琼脂糖凝胶的制备(知识资料)
琼脂糖凝胶电泳流程
琼脂糖凝胶电泳流程
琼脂糖凝胶电泳是一种用于分离和分析DNA、RNA 或蛋白质等生物大分子的技术。
以下是一般的琼脂糖凝胶电泳流程：
1. 准备电泳缓冲液：根据需要选择适当的电泳缓冲液，如TAE （Tris-乙酸-EDTA）或TBE（Tris-硼酸-EDTA）缓冲液。
缓冲液用于维持电泳过程中的酸碱平衡和离子浓度。
2. 制备琼脂糖凝胶：将琼脂糖粉末加入电泳缓冲液中，按照一定的比例加热溶解，制备琼脂糖凝胶。
通常根据需要选择不同浓度的琼脂糖凝胶，如0.8%、1%或1.2%等。
3. 制备样本：将待分析的DNA、RNA 或蛋白质样本与适量的电泳缓冲液混合，使其溶解或悬浮。
4. 加载样本：将样本小心地加载到琼脂糖凝胶的孔中，可以使用移液器或微量注射器。
加载时要避免产生气泡。
5. 电泳：将加载好样本的琼脂糖凝胶放入电泳槽中，连接电源，进行电泳。
根据样本的性质和目的，选择适当的电泳条件，如电压、电流和电泳时间。
6. 观察和记录：电泳过程中，DNA、RNA 或蛋白质样本会根据其大小和电荷性质在凝胶中移动。
可以通过染色或荧光染料来观察和记录样本的迁移情况。
7. 分析结果：根据样本在凝胶中的迁移距离和位置，可以判断样本的大小、纯度和数量等信息。
还可以通过凝胶成像系统对电泳结果进行拍照或分析。
具体的琼脂糖凝胶电泳流程可能会根据实验目的和样本类型有所不同。
在进行实验前，建议仔细阅读相关的实验手册和操作指南，并根据实际情况进行适当的调整和优化。
DNA凝胶制备及点样操作流程
制胶（2%琼脂糖凝胶）操作流程：物品准备：琼脂糖，0.5×TBE，制胶板，三角烧瓶，加样器，量筒。
1.当制胶板完全干燥时，在开口的两边贴好透明胶封口。
如制胶板刚洗干净，需使用干净纱布将水擦干，再放置15分钟以上，等完全干燥后再贴透明胶。
2.称取7g琼脂糖粉（agarose），加入锥形瓶中。
3.在锥形瓶中加350 ml 0.5×TBE 电泳缓冲液。
4.将锥形瓶放入微波炉中加热至白色颗粒完全溶解，呈透明状。
（先开中高火4min，再根据情况加热到沸腾，约要反复沸腾3-4次）（一定要完全溶解至完全透明！！）5.将锥形瓶取出（勿烫伤），稍降温，加入20-25μl Glodview，轻轻摇匀，静置至无大量气泡（推荐加入20 μl Glodview）。
6.将锥形瓶内液体缓慢倒入槽内，避免产生气泡，观察是否漏胶，等无大量水蒸汽时，上好梳子。
7.待凝胶凝固后（大约30min），将梳子拔出，（取梳子时一定要两边用力平衡，动作要轻）。
8.使用手术刀片将凝胶切割成条状，将暂时不用的胶块用保鲜膜包好存放。
如存放时间可能超过1星期，可适当在保鲜膜里面加一点水。
9.使用自来水小心、完全地清洗制胶板，然后竖直放于实验台上晾干。
点样：1.先将电泳槽两端的电泳液充分混匀。
当电泳缓冲液由于蒸发减少时，加去离子水补齐，然后再混匀。
2.当电泳液使用一星期或者较多次数时，请将电泳液倒掉，使用自来水及洗洁精仔细清洗电泳槽。
注意不能使用硬物洗涤，最好只使用流水将污染物洗掉。
3.将制好的凝胶胶放入电泳槽内，使其完全浸入电泳缓冲液中。
4.打开PCR样品盖，每个样品管中加入5 μl 6＊Loading Buffer。
5.用排枪吹打样品2-3次，使其与loading buffer充分混合，小心吸出，点到相应的孔中，对应好孔号与样品号，在留出的孔中点上Marker 5ul。
点样时，小心的左右移动点样枪头，使样品均匀的铺在整个点样孔底。
琼脂糖凝胶电泳常考操作流程
琼脂糖凝胶电泳常考操作流程
准备工具：用蒸馏水将制胶工具洗干净，准备好制胶平板，用琼脂将模具边缘封闭，架好梳子。
配制琼脂糖凝胶：根据要分离的样品（DNA）大小配制合适浓度的琼脂糖凝胶。
将一定量的琼脂糖干粉加入到合适体积的锥形瓶中，加入一定量的电泳缓冲液（30ml左右TAE）。
融化琼脂糖：将琼脂糖放入到微波炉内加热融化，冷却片刻（不烫手即可）。
浇灌凝胶：融化后的琼脂溶液摇晃混匀，倒入电泳槽中，等其凝固。
凝固凝胶：室温下凝固30-40min左右，小心的拔出梳子，取出凝固好的凝胶放入电泳槽内，准备上样。
加入电泳缓冲液：在电泳槽中倒入电泳缓冲液（TAE）；没过胶面1mm左右，去除胶孔内的气泡。
上样：将DNA样品和对应体积的上样缓冲液（loading buffer）和染料混合，用抢混匀后加入到凝胶孔内。
电泳：上样结束，接通电源，红色正极，黑色负极，DNA样品有负极往正极运动，加样孔侧为负，，40-50v电压，电压30敏左右即可（<40min）。
观察结果：电压结束，关闭电源，凝胶成像仪上观察电压位置并比对marker 判断大小。
琼脂糖凝胶电泳 配方与步骤
�RNA琼脂糖凝胶电泳：配制：1.0.5M EDTA（pH=8.0）：100ml：称取18.61g Na2EDTA·2H2O（分子量372.24），加80ml ddH2O剧烈搅拌，用NaOH调节PH值至8.0（约需2g NaOH）.高压灭菌，室温保存。
2.50×TAE loading buffer:（Tris acetate-EDTA buffer）电泳缓冲液组分：2M Tris-乙酸；100mM EDTA（pH=8.0）500mL:称121.1g Trisbase（分子量121.14），加800ml ddH2O溶解，加57.1ml乙酸和50ml0.5M EDTA溶液（pH=8.0），搅拌，ddH2O定容至500mL.室温保存。
3.1×TAE loading buffer:取20ml50×TAE，ddH2O定容至1L.室温保存。
4.100×Sybergreen：500ul：取495ul1×TAE于1.5ml离心管，加入5ul Sybergreen原液混匀，4℃锡纸避光保存。
注意：Sybergreen原液需稀释10000倍；6×DNA loading buffer上样缓冲液需稀释六倍，最终稀释倍数应不小于1×。
步骤：1.制备1%琼脂糖凝胶(大胶用70ml,小胶用50ml，我们用30ml):称0.3g琼脂糖置于100ml锥形瓶中，加入30ml1×TAE，瓶口倒扣小烧杯。
微波炉加热煮沸3次，至琼脂糖全部融化，摇匀，即成1.0%琼脂糖凝胶液。
2.胶板制备:取电泳槽内的有机玻璃内槽(制胶槽)洗干净,晾干,放入制胶玻璃板.取透明胶带将玻璃板与内槽两端边缘封好,形成模子.将内槽置于水平位置,并放好梳子.将冷却到65℃左右的琼脂糖凝胶液混匀小心地倒入内槽玻璃板上,使胶液缓慢展开,直到整个玻璃板表面形成均匀胶层.室温下静置直至凝胶完全凝固,垂直轻拔梳子,取下胶带,将凝胶及内槽放入电泳槽中.添加1×TAE电泳缓冲液至没过胶板为止.3.加样:样品制备：（10ul体系/样品槽）于0.25ml离心管中样品RNA（最后加）:2ul/3ul/5ul6×DNA loading buffer:10/6=1.7ul100×Sybergreen：0.1ulDEPC水：至10ul(注意:加样前要先记下加样的顺序).分别将样品加入胶板的样品小槽内,每加完一个样品,应更换一个枪头,以防污染,加样时勿碰坏样品孔周围的凝胶面.4.电泳:加样后的凝胶板立即通电进行电泳,电压60-100V,样品由负极(黑色)向正极(红色)方向移动.电压升高,琼脂糖凝胶的有效分离范围降低.当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约1cm处时,停止电泳.5.电泳完毕后,取出凝胶,利用科212凝胶成像系统,在紫外灯（trans UV）下观察拍照保存.DNA存在则显示出红色荧光条带.RNA完美提出应该是三条带：28，18,5.8。
琼脂糖凝胶配胶过程
琼脂糖凝胶配胶过程琼脂糖凝胶是一种常用的生物分离技术，广泛应用于生物化学、分子生物学等领域。
琼脂糖凝胶配胶是制备琼脂糖凝胶的重要步骤，下面将详细介绍琼脂糖凝胶配胶的过程。
一、准备琼脂糖溶液1. 将适量的琼脂糖粉末加入无菌蒸馏水中，搅拌均匀直至溶解，可以加热加快溶解速度。
2. 将琼脂糖溶液倒入培养皿中，使其均匀地铺满整个培养皿表面。
3. 将培养皿放置在水平台上，静置一段时间，待琼脂糖溶液凝固成胶状。
二、调整琼脂糖凝胶的浓度和pH值1. 测量琼脂糖溶液的质量浓度，根据实验要求和经验选择合适的浓度。
2. 使用pH计测量琼脂糖溶液的pH值，根据实验要求和经验调整pH值。
三、添加缓冲液和其他添加剂1. 根据实验要求，在琼脂糖溶液中加入适量的缓冲液，调节溶液的酸碱度，使其适应实验条件。
2. 根据实验要求，在琼脂糖溶液中加入其他需要的添加剂，如离子缓冲剂、蛋白酶抑制剂等，以提供适宜的实验环境。
四、消除气泡和异物1. 将琼脂糖溶液放置在振荡器上振荡一段时间，以消除其中的气泡。
2. 检查琼脂糖溶液中是否有杂质或异物，如有需要将其去除。
五、灭菌处理1. 使用无菌滤器将琼脂糖溶液过滤，以去除其中的微生物。
2. 将过滤后的琼脂糖溶液分装至无菌培养皿中，密封好。
六、冷却和凝胶1. 将分装好的琼脂糖溶液置于冰箱中冷却，待其凝胶完全固化。
2. 凝胶过程中要避免震动和晃动，以免产生不均匀的凝胶。
七、储存和保存1. 将凝胶存放在冰箱中保存，避免阳光直射和高温环境。
2. 凝胶的保存时间一般不宜过长，最好在使用3个月内。
总结：琼脂糖凝胶配胶是制备琼脂糖凝胶的重要步骤，包括准备琼脂糖溶液、调整浓度和pH值、添加缓冲液和其他添加剂、消除气泡和异物、灭菌处理、冷却和凝胶以及储存和保存等过程。
准确掌握配胶过程对于获得高质量的琼脂糖凝胶至关重要，希望本文的介绍能对读者有所帮助。
RNA的琼脂糖凝胶电泳(含甲醛)
RNA的琼脂糖凝胶电泳（含甲醛）
一、配制5倍MOPS缓冲液：
1、称取2.06gMOPS倒入灭菌的烧杯中，加入少量灭菌的DEPC水溶解。
2、加入三水合醋酸钠固体0.54g。
3、加入EDTANa2固体0.146g。
4、用灭菌的DEPC水定容至100mL。
注意：
MOPS缓冲液不能见光或高压灭菌。
二、制琼脂糖凝胶：
1、称取约0.2g琼脂糖粉转移到烧杯中。
2、加入12.6mLDEPC水溶解。
3、加入4mL的5倍缓冲液。
4、在微波炉上加热2分钟，使琼脂糖溶解。
5、稍冷后加入3.4mL甲醛。
6、加入2ul的核酸染液，摇匀。
7、将梳子插入胶槽中，再缓慢将胶液倒入胶槽中，以防产生气泡，在4度冰箱冷却30
分钟左右，封存保存。
注意：
1、整个操作过程要迅速，防止琼脂糖很快凝固。
2、由于甲醛有毒，操作空间保持通风。
3、倒胶时连续缓慢，有气泡时先用刀片扎破，赶到板的边缘。
4、倒胶结束后，停止通风。
三、电泳：
1、用DEPC水润洗电泳槽。
2、将5倍缓冲液稀释成0.5倍缓冲液，倒入电泳槽中。
3、将胶放入电泳槽，开电源，测试电压（115V）。
4、吸取3微升的RNA液，点样。
5、开始电泳。
（20-30min)
6、电泳结束，取出凝胶，放在凝胶电泳成像扫描仪中观察RNA条带，并记录现象。
琼脂糖凝胶的配制
琼脂糖凝胶的配制
⑴琼脂糖凝胶的制备：称取0.3g琼脂糖，置于三角瓶中，加入30ml TBE或TAE缓液，置于三角瓶中，加入30ml TBE或TAE缓液，置于三角瓶中，加入30ml TBE或TAE缓液，将该三角瓶置于微波炉加热至琼脂糖溶解。
将冷却至65℃左右的琼脂糖凝胶液，加入溴化乙锭，充分混匀。
⑵胶板的制备：
①取有机玻璃内槽，洗净、晾干；
②将有机玻璃内槽置于一水平位置模具上，安好挡板，放好梳子。
吸取少量琼脂糖溶液封固胶膜边缘，任其凝固，在距离底板0.5～1.0mm的位置上放置梳子，以便加入琼脂糖后可以形成完好的加样孔。
如果梳子距离玻璃板再近，则拔出梳子时孔底将有破裂的危险，破裂后将使样品在凝胶与玻璃板之间渗漏。
③将剩余的温热琼脂糖溶液倒入胶膜中，使胶液缓慢地展开，直到在整个有机玻璃板表面形成均匀的胶层。
凝胶的厚度在3～5mm之间，检查一下梳子的齿下或齿间是否有气泡。
④室温下静置30min左右，待凝固完全后，轻轻拔出梳子，在胶板上即形成相互隔开的上样孔。
制好胶后将铺胶的有机玻璃内槽放在含有0.5～1×TAE（Tris-乙酸）或TBE（Tris-硼酸）工作液的电泳槽中使用，没过胶面1mm以上。
琼脂糖凝胶
琼脂糖凝胶什么是琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶是一种由琼脂素制成的凝胶状物质，具有较好的凝胶性能。
它是一种常见的实验室试剂，广泛用于分离、纯化和分析生物大分子如蛋白质、核酸和多糖等。
琼脂糖凝胶的制备方法材料•琼脂素（Agarose）•缓冲溶液步骤1.准备含有适量琼脂素的缓冲溶液，通常使用Tris缓冲溶液或磷酸盐缓冲溶液。
2.将缓冲溶液中的琼脂素加热至溶解，可以使用烧杯和加热板完成这一步骤。
3.琼脂素完全溶解后，将溶液倒入矩形或圆形的琼脂糖凝胶模具中。
4.等待琼脂糖凝胶冷却和凝胶化。
凝胶的结构可以通过调整琼脂素的浓度和凝胶化温度来进行控制，常见的琼脂糖凝胶浓度为0.5%-2.0%。
琼脂糖凝胶的应用琼脂糖凝胶在生物科学领域有广泛的应用，主要包括以下几个方面：1. 蛋白质凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳是一种常见的蛋白质分离技术。
凝胶中的孔隙结构可以根据蛋白质分子的大小、形状和电荷特性，实现对蛋白质的分离和纯化。
通过电泳电场的作用，蛋白质分子会迁移至电泳胶中，形成一系列条带，可以根据条带的位置和宽度来判断样品中蛋白质的相对含量和纯度。
2. 核酸凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳也被广泛应用于核酸分析和分离。
琼脂糖凝胶可以在电场中对核酸进行分子大小分离，并可通过DNA染料或放射性标记物对核酸进行可视化。
这种技术可以用于DNA片段的分离、纯化和定量分析，也可以用于RNA的分离和检测等。
3. 蛋白-核酸相互作用研究琼脂糖凝胶亦可用于研究蛋白与核酸之间的相互作用。
通过在琼脂糖凝胶中添加核酸和蛋白质样品，可以观察它们之间的相互作用。
这种方法可以用于研究蛋白与DNA或RNA之间的结合，还可以用于筛选与特定核酸序列结合的蛋白。
4. 免疫固定电泳琼脂糖凝胶亦可用于免疫固定电泳，用于研究蛋白质的抗原性质。
在这种方法中，将抗原与琼脂糖凝胶混合，使其固定在凝胶孔隙中，然后通过电泳将抗原从凝胶中迁移出来。
迁移过程中，抗原与抗体之间的特异性结合会引起凝胶中条带的出现，可以用于确定蛋白质的抗原性质。
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琼脂糖凝胶的制备
一、琼脂糖凝胶的特点
天然琼脂（agar）是一种多聚糖，主要由琼脂糖（agarose，约占80％）及琼脂胶（agaropectin）组成。
琼脂糖是由半乳糖及其衍生物构成的中性物质，不带电荷，而琼脂胶是一种含硫酸根和羧基的强酸性多糖，由于这些基团带有电荷，在电场作用下能产生较强的电渗现象，加之硫酸根可与某些蛋白质作用而影响电泳速度及分离效果。
因此，目前多用琼脂糖为电泳支持物进行平板电泳，其优点如下。
1. 琼脂糖凝胶电泳操作简单，电泳速度快，样品不需事先处理就可以进行电泳。
2. 琼脂糖凝胶结构均匀，含水量大（约占98％~99％），近似自由电泳，样品扩散较自由电流，对样品吸附极微，因此电泳图谱清晰，分辨率高，重复性好。
3. 琼脂糖透明无紫外吸收，电泳过程和结果可直接用紫外光灯检测及定量测定。
4. 电泳后区带易染色，样品极易洗脱，便于定量测定。
制成干膜可长期保存。
目前，常用琼脂糖作为电泳支持物，分离蛋白质和同工酶。
将琼脂糖电泳与免疫化学相结合，发展成免疫电泳技术，能鉴别其他方法不能鉴别的复杂体系，由于建立了超微量技术，0.1ug 蛋白质就可检出。
琼脂糖凝胶电泳也常用于分离、鉴定核酸，如DNA鉴定，DNA限制性内切核酸酶图谱制作等。
由于这种方法操作方便，设备简单，需样品量少，分辨能力高，已成为基因工程研究中常用实验方法之一。
二、DNA的琼脂糖凝胶电泳
琼脂糖凝胶电泳对核酸的分离作用主要是依据它们的相对分子量质量及分子构型，同时与凝胶的浓度也有密切关系。
1、核酸分子大小与琼脂糖浓度的关系
① DNA分子的大小在凝胶中，DNA片段迁移距离（迁移率）与碱基对的对数成反比，因此通过已知大小的标准物移动的距离与未知片段的移动距离时行比较，便可测出未知片段的大小。
但是当DNA分子大小超过20kb时，普通琼脂糖凝胶就很难将它们分开。
此时电泳的迁移率不再依赖于分子大小，因此，就用琼脂糖凝胶电泳分离DNA时，分子大小不宜超过此值。
②琼脂脂糖的浓度如下表所示，不同大小的DNA需要用不同浓度的琼脂糖凝胶进行电泳分离。
表琼脂糖浓度与DNA分离范围
琼脂糖浓度
0.3 0.6 0.7 0.9 1.2 1.5 2.0
/％
线状DNA大小/kb 60－
5
20－
1
10－
0.8
7－
0.5
6－
0.4
4－
0.2
3－
0.1
2、核酸构型与琼脂糖凝胶电泳分离的关系
不同构型DNA的移动速度次序为：供价闭环DNA（covalently closed circular，cccDNA）>直线DNA>开环的双链环状DNA。
当琼脂糖浓度太高时，环状DNA（一般为球形）不能进入胶中，相对迁移率为0（Rm=0），而同等大小的直线双链DNA（刚性棒状）则可以长轴方向前进（Rm>0），由此可见，这三种构型的相对迁移率主要取决于凝胶浓度，但同时，也受到电流强度、缓冲液离子强度等的影响。
3、电泳方法
①凝胶类型
用于分离核酸的琼脂糖凝胶电泳可分为垂直型及水平型（平板型）。
水平型电泳时，凝胶板完全浸泡在电极缓冲液下1-2mm，故又称为潜水式。
目前更多用的是后者，因为它制胶和加样比较方便，电泳槽简单，易于制作，又可以根据需要制备不同规格的凝胶板，节约凝胶，因而较受欢迎。
②缓冲液系统
缺少离子时，电流太小，DNA迁移慢；相反，高离子强度的缓冲液由于电流太大会大量产热，严重时，会造成胶熔化和DNA的变性。
常用的电泳缓冲液有EDTA（pH8.0）和Tris-乙酸（TEA），Tris-硼酸（TBE）或Tris-磷酸（TPE）等，浓度约为50mmol/L(pH7.5~7.8)。
电泳缓冲液一般都配制成浓的贮备液，临用时稀释到所需倍数。
TAE缓冲能力较低，后两者有足够高的缓冲能力，因此更常用。
TBE浓溶液长期贮存会出现沉淀，为避免此缺点，室温下贮存5×溶液，用时稀释10倍0.5×工作溶液即能提供足够缓冲能力。
③凝胶的制备
以稀释的电极缓冲液为溶剂，用沸水浴或微波炉配制一定浓度的溶胶，灌入水平胶框或垂直胶膜，插入梳子，自然冷却。
④样品配制与加样
DNA样品用适量Tris-EDTA缓冲液溶解，缓冲液内含有0.25％溴酚蓝或其他指示染料，含有10％-15％蔗糖或5％~10％甘油，以增加其比重，使样品集中。
为避免蔗糖或甘油可能使电泳结果产生U形条带，可改用2.5％Ficoll（聚蔗糖）代替蔗糖或甘油。
⑤电泳
琼脂糖凝胶分离大分子DNA实验条件的研究结果表明，在低浓度、低电压下，分离效果较好。
在低电压条件下，线性DNA分子的电泳迁移率与所用的电压呈正比。
但是，在电场强度增加时，较大的DNA片段迁移率的增加相对较小。
因此随着电压的增高，电泳分辨率反而下降，为了获得电泳分离DNA片段的最大分辨率，电场强度不宜高于5V/cm。
电泳系统的温度对于DNA在琼脂糖凝胶中的电泳行为没有显著的影响。
通常在室温下进行电泳，只有当凝胶浓度低于0.5％时，为增加凝胶硬度，可在4℃进行电泳。
⑥染色和拍照
常用荧光染料溴乙锭（EB）染色，在紫外光下观察DNA条带，用紫外分析仪拍照，或用凝胶成像系统输出照片，并进行有关的数据分析。