取到适当的溶剂中。
提取的选择取决于样品的特性和黄曲霉毒素的特性。
一些常见的提取方法包括回收萃取、固相萃取和羧甲基纤维素柱萃取等。
3. 分离和净化
为了获得最终准确的结果，必须分离并净化提取的样品。
对于黄曲霉毒素的分离和纯化方法主要有和阳离子交换树脂和固相萃取等方法。
检测黄曲霉毒素的方法主要包括色谱检测法、酶联免疫检测法、毛细管电泳等方法。
其中酶联免疫检测法已成为广泛使用的检测方法之一。
该方法以特异性抗体为基础，利用抗原抗体相互作用，快速、敏感地检测黄曲霉毒素。
总的来说，黄曲霉毒素国标检测方法是一系列高效准确的方法，可以帮助检验机构检测食品或饲料中的黄曲霉毒素，保证公众健康。
黄曲霉毒素测定法操作规程
分发部门：质量部、中心化验室生效日期：年月日黄曲霉毒素测定法操作规程1目的通过制定黄曲霉毒素测定法操作规程，以确保检验的准确性。
2适用范围适用于中心化验室所有的高效液相色谱法-柱后衍生法对药品的黄曲霉毒素测定。
3职责必须由经过相应知识培训的QC人员方可进行黄曲霉毒素测定法的操作。
4文件内容4.1简述黄曲霉毒素可以由曲霉菌黄曲霉、寄生曲霉、集封曲霉4种真菌产生，是一组化学结构类似的二呋喃香豆素的衍生化合物。
中药在贮藏、制备、运输过程中如保存不当有受潮霉变而污染黄曲霉毒素的可能。
黄曲霉毒素是目前世界上已知的毒性最强电话化合物之一，其致癌性肯定。
对中药中黄曲霉毒素残留量进行严格控制对保证用药安全具有重要意义。
本法的基本原理为样品经有机溶剂提取、免疫亲和柱净化后，利用高效液相色谱分离，柱后衍生-荧光检测器检测进行分析测定。
用于测定药材、饮片及制剂中的黄曲霉毒素（以黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2总量计）。
4.2仪器及用具4.2.1 高速匀浆器4.2.2 高效液相色谱仪，配荧光检测器（具360nm激发波长和大于420nm发射波长）4.2.3 柱后衍生系统（碘衍生系统或光化学衍生系统）4.2.4 离心机4.2.5 超纯水处理系统4.2.6 超声波提取器4.2.7 固相萃取装置4.2.8 离心管，具塞锥形瓶，刻度浓缩瓶，移液管，容量瓶等。
4.3试药与试液4.3.1 甲醇、乙腈均为色谱纯。
4.3.2 水为超纯水4.3.3 黄曲霉毒素混合对照品（黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2，标示浓度分别为1.0µg/ml、0.3µg/ml、1.0µg/ml、0.3µg/ml）4.3.4 0.05%的碘溶液：取碘0.5g，加入甲醇100ml使溶解用水稀释至1000ml即得。
4.4色谱条件及系统适用性试验4.4.1 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-乙腈-水（40:18:42）为流动相；柱温：40℃；采用柱后衍生法检测（分为碘衍生法和光化学衍生法）；以荧光检测器检测，激发波长λem=360nm(或365nm)，发射波长λex=450nm。
黄曲霉毒素的检查方法
几种黄曲霉素检测方法的特点
免疫亲和层析净化高效液相色谱法
• 试样经过甲醇一水提取，提取液经过滤、稀释后，滤液经过含有 黄曲霉毒素特异抗体的免疫亲和层析净化，此抗体对黄曲霉毒素B1， B2,G1，G2具有专一性，黄曲霉毒素交联在层析介质中的抗体上。用水 或吐温-20/PBS将免疫亲和柱上杂质除去，以甲醇通过免疫亲和层析 柱洗脱，洗脱液通过带荧光检测器的高效液相色谱仪柱后碘溶液衍生 测定黄曲霉毒素的含量。
由于生物传感器具有选择性高，响应快操作简单携 带方便和适合于现场检测等优点，因此各国科研工作者正 积极探索研制新型生物传感器用于检测黄曲霉素。
研
• 试样经过甲醇一水提取，提取液经过滤、稀释后，滤 液经过含有黄曲霉毒素特异抗体的免疫亲和层析净化，此 抗联体在对层黄析曲介霉质毒中素的B抗1，体B上2,G。1，用G2水具将有免专疫一亲性和，柱黄上曲杂霉质毒除素去交 .以甲醇通过免疫亲和层析柱洗脱，加入溴溶液衍生，以 提高测定灵敏度。洗脱液通过荧光光度计测定黄曲霉毒素 (B1+B2+G1+G2)总量。
，经柱层析（它利用吸附剂对不同物质吸附能力的差异，用溶剂将 混合物的组分逐一洗脱分离的一种分离方法）净化后，再在薄板 上展开后分离，利用黄曲霉素的荧光特性,根据荧光斑点 的强弱与标准比较确定其含量，对于一些组分很复杂的试 样要双向展开，才能获得较高的灵敏度
• TLC法设备简单，检测费用低，但操作繁琐费时，萃取和 净化效果不理想，灵敏度差，对操作人员的身体健康存在 较大程度的危害
质，使其被检测到。例如将发色基团或荧光基团键合到样品中去，多极放大检测灵 敏度 柱后衍生系统：有碘衍生化法、溴衍生化法及较为先进的电化学衍生化法和光化学 衍生化法 免疫亲和柱：基于抗原抗体反应，特异性抗体连接在柱体内，选择性吸附样品中的 待检物，杂质不被吸附，流出柱外，柱上结合的目标物再被特定的洗脱液洗下来， 可以用于液相色谱(HPLC)分析或者ELISA含量测定，是一种高效的前处理柱。
黄曲霉素检测法
食品中黄曲霉毒素的测定—免疫亲和层析净化高效液相色谱法和荧光光度法1 范围本标准规定了免疫亲和层析净化—高效液相色谱法和免疫亲和层析净化—荧光光度法测定食品中黄曲霉毒素的条件和详细分析步骤。
本标准适用于玉米、花生及其制品（花生酱、花生仁、花生米）、大米、小麦、植物油脂、酱油、食醋等食品中黄曲霉毒素的测定。
样品中黄曲霉毒素的检出限：免疫亲和层析净化—高效液相色谱法和免疫亲和层析净化—荧光光度法为1mg/kg；免疫亲和层析净化—荧光光度法测定酱油样品中黄曲霉毒素检出限为2.5mg/kg。
2 免疫亲和层析净化高效液相色谱法2.1 方法提要试样经过甲醇-水提取，提取液经过滤、稀释后，滤液经过含有黄曲霉毒素特异抗体的免疫亲和层析净化，此抗体对黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2具有专一性，黄曲霉毒素交联在层析介质中的抗体上。
用水或吐温/PBS将免疫亲和柱上杂质除去，以甲醇通过免疫亲和层析柱洗脱，洗脱液通过带荧光检测器的高效液相色谱仪柱后碘溶液衍生测定黄曲霉毒素的含量。
2.2 试剂和溶液除非另有规定，仅使用分析纯试剂、重蒸馏水。
2.2.1甲醇（CH3OH）：色谱纯2.2.2甲醇-水（7+3）：取70mL甲醇加30mL水2.2.3 甲醇-水（8+2）：取80mL甲醇加20mL水2.2.4甲醇-水（45+55）：取45mL甲醇加55mL水2.2.5 苯：色谱纯2.2.6乙腈：色谱纯2.2.7苯-乙腈（98+2）：取2mL乙腈加98mL苯2.2.8氯化钠（NaCl）2.2.9磷酸氢二钠（Na2HPO4）2.2.10磷酸二氢钾（KH2PO4）GB/T 18979-20032.2.11氯化钾（KCl）2.2.12 PBS缓冲溶液：称取8.0g氯化钠，1.2g磷酸氢二钠，0.2g磷酸二氢钾，0.2g氯化钾，用990mL纯水溶解，然后用浓盐酸调节pH值至7.0，最后用纯水稀释至1000mL。
2.2.13 吐温-20/PBS溶液（0.1%）：取1mL吐温-20，加入PBS缓冲溶液并定容至1000mL。
黄曲霉毒素的测定(精)
取20.00mL甲醇水溶液臵于另一125mL分液漏斗 中，加20mL三氯甲烷，振摇2min、静臵分层， 如出现乳化现象，可滴加甲醇促使分层。放出 三氯甲烷层，经盛有约10g预先用三氯甲烷湿 润的无水硫酸钠的定量慢速滤纸，过滤于 50mL蒸发皿中，再加5mL三氯甲烷于分液漏斗 中，重复振摇提取，三氯甲烷层一并滤于蒸发 皿中，最后用少量三氯甲烷洗过滤器，洗液并 于蒸发皿中。
再用双向展开法展开后，观察样液是否产生与AFTB1标准点重叠
的衍生物。观察时，可将第一板作为样液的衍生物空白板。若样 液AFTB1含量较高时，则将样液稀释后，按单向展开法中(4)做确 认试验 .
(5)稀释定量：
若样液中AFTBl含量较高，可按单向展开法中(5)稀释定量操作。 若AFTB1含量较低，稀释倍数小，在定量的纵向展开板上仍有杂质 干扰，影响结果判断，可将样液再做双向展开法测定，以确定含量。 3.2.3 结果计算
(2)展开：
a．横向展开：在展开槽内的长边臵一玻璃支架，加10mL无水 乙醇，将上述点好的薄层板靠标准点的长边，臵于展开槽内展开， 展至板端后，取出挥干。根据情况，需要时，可再重复l～2次。 b．纵向展开：挥干的薄层板以丙酮一三氯甲烷(8：92)展开至 10～12cm为止。丙酮与氯甲烷的比例，根据不同条件自行调节。
黄曲霉毒素属剧毒物质，其毒性比氰化 钾还高，也是目前最强的化学致癌物质。 其中AFT B1的毒性和致癌性最强，帮其 在食品中允许量各国都有严格规定。 AFT主要污染粮油及其制品，如花生、 花生油、玉米、大米、棉籽等被污染严 重。Biblioteka 曲霉毒素允许量标准
食品品种 允许量标准（ppb或10-6） 玉米、花生、花生油 ≤20 玉米及花生制品 ≤20 大米、其他食用油 ≤10 裱花蛋糕、饼干、面包≤5 婴儿代乳食品 不得检出
黄曲霉毒素检验方法
一、目的规范实验室检验方法。
二、内容（一）试验准备1、标定荧光计。
（1）、将仪器后的电源开关打开。
（2）、按SELECTTEST键，直至显示出AflaTest，按ENTER。
（3）、荧光计显示：START CALBRATION…OPEN THE LIDINSERT RED VIAL打开仪器盖，将红色的真菌毒素标定管放入。
一定要确认标定管是否已放到了仪器的底部。
（4）、仪器显示：HIGHCAL 22PPB如果这个值正好是所选分析方法规定的设定值，请按ENTER键。
否则，从键盘上所规定的设定值，确认准确无误后，按ENTER键。
（5）、仪器显示：READING HIGH CAL…SA VING HIGH INENSTTYOPEN THE LIDINSERT GREEN VIAL打开仪器盖取出红色的标定管，插入绿色的真菌毒素标定管。
一定要确认标定管是否已充分插入仪器的底部。
（6）、仪器显示：LOW CAL 1.0PPB如果这个值正好是所选分析方法规定的设定值,请按ENTER键.否则,从键盘上所规定的设定值,确认准确无误后,按ENTER键。
（7）、仪器显示：READING LIW CAL…SA VING HIGH INTENSITJY 接着显示：OPEN THE LIDINSERT GREEN VIAL打开仪器盖取出绿色的标定管。
（8）、仪器显示：VICAM V1.3 READY按SELECT TEST键,仪器显示: AFLATEST, 按ENTER键。
（9）、仪器显示：START RUN TEST OPEN THE LID （10）、插入黄色的真菌毒素标定管，其读数应该在分析方法的测定范围内。
（11）、荧光屏计标定工作完毕，可经进行样品分析了。
荧光计每周需要标定一次。
如果需要重新标定，请按STOP键，再按OPIONS 键，直至仪器显示：CALIBRATE TEST然后按ENTER键，仪器显示：AFLATEST如果不是这样，按SELECT TEST键，直至仪器显示：AFLATEST，按ENTER键。
黄曲霉素检测法
食品中黄曲霉毒素的测定—免疫亲和层析净化高效液相色谱法和荧光光度法1 范围本标准规定了免疫亲和层析净化—高效液相色谱法和免疫亲和层析净化—荧光光度法测定食品中黄曲霉毒素的条件和详细分析步骤。
本标准适用于玉米、花生及其制品（花生酱、花生仁、花生米）、大米、小麦、植物油脂、酱油、食醋等食品中黄曲霉毒素的测定。
样品中黄曲霉毒素的检出限：免疫亲和层析净化—高效液相色谱法和免疫亲和层析净化—荧光光度法为1mg/kg；免疫亲和层析净化—荧光光度法测定酱油样品中黄曲霉毒素检出限为2.5mg/kg。
2 免疫亲和层析净化高效液相色谱法2.1 方法提要试样经过甲醇-水提取，提取液经过滤、稀释后，滤液经过含有黄曲霉毒素特异抗体的免疫亲和层析净化，此抗体对黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2具有专一性，黄曲霉毒素交联在层析介质中的抗体上。
用水或吐温/PBS将免疫亲和柱上杂质除去，以甲醇通过免疫亲和层析柱洗脱，洗脱液通过带荧光检测器的高效液相色谱仪柱后碘溶液衍生测定黄曲霉毒素的含量。
2.2 试剂和溶液除非另有规定，仅使用分析纯试剂、重蒸馏水。
2.2.1甲醇（CH3OH）：色谱纯2.2.2甲醇-水（7+3）：取70mL甲醇加30mL水2.2.3 甲醇-水（8+2）：取80mL甲醇加20mL水2.2.4甲醇-水（45+55）：取45mL甲醇加55mL水2.2.5 苯：色谱纯2.2.6乙腈：色谱纯2.2.7苯-乙腈（98+2）：取2mL乙腈加98mL苯2.2.8氯化钠（NaCl）2.2.9磷酸氢二钠（Na2HPO4）2.2.10磷酸二氢钾（KH2PO4）GB/T 18979-20032.2.11氯化钾（KCl）2.2.12 PBS缓冲溶液：称取8.0g氯化钠，1.2g磷酸氢二钠，0.2g磷酸二氢钾，0.2g氯化钾，用990mL纯水溶解，然后用浓盐酸调节pH值至7.0，最后用纯水稀释至1000mL。
2.2.13 吐温-20/PBS溶液（0.1%）：取1mL吐温-20，加入PBS缓冲溶液并定容至1000mL。
黄曲霉毒素的测定(精)
(2)展开：
a．横向展开：在展开槽内的长边置一玻璃支架，加10mL无水 乙醇，将上述点好的薄层板靠标准点的长边，置于展开槽内展开， 展至板端后，取出挥干。根据情况，需要时，可再重复l～2次。 b．纵向展开：挥干的薄层板以丙酮一三氯甲烷(8：92)展开至 10～12cm为止。丙酮与氯甲烷的比例，根据不同条件自行调节。
仪器
小型粉碎机 样筛
电动振荡器
玻璃浓缩器 玻璃板5cm×20cm、薄层板涂布器 展开槽(25cm×6cm×4cm) 紫外光灯100一125w、波长365nm滤光片、微量注射器(2)
试剂
三氯甲烷、正己烷(沸程30～60℃)或石油 醚(沸程60～90℃)、甲醇、苯、乙腈、无 水乙醚或乙醚经无水硫酸钠脱水、丙酮。 以上试剂在试验前需先进行空白试验， 如不干扰测定即可使用，否则需逐一进 行重蒸。
取20.00mL甲醇水溶液置于另一125mL分液漏斗 中，加20mL三氯甲烷，振摇2min、静置分层， 如出现乳化现象，可滴加甲醇促使分层。放出 三氯甲烷层，经盛有约10g预先用三氯甲烷湿 润的无水硫酸钠的定量慢速滤纸，过滤于 50mL蒸发皿中，再加5mL三氯甲烷于分液漏斗 中，重复振摇提取，三氯甲烷层一并滤于蒸发 皿中，最后用少量三氯甲烷洗过滤器，洗液并 于蒸发皿中。
2、黄曲霉毒素B标准使用液：
I液(1.0ug／mL)：取1mL AFTB标准液(10.0ug／mL)于10mL容 量瓶中，用苯一乙腈混合液稀释、定容。
Ⅱ液(0.2ug／mL)：取I液1mL，按上法定容5mL。
Ⅲ液(0.04ug／mL)：取液Ⅱ1mI。，按上法定容5mI。。
思考：在配制黄曲霉毒素B标准使用液时，为什么需要用贮备 液来稀释而不是直接配制？
本章重点
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1.目的：建立黄曲霉毒素测定法(一部)检验标准操作规程，并按规程进行检验，保证检验操作规范化。
2.依据：
2.1. 《中华人民共和国药典》2010年版一部。
3.范围：适用于所有用黄曲霉毒素测定法(一部)测定的供试品。
4.责任：检验员、质量控制科主任、质量管理部经理对本规程负责。
5.正文：
5.1. 本法系用高效液相色谱法（附录Ⅵ D）测定药材、饮片及制剂中的黄曲霉
毒素（以黄曲霉毒素B
1、黄曲霉毒素B
2
、黄曲霉毒素G
1
和黄曲霉毒素G
2
总量计），
除另有规定外，按下列方法测定。
5.1.1. 色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-乙腈-水（40：18：42）为流动相，流速每分钟0.8ml；采用柱后衍生法检测，衍生溶液为0.05%的碘溶液（取碘0.5g，加入甲醇100ml使溶解，用水稀释至1000ml制成），衍生化泵流速每分钟0.3ml，衍生化温度70℃；以荧光检测器检
测，激发波长γ
ex =360nm（或365nm），发射波长γ
em
=450nm。
两个相邻色谱峰的
分离度应大于1.5。
5.1.2. 混合对照品溶液的制备：精密量取黄曲霉毒素混合标准品（黄曲霉毒素
B 1、黄曲霉毒素B
2
、黄曲霉毒素G
1、
黄曲霉毒素G
2
标示浓度分别为1.0μg/ml、
0.3μg/ml、1.0μg/ml、0.3μg/ml）0.5ml，置10ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，作为储备液。
精密量取储备液1ml，置25ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，即得。
5.1.3. 供试品溶液的制备：取供试品粉末约15g（过二号筛），精密称定，加入氯化钠3g，置于均质瓶中，精密加入70%甲醇溶液75ml，高速搅拌2分钟（搅拌速度大于11000转/分钟），离心5分钟（离心速度2500转/分钟），精密量取上清液15ml，置50ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜（0.45μm）滤过，量取续滤液20.0ml，通过免疫亲和柱（AflaT-est@P），流速每分钟3ml，用水20ml洗脱，洗脱液弃去，使空气进入柱子，将水挤出柱子，再用适量甲醇洗脱，收集洗脱液，置2ml量瓶中，并用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。
5.1.4. 测定法：分别精密量取上述混合对照品溶液5μl、10μl、15μl、20μl、25μl，注入液相色谱仪，测定峰面积，以峰面积为纵坐标，进样量为横坐标，绘制标准曲线。
另精密量取上述供试品溶液20～25μl，注入液相色谱仪，测定
峰面积，从标准曲线上读出供试品中相当于黄曲霉毒素B
1、黄曲霉毒素B
2
、黄曲
霉毒素G
1、黄曲霉毒素G
2
的量，计算，即得。
5.2. 【附注】。
5.2.1. 本实验应有相应的安全、防护措施，并不得污染环境。
5.2.2. 残留有黄曲霉毒素的废液或废渣的玻璃器皿，应置于专用贮存容器（装有10%次氯酸钠溶液）内，浸泡24小时以上，再用清水将玻璃器皿冲洗干净。
（注：本资料素材和资料部分来自网络，仅供参考。
请预览后才下载，期待你的好评与关注！）。