分子筛层析
d分子筛层析系统清洁方法验证方案
山东金泰生物工程有限公司验证管理文件编号：V00P005题目：分子筛层析系统清洁方法验证方案版本号：01 版共3 页，第1 页生效日期：年月日起草：日期：一审：日期：二审：日期：批准：日期：1验证范围分子筛S-200 层析柱、泵管、检测器管路及吸收池所组成的系统的清洁2验证目的确保分子筛层析系统的清洁方法有效可行，确保纯化过程中不受外来污染。
3验证合格标准3.1在0.02AUFS、280nm 时，基线平稳没有大的波动3.2pH 应与S-200 洗脱缓冲液的pH 相同，即为pH=6.8±0.13.3内毒素的含量w 2 EU/mL4验证步骤4.1分子筛层析系统清洁方法流程配制O.IMNaOH无热原缓冲液T通过泵冲洗柱子1-2个柱体积宀配制pH6.8 S-200缓冲液宀平衡柱子1-2 个柱体积4.2验证所用相关文件序号题目编号1细菌内毒素检查法Q00E0082pH 计操作规程P00D0063分子筛层析缓冲液配制操作规程P01R0124分子筛层析系统操作规程P00D0165重组人白介素-2 分子筛层析岗位操作法P01M0064.3程序4.3.1S-200 纯化后，用0.1MNaOH 溶液冲柱子1-2个体积。
4.3.2灵敏度为0.02AUFS 时，半小时基线平稳无大的波动。
4.3.3根据pH 测定法，检测器端测得洗脱液出液的pH=6.8± 0.1.4.3.4根据内毒素测定法，内毒素含量w 2EU/mL.5再验证连续三次按上述验证步骤检验清洁方法，做好记录，在以后生产过程中每年验证一次。
清洁方法验证记录验证部门：项目时间基线pH内毒素验证人复核人分子筛层析系统清洁方法验证报告验证部门：验证日期：报告填写人：报告日期：1 经检查并确认在0.02AUFS 灵敏度下，基线验证人：2 经检查并确认所测pH 验证人：3 经验证内毒素含量验证人：4 验证结果分析及验证总结论核对人：（符合或不符合）清核对人：符合或不符合）验证要求核对人：（平稳或不平稳）。
凝胶层析法分离纯化蛋白质
汇报日期
汇报人姓名
单/击/此/处/添/加/副/标/题/内/容
【目的】
掌握凝胶层析的基本原理 学习利用凝胶层析法分离纯化蛋白质的实验技能
【原理】
凝胶层析也称分子筛层析、排阻层析。是利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被分离物质的分子大小不同来进行分离的技术。
凝胶层析是按照蛋白质分子量大小进行分离的技术，又称之凝胶过滤、分子筛层析或排阻层析。 单个凝胶珠本身象“筛子”。不同类型凝胶的筛孔的大小不同。
04
相对分子质量较小的物质由于直径小于凝胶网孔，可完全渗透进入凝胶颗粒的网孔，在向下移动过程中，因此流程较长，移动速率慢；所以最后流出。
03
总结：
01
相对分子质量较大的物质由于直径大于凝胶网孔被完全排阻在孔外，只能在凝胶颗粒外的空间向下流动，因此流程较短，移动速度快；所以首先流出。
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层析柱
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恒流泵
凝胶柱的处理 凝胶用过后，反复用蒸馏水通过柱（2~3倍床体积）即可。
注意事项
始终保持柱内液面高于凝胶表面，否则水分挥发，凝胶变干。也要防止液体流干，使凝胶混入大量气泡，影响液体在柱内的流动，导致分离效果变坏，不得不重新装柱。
Байду номын сангаас
各接头不能漏气，连续用的小乳胶管不要有破损，否则造成漏气、漏液。注意恒压瓶内的排气管应无液体，并随着柱下口溶液的流出不断有气泡产生，则表示恒压瓶不漏气。操作过程中，层析柱内液面不断下降，则表示整个系统有漏气之处，应仔细检查并加以纠正。
01
02
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加样与洗脱 将柱中多余的液体放掉出，使液面刚好盖过凝胶，关闭出口，将1ml样品沿层析柱管壁小心加入，加完后打开底端出口，使液面降至与凝胶面相平时关闭出口，加洗脱液至液层4cm左右，接上恒流泵，开始洗脱（ 0.5ml/min）。
生物制药：凝胶层析法
像Sephadex一样，商品聚丙烯酰胺为颗粒状的干 粉，它有十分明显形成块状并粘附在一起的倾向，在 溶剂中能自动溶胀成胶。
根据聚丙烯酰胺凝胶的溶胀性质和分离范围的不 同，可分成10种类型。各种类型均以英文字母P和阿 拉伯数字表示，从Bio-Gel P-2至Bio-Ge1 P-300。P 后面的阿拉伯数字乘以1000即相当于排阻限度（按球 蛋白或肽计算）。目前，美国Bio-Rad Laboratories 生产并出售多种规格的Bio-Gel P。
葡聚糖凝胶（G类）的规格
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葡聚糖凝胶（G类）特点
1、孔径。 2、稳定性。 3、吸附作用。 4、芳香族化合物和杂环化合物。
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性质与特点
1、Sephadex在水、盐、碱、弱酸以及有机溶 液中都比较稳定，可以多次重复使用。
2、稳定工作pH为2－10，强酸溶液和氧化剂 会使交联的糖苷键水解断裂。
3、在高温下稳定，可煮沸消毒，在100 °C下 40 min对凝胶的结构和性能都没有明显的影响。
如引入磺乙基（SE-Sephadex）、羧甲基（CM-Sephadex） 及二乙胺基乙基（DEAE-Sephadex A）等。葡聚糖凝胶离子交 换剂具有离子交换和分子筛双重作用。其结构多孔、疏松、非 特异性吸附很少，层析时流速易控制，特别适用于蛋白质、酶、 激素、多核苷酸等的分离纯化，以及生化制剂的除热原。
最后流出物质C，它分子量最小，其分子可 以自由进出凝胶颗粒， “全渗入”。流经 体积是外水体积与内水体积之和V0+Vi。
物质B分子量介于渗入限与排阻限之间，其
分子能够部分地进入凝胶颗粒中。 “部分
排阻”或“部分渗入”。流径体积Ve是全部 外水体积加上内水体积的一部分，即
Ve=V0+KdVi
四种蛋白纯化方式的原理及优缺点的简述
一.分子筛（凝胶层析）原理：用一般的柱层析方法使相对分子质量不同的溶质通过具有分子筛性质的固定相（凝胶），从而使蛋白质分离。
优点：1.洗脱条件简单，往往只需要一种缓冲溶液，可以使用任何缓冲液。
2.实验操作相对简单3.条件温和，对蛋白活性保持率高4.既可以对标签蛋白纯化也可以对非标签蛋白纯化。
缺点：1. 工艺放大困难：分子筛层析无法遵循线性放大原则，即使遵循柱床高度不变的原则，工艺流速如何进行调整，也是需要面临的问题。
2. 层析柱装填困难3.对上样量有要求4.测定柱效困难5.反复使用层析柱困难二.亲和层析原理：亲和层析是一种吸附层析，亲和层析利用固相介质中的配基与混合生物分子之间亲和能力不同而进行分离，当蛋白混合液通过层析柱时，与配基能够特异性结合的蛋白质就会被吸附固定在层析柱中，其他的蛋白质对配体不具有特异性的结合能力，将通过柱子洗脱下来，这种结合在一定条件下是可逆的，选用适当的洗脱液，改变缓冲液的离子强度和pH 值或者选择更强的配体结合溶液将结合的蛋白质洗脱下来，而无亲和力的蛋白质最先流出层析柱。
优点:1. 亲和层析法是分离蛋白质的一种极为有效的方法，它经常只需经过一步处理即可使某种待提纯的蛋白质从很复杂的蛋白质混合物中分离出来，而且纯度很高。
2. 是最有效的生物活性物质纯化方法，它对生物分子选择性的吸附和分离，可以取得很高的纯化倍数。
此外蛋白在纯化过程中得到浓缩，结合到亲和配基后，性质更加稳定，其结果提高了活性回收率。
此外它可以减少纯化步骤，缩短纯化时间，对不稳定蛋白的纯化十分有利。
缺点：1.除特异性的吸附外，仍然会因分子的错误认别和分子间非选择性的作用力而吸附一些杂蛋白质，另洗脱过程中的配体不可避免的脱落进入分离体系。
2. 载体较昂贵，机械强度低，配基制备困难，有的配基本身要经过分离纯化，配基与载体耦联条件激烈等。
三.离子交换层析原理：离子交换层析根据样品表面电荷不同进行分离纯化的技术，根据不同蛋白样品在同一Ph条件下所带电荷正负以及带电荷量不同而将不同蛋白样品分离。
生物化学大实验
生物化学大实验一、装柱及标准样品的分子筛层析：把柱子固定在夹子上，打开下面的盖，用取液器匀速加入介质。
保证介质均匀沉淀，且要缓慢加入，防止产生气泡。
待介质完全沉降打开柱的上盖，剪一与柱内径大小一致的圆形滤纸片放入柱中，沉淀于介质表面。
液体接近界面时加入3ml超纯水，同时在层析杯中加入100ml超纯水，连接泵洗柱15min，同时配制平衡液200mL（20mmol Tris-HCl,pH 8.0; 20mmol NaCl）。
待液体接近界面时，在柱中加入3ml平衡液（其余平衡液加到层析杯中），调节流速，控制滴速为3ml/10min（一分钟约6-7滴）。
平衡柱过中午。
实验材料：牛血清蛋白、糜蛋白酶二者比例为2:1 溶于20mmol Tris-HCl，pH 8.0; 20mmol NaCl（教师统一配制）。
缓慢向柱中加入样品（4ml）打开层析柱上下端，使样品靠重力流出。
当样品接近界面时在柱中加入3ml 上样缓冲液（即平衡液），连接泵，调T=100 A(0.5A)=0 ，开启记录仪，同时配制100ml 0.1M Nacl。
待两个峰都出来后，把层析杯中的液体换为0.1M Nacl洗柱20min，再用超纯水洗柱30min，封柱，关机。
实验二BAP的诱导表达1.在5ml培养基中加入Amp2.5μl（母液为100mg/ml）和10μl菌液。
在摇床上37℃ 130转过夜预培养。
2.取2.5ml菌液加入50ml含有Amp (25μl)的LB培养基中（1:20扩培）。
37℃恒温摇床，180-200rpm培养40-60min左右。
测OD600,使其值达到0.5-0.7。
3.加入终浓度为1mM的IPTG(500μl)进行外源基因的诱导表达。
于室温诱导4-5小时。
4.取出后进行细胞超声破碎，留1ml破碎前菌液处理后进行western及PAGE，其余放入冰箱于4度保存。
实验三BAP的亲和层析纯化一、破碎细菌A.盐酸胍破碎1.100ml诱导后的菌液分别放于大离心管中，配平，5000rpm离心15min。
根据分子大小分离蛋白质的方法
根据分子大小分离蛋白质的方法蛋白质分子的大小是其在溶液中运动速度的一个重要参数，根据分子大小分离蛋白质的方法有许多。
下面我们将介绍几种常见的方法。
1.差速离心：差速离心是一种简单常用的蛋白质分离方法，通过调整离心速度，能够分离出不同大小的蛋白质颗粒。
这种方法适用于分离大分子量的蛋白质，如多聚体或细胞器结构。
2.凝胶过滤：凝胶过滤是一种基于分子大小的分离方法。
通常使用交联凝胶作为固相介质，通过不同大小的孔隙来限制蛋白质的通过。
较小的蛋白质分子能够穿过凝胶孔隙，而较大的蛋白质分子则被凝胶阻隔。
这种方法可以用于分离蛋白质的不同形态，如单聚体和多聚体。
3.聚丙烯酰胺凝胶电泳：聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种常用的分离和分析蛋白质的方法。
通过在电场作用下，将蛋白质按照其分子大小进行分离。
较小的蛋白质能够快速迁移，而较大的蛋白质迁移速度较慢。
这种方法适用于分离不同大小范围的蛋白质。
4.超速离心：超速离心是一种高效的分离蛋白质的方法，通过调整离心机参数，可以分离出不同大小的蛋白质颗粒。
较大的蛋白质分子能够沉降至离心管底部，而较小的蛋白质分子则停留在离心液上层。
这种方法适用于分离中等到大分子量的蛋白质。
5.过滤法：过滤法是一种利用不同孔径的滤膜或滤床来分离蛋白质的方法。
较小的蛋白质能够很容易穿过滤膜孔隙，而较大的蛋白质则被滤膜阻隔。
这种方法适用于分离较小的蛋白质。
6.分子筛层析：分子筛层析是一种利用分子筛颗粒对蛋白质进行分离的方法。
由于分子筛颗粒具有较小的孔隙，只有小于孔隙大小的蛋白质能够进入颗粒内部，而大于孔隙大小的蛋白质则被筛除。
这种方法适用于分离较小的蛋白质。
总而言之，根据分子大小分离蛋白质的方法有许多种。
选择合适的方法要考虑蛋白质的特性和需要分离的蛋白质大小范围。
不同的方法具有不同的分离效率和分离适用范围，科研人员可以根据具体情况选择适合的方法进行蛋白质分离和纯化。
凝胶过滤
当暴露于强酸或氧化剂溶液时，易使糖苷 键水解断裂。 葡聚糖凝胶欲在室温下长期保存时，应加 入适量的防腐剂如氯仿、叠氮化钠等。否 则，微生物将生长。
3．吸附性
葡聚糖凝胶系弱酸性物质，因为含羧基基团。
该基团能与分离物中电荷基团（碱性蛋白质） 发生吸附作用，可提高洗脱液的离子强度。但 当离子强度大于0.05时，对弱碱性蛋白质就无 吸附力了。 葡聚糖凝胶层析时，用含有 NaCl 的缓冲液作 洗脱液。
一般聚丙烯酰胺凝胶均制成珠状颗粒，以干凝胶形 式出售，使用前必须溶胀。 特点： 不溶于水和普通有机溶剂； 能在浓盐、尿素和胍盐等溶液中浸泡； 在pH l-10或短时间超过此pH值的溶液中较稳定； 要避免长期与强酸和强碱接触，否则，酰胺基将迅 速发生分解（高温条件）。
缺点： 对芳香族的、酸性和碱性的化合物稍有吸 附现象，使用离子强度略高的洗脱液操 作可以克服。
相对分子质量较小的物质由于直径小于凝胶网 孔，可完全渗透进入凝胶颗粒的网孔，在向下 移动过程中，因此流程较长，移动速率慢，所 以最后流出。
中等大小的分子，它们在凝胶颗粒内外部分渗 透，渗透的程度取决于它们分子的大小，所以 它们流出的时间介于二者之间，这样分子大的 组分先流出，分子小的组分后流出。
琼脂糖凝胶在干燥状态下易破裂，一般存放在 含防腐剂的水溶液中，避免剧烈的搅动。
CL型交联琼脂糖：Sepharose 与1, 3-二溴异丙醇 （1, 3-dibromopropanol）在强碱性条件生成的。 优点： 其筛孔与同浓度的、未交联的琼脂糖相同，热 稳定性与化学稳定性好 可在广范围的pH溶液（pH3-14）中使用，用较 强的碱溶液短时间处理，性能不会改变。 缺点：在氧化剂存在下，会有少量的多糖链发生 解聚。
凝胶过滤层析实验报告
一、实验目的1. 了解凝胶过滤层析的原理及操作步骤。
2. 掌握利用凝胶过滤层析法分离混合物中不同分子量蛋白质的方法。
3. 通过实验验证凝胶过滤层析法在蛋白质分离中的应用。
二、实验原理凝胶过滤层析法，又称分子筛层析法或凝胶过滤法，是一种根据分子大小进行分离的层析技术。
该技术利用凝胶的分子筛特性，将混合物中的不同分子量的物质分离。
凝胶是一种具有多孔结构的物质，孔径大小不一，当混合物通过凝胶层析柱时，大分子物质由于无法进入凝胶孔径，将直接通过层析柱；而小分子物质则可以进入凝胶孔径，从而在层析柱中停留较长时间，实现分离。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 蛋白质混合物（含有已知分子量的标准蛋白质和未知分子量的蛋白质）- 凝胶层析柱（Sephadex G-75）- 洗脱液（磷酸盐缓冲液，pH 7.4）- 标准蛋白质（如牛血清白蛋白、卵清蛋白等）- 未知蛋白质样品2. 实验仪器：- 凝胶层析柱架- 凝胶层析柱- 量筒- 离心机- 分光光度计四、实验步骤1. 准备凝胶层析柱：将凝胶层析柱垂直放置于凝胶层析柱架上，用洗脱液平衡凝胶层析柱，直至洗脱液颜色清澈。
2. 加样：取一定量的蛋白质混合物，加入凝胶层析柱的顶部，用洗脱液冲洗，直至混合物完全进入层析柱。
3. 洗脱：用洗脱液缓慢冲洗层析柱，收集各部分洗脱液，分别测定其蛋白质含量。
4. 分离：根据洗脱液的蛋白质含量，绘制洗脱曲线，分析不同分子量蛋白质的分离情况。
5. 结果分析：根据标准蛋白质的分子量和洗脱曲线，推测未知蛋白质样品的分子量。
五、实验结果与分析1. 凝胶过滤层析柱平衡后，洗脱液颜色清澈，说明凝胶层析柱已准备就绪。
2. 洗脱过程中，标准蛋白质和未知蛋白质样品的洗脱曲线如下：- 标准蛋白质洗脱曲线：在洗脱曲线中，标准蛋白质的洗脱峰呈对称状，峰面积较大，说明分离效果较好。
- 未知蛋白质样品洗脱曲线：在洗脱曲线中，未知蛋白质样品的洗脱峰位置与标准蛋白质的洗脱峰位置不同，峰面积较小，说明分离效果较差。
生物工程中的分离纯化技术
生物工程中的分离纯化技术生物工程是一门涉及生命科学、工程科学和计算机科学等多个领域的交叉学科，其中的分离纯化技术是生物工程中最为基础和关键的环节之一。
分离纯化技术是指将混合物中的某种物质隔离出来并经过一系列的处理，得到单一的、纯度高的、特殊的产品的技术过程。
在生物工程中，分离纯化技术被广泛应用于蛋白质、酶、细胞、病毒等的分离纯化、检测测定和生产加工等方面。
1. 蛋白质的分离纯化蛋白质是生物体内一种重要的大分子有机物质，具有结构多样性、功能多样性和应用广泛性的特点，因此成为生物工程领域中一个重要的研究方向。
在蛋白质的分离纯化过程中，分子筛层析、离子交换层析、凝胶过滤层析和疏水相互作用层析等技术均可有效实现蛋白质的分离纯化。
其中，分子筛层析是指通过分子筛的孔径大小将目标蛋白质与其他杂质分子分离开来的方法。
分子筛层析技术是一种广泛应用于生物工程中的“粗制滥造”方法，具有快速、简便、高效的特点，但相应地，纯度较低。
而离子交换层析是通过分别对离子与蛋白质的吸附作用来分离不同的离子组分，具有较高的特异性和纯度，但需要更细致的操作。
2. 酶的分离纯化酶是生物体内一种重要的催化剂，具有结构多样性、反应特异性和活性高效性的特点，广泛应用于医药、农业、食品和化妆品等领域。
在酶的分离纯化过程中，离子交换层析、亲和层析和凝胶过滤层析等技术均可有效实现酶的分离纯化。
其中，亲和层析是通过将目标酶与某些特定的固定化分子结合在一起，使目标酶在混合物中优先吸附到亲和基质上，最终达到分离纯化的目的。
凭借亲和层析技术，可实现酶的高效、高特异性的分离纯化，但亲和基质的选择和对酶的影响需要精细操作。
3. 细胞的分离纯化细胞是生命离不开的基本单位，它们在物质代谢、能量交换、生长发育和免疫防御等方面发挥着重要的作用。
在细胞的分离纯化过程中，差速离心、密度梯度离心和磁珠分离技术等均可有效实现细胞的分离纯化。
其中，磁珠分离技术是通过将特定的磁性珠子与多价抗体等结合起来，利用磁性珠子对靶细胞或细胞分子的快速分离与扩增。
生化凝胶层析实验报告
一、实验目的本实验旨在通过凝胶层析技术，对混合物中的不同分子量物质进行分离和纯化。
具体目标包括：1. 掌握凝胶层析的原理和操作步骤。
2. 学习如何根据分子量差异对蛋白质等生物大分子进行分离。
3. 观察和分析实验结果，验证凝胶层析技术的有效性和可行性。
二、实验原理凝胶层析（Gel Filtration）又称分子筛层析，是一种基于分子量差异进行物质分离的方法。
该技术利用凝胶作为固定相，凝胶具有多孔结构，分子量不同的物质在凝胶中的移动速度不同，从而实现分离。
实验中常用的凝胶材料包括葡聚糖凝胶（Sephadex）和琼脂糖凝胶（Sepharose）。
凝胶颗粒的大小可通过调节葡聚糖和交联剂的比例来控制。
交联度越大，网孔结构越紧密；交联度越小，网孔结构就越疏松。
因此，不同型号的凝胶具有不同的分子量分级范围。
实验过程中，将待分离物质加入凝胶柱中，在溶剂的作用下，各组分因分子量差异在凝胶柱中以不同的速度移动。
分子量大的物质在凝胶柱中的移动速度较慢，先流出柱子；而分子量小的物质则可以进入凝胶颗粒的网孔内，移动速度较快，后流出柱子。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 待分离的混合物- 葡聚糖凝胶（Sephadex G-100）- 洗脱液（例如磷酸盐缓冲液）- 标准蛋白质溶液（例如牛血清白蛋白、肌红蛋白等）- 紫外分光光度计- 凝胶层析柱- 量筒- 移液器- 离心机2. 实验仪器：- 凝胶层析柱- 紫外分光光度计- 移液器- 量筒- 离心机四、实验步骤1. 准备凝胶柱：将葡聚糖凝胶（Sephadex G-100）用洗脱液充分溶胀，装入凝胶层析柱中。
2. 准备样品：将待分离的混合物用洗脱液稀释，调整蛋白质浓度至适当水平。
3. 加样：将样品加入凝胶柱中，待样品完全进入凝胶柱后，用洗脱液冲洗柱子，直至流出液为无色。
4. 收集洗脱液：用紫外分光光度计检测洗脱液中的蛋白质浓度，收集不同分子量范围的蛋白质组分。
5. 分析结果：将收集到的蛋白质组分进行SDS-PAGE电泳或Western blot分析，观察蛋白质的分子量和纯度。
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分子筛层析
分子筛层析又称为凝胶层析或凝胶过滤。具有分子筛作用的物质很多，如浮石、琼脂、琼
脂糖、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、葡聚糖凝胶等。以葡聚糖凝胶应用最广，商品名是sephadex型
号很多，从G10到G200，它的主要应用范围是：①分级分离各种抗原与抗体；②去掉复合物
中的小分子物质。如除盐、荧光素和游离的放射性同位素以及水解的蛋白质碎片；③分析血清
中的免疫复合物；④分子量的测定。
（一）原理
凝胶是一种多孔性的不带表面电荷的物质，当带有多种成分的样品溶液在凝胶内运动时，
由于它们的分子量不同而表现出速度的快慢，在缓冲液洗脱时，分子量大的物质不能进入凝胶
孔内，而在凝胶间几乎是垂直的向下运动，而分子量小的物质则进入凝胶孔内进行“绕道”运
行，这样就可以按分子量的大小，先后流出凝胶柱，达到分离的目的。
（二）葡聚糖凝胶的种类与性能
葡聚糖又名右旋糖酐，在它们的长链间以三氯环氧丙烷交联剂交联而成。葡聚糖凝胶具有
很强的吸水性，交联度大，吸水性小，相反交联度小，吸水性大。商品名以SephadexG表示，
G值越小，交联度越大，吸水性越小，G值越大，交联度越小，吸水性就越大，二者呈反比关
系，G值大约为吸水量的10倍。由此可以根据床体积而估算出葡聚糖凝胶干粉的用量。
表1－8 Sephadex1的种类与特性
G25、G50有四种颗粒型号：粗（100µ~300µ）、中（50µ~150µ）、细
（20µ~80µ）和超细（10µ~40µ）。G75～G200又有两种颗粒型号：中
（40µ～120µ），超细（10µ～40µ）。颗粒越细，流速越慢，分离效果
越好。
表1－9 DEAE－纤维素与Sephadex1比较
三）试验方法
1．凝胶的选择 根据层析物质分子量的大小选择不同型号的凝胶，如除盐和除游离的荧光素，
则可选用粗、中粒度的G28或G500，G250多用于分离蛋白质单体，G200多用于分离蛋白质凝
胶聚合体等。
2．凝胶的预处理 称取适量的凝胶加入过量的缓冲液在冰箱（或室温）中充分膨胀，或在沸水
中煮，膨胀时间应根据不同型号的凝胶而定（）。
为使粒子均匀一致需进行浮选，即加入凝胶粒子后，轻轻搅拌，静置20min，倾去沉淀的粒子，
如此反复数次即可。
3．装柱 层析柱的选择一般根据分离样品的种类和样品的数量而定。纯化蛋白质时，柱床体积
应为样品体积的25～100倍。去盐、游离荧光素约为样品体积的4～10倍。柱太短，影响分离
效果。柱长一些，分离效果好，但柱太长，则延长分离时间，样品也稀释过度。层析柱的内径
也要选择适当。内径过细，会发生“器壁效应”，即靠近管壁的流速要大于中心的流速影响分离
效果。所以层析柱的内径和高度应有一定的比例。对于除盐来说应为1︰5～1︰25；对于纯化
蛋白质来说应为1︰20～1︰100。
装柱过程基本同离子交换层析柱。
4．加样与洗脱 样品体积不宜过多，最好为床体积的1％～5%，最多不要超过10%。样品浓
度也不宜过大，浓度过大粘度大，分离效果差，一般不超过4%。
洗脱液应与膨胀一致，否则更换溶剂，凝胶体积会发生变化，影响分离效果。洗脱液要有
一定的离子强度和pH值。分离血清蛋白常用0.02～0.1Mol/L pH 6.9~8.0的PBS液（0.14Mol/L
NaCl）和0.1Mol/L pH8.0Tris-HCl缓冲盐溶液（0.14Mol/L NaCl）。
5．洗脱液收集 同离子交换层析。
6．凝胶柱的重复使用与保存 当样品的各组分全部洗脱下来之后，即可加入新的样品，继续使
用。保存方法有三种：
⑴ 在液相中保存最方便，即于凝胶悬液中加入防腐剂（一般为0.02%N2N3或0.002%洗必泰）
或高压灭菌后4℃保存。此法至少可以保存半年以上。
⑵ 用完后，以水冲洗，然后用60%~70%酒精液冲洗，凝胶体积缩小，即在半收缩状态下保存。
⑶ 长期不用者，最好以干燥状态保存，即水洗净后，用含乙醇的水洗，逐渐加大乙醇用量，最
后用95%的乙醇洗，可全部去水，再用乙烯去除乙醇，抽滤干，于60℃~80℃干燥后保存。